2.1  两组HER2蛋白镜下形态学结果比较  生物显微镜下两组HER2蛋白表达均为特异性的细胞膜着色，配对的对照实验中，HER2蛋白从阴性(0/1+)、不确定性(2+)到阳性(3+)，着色的癌细胞的比例及染色强度相同，见图1。

2.2  两组HER2蛋白检测结果比较  对照组和实验组HER2蛋白阳性(3+)均为75例(18.66%)，不确定性(2+)分别为131例(32.59%)及128例(31.84%)，阴性(0/1+)分别为196例(48.75%)及199例(49.50%)，两组HER2蛋白阳性率、不确定性率、阴性率之间的比较差异无显著性意义(P > 0.05)；两组HER2蛋白符合率为(74+128+196)/402= 99.00%，其95%CI为0.97-1.00，见表1。

2.3  两组HER2基因镜下形态学结果比较  荧光显微镜下两组HER2基因荧光原位杂交镜检显示：①背景：原位杂交区域内未出现荧光粒子，背景呈现出清晰、洁净的状态；②信号强度：能明确区分HER2及Ch17的信号点；③交差反应：HER2及Ch17 的探针在17号染色体特定的区域内结合，未发现有交差反应；④特异性：HER2及Ch17 的探针信号仅存在于标本染色区域内的光点，并非原位杂交中其他的染色体、细胞核和细胞膜等，见图2。

2.4  两组HER2基因杂交结果的比较  每例浸润性乳腺癌

观察3-5个浸润癌区域，共计数细胞60个。两组的131例乳腺癌组织均杂交成功。对照组杂交成功细胞为(58.65±2.03)个，实验组杂交成功细胞为(58.31±1.89)个，两组杂交成功细胞数量比较差异无显著性意义(t=1.40，P=0.38)。

2.5  两组HER2基因扩增结果比较  两组HER2基因检测共有3例荧光原位杂交结果不一致：即实验组2例HER2基因检测结果为阳性，而对照组2例HER2基因结果为阴性；对照组1例HER2基因检测结果为阳性，实验组1例HER2基因结果为阴性。对照组和实验组HER2基因扩增阳性率分别为23例(17.55%)及24例(18.32%)，阴性率分别为108例(82.45%)及107例(81.68%)，两组HER2基因扩增阳性率、阴性率之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；两组HER2基因扩增符合率为(22+106)/131=97.71%，其95%CI为0.95-1.00，见表2。

2.6  两组HER2基因检测的双探针信号数量及比值比较  两组HER2基因信号均数、HER2/细胞比值均数、Ch17信号均数、Ch17/细胞比值均数、HER2/ Ch17比值均数之间的比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.7  两组HER2总阳性率的比较  结合表1，2，对照组HER2总阳性率(75+23)/402=24.38%，实验组HER2总阳性率(75+24)/402=24.63%，两组HER2总阳性率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

浸润性乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，占全球女性癌症患者的23%^[1]。自20世纪90年代后，乳腺癌X射线早期筛查、放化疗、内分泌治疗及最新的靶向治疗的使用，更是有效提高了患者生存率及生存质量。HER2状态的评估是浸润性乳腺癌治疗及预后重要的生物学指标。HER2蛋白表达和基因扩增状态是乳腺癌靶向治疗所依赖的重要生物学指标。先用免疫组织化学法检测HER2蛋白表达，再根据实际情况使用荧光原位杂交法检测HER2基因扩增，是目前国内大部分病理实验室惯用的做法。固定、脱水、透明和脱蜡等组织前期处理是制作病理石蜡切片后进行HER2蛋白和基因检测的必备程序，也是影响免疫组织化学和荧光原位杂交的重要因素。甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明和脱蜡是传统的组织前期处理方式，但是传统试剂对人及环境的污染是公认的。赵洁等^[2]研究认为环保型试剂套装对组织收缩的影响优于传统试剂，能满足胃内镜下黏膜剥离标本的制作要求。郑波等^[3]研究发现复合型环保试剂联合超声快速处理仪制作切片苏木精-伊红染色效果等同于传统试剂。刘柱新等^[4]研究发现环保脱蜡液制作的苏木精-伊红切片组织细胞染色鲜艳，能满足病理诊断的需求。程凯等^[5]研究认为环保试剂制作的甲状腺穿刺液基细胞块在苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色效果与传统试剂相当。朱卫东^[6]认为新型病理环保试剂套装在脂肪、子宫肌瘤、淋巴结、皮肤组织等病理标本的制片效果稳定可靠，能满足临床诊断的需要。尽管2014版及2019版乳腺癌HER2检测指南对于组织标本的取材前固定用3.7%中性缓冲甲醛液有明确的规定，但是对于取材后组织的处理，如固定、脱水、透明和脱蜡并未有明确的指南。因此实验拟探讨环保型试剂套装与传统试剂制作切片在乳腺癌HER2蛋白表达、基因扩增中的差异，以期进一步优化乳腺癌HER2检测程序具有重要的意义。实验中所用的新型生物组织样本制备套装(环保型固定液、脱水液、透明液、脱蜡液)均无醛、无苯、无汞，经过毒力实验证实对人体及环境无毒、无污染。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2015年1月至2019年3月在汕头市中心医院病理科完成。

1.3  材料  收集2015年1月至2019年3月于汕头市中心医院402例女性患者的浸润性乳腺癌标本，年龄32.6-68.9岁，平均(46.9±3.8)岁。标本离体经病理医师行大体标本检查，对半剖开，迅速使用3.7%中性缓冲甲醛液固定24 h，规范化取材。取材后根据组织标本前期处理试剂的不同，使用随机数字表随机分为对照组和实验组，对照组采用传统试剂甲醛固定-乙醇脱水-二甲苯透明脱蜡进行组织前期处理，制作石蜡切片；实验组采用环保型生物组织样本制备套装制作切片。实验获得汕头市中心医院伦理委员会批准，患者对实验知情同意。

标本组织学类型：浸润性乳腺癌组织学类型依据乳腺肿瘤WHO分类(2012，第四版)标准执行，包括：非特殊类型浸润性乳腺癌、浸润性小叶癌、小管癌、筛状癌、伴髓样特征的癌、化生癌、伴大汗腺分化的癌、黏液表皮样癌、伴神经内分泌特征的癌^[7]。

实验用试剂与设备：二甲苯由西陇科学股份有限公司生产；环保型生物组织样本制备套装(环保型固定液、脱水液、透明液、脱蜡液的产品编号分别为：BLA-01、BLA-02、BLA-03、BLA-07。产品批号分别为：20141125、20150917、20160829、20170603、20180509、20181017)由北京九州柏林生物科技有限公司生产；HER2蛋白一体、二抗购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；HER2基因检测试剂盒(荧光原位杂交法)购自日本株式会社常光上海代表处，为HER2/ Ch17 DNA双信号探针；SAKURA Tissue Tek Vip-^TM脱水机由日本樱花公司生产；Bench Mark XT自动免疫组化染色仪购自美国Ventana公司生产；S500-24荧光原位杂交仪购自美国Thermobrite公司生产。

1.4  实验方法  对照组采用传统试剂甲醛固定-乙醇脱水-二甲苯透明脱蜡进行组织前期处理，制作石蜡切片；实验组采用环保型生物组织样本制备套装(含环保型固定液、脱水液、透明液、脱蜡液)进行组织前期处理，制作石蜡切片。组织样本制备流程参照文献[8]推荐程序进行，制作石蜡切片，苏木精-伊红染色，常规病理诊断，由2位资深病理医师确诊为浸润性乳腺癌后，采用免疫组织化学检测两组浸润性乳腺癌的HER2蛋白表达，进一步对HER2蛋白结果为2+的131例浸润性乳腺癌标本，使用荧光原位杂交法检测HER2基因扩增。

1.4.1  HER2蛋白检测及结果判读 

免疫组织化学检测步骤：脱蜡5 min×3次，抗原修复24 min，HER2蛋白孵育32 min，含HRP、H₂O₂、DAB显色剂、苏木精、氨水的二抗系统孵育、衬染等共34 min，染色过程设置正常乳腺组织为阴性内对照，已证实为HER2蛋白阴性(0/1+)、不确定性(2+)、阳性(3+)的组织切片作为外对照。

HER2蛋白结果判断：参照乳腺癌HER2检测指南(2019版)^[9]：①阳性(3+)：>10%的完整细胞膜呈强而均匀的着色；②不确定性(2+)：分2种情况，其一为>10%的浸润癌完整细胞膜呈弱-中强度着色，其二为≤10%的完整细胞膜呈强着色；③阴性(0/1+)：无着色或<10%的浸润癌细胞膜呈不完整、微弱着色。

1.4.2  HER2基因检测及结果判读

荧光原位杂交检测步骤：组织脱蜡(室温 5min×3次)，乙醇复水(体积分数100%乙醇，2 min×2次；体积分数85%乙醇，2 min×1次；体积分数75%乙醇，2 min×1次)，纯水清洗(2 min×3次)，预处理液浸泡(加热至95-99 ℃的前处理液中浸20 min、室温冷却20 min)，纯水冲洗(2 min×3次)，蛋白酶溶液消化(加热至37 ℃，蛋白酶消化10 min)，纯水冲洗(2 min×3次)，乙醇洗脱(体积分数75%，85%，100%乙醇各1 min)，风干，标本位置加10 µL探针溶液、加盖玻片，用胶水封固，85 ℃变性5 min，杂交过夜(37 ℃，湿润杂交仪杂交过夜)，除胶(用镊子去四周胶水)，清洗缓冲液浸泡(在常温洗涤缓冲液浸泡至载玻片自动脱落)，高温清洗缓冲液浸泡(加热至72 ℃浸2 min)，2×SSC 溶液洗脱(洗脱3 min×2次)，乙醇脱水(体积分数75%，85%，100%乙醇各1 min)，风干，标本位置上加10 µL DAPI 染液，加盖玻片，用指甲油封固，观察荧光。

 HER2基因检测结果判读：参照乳腺癌HER2检测指南(2019版)^[9]：①HER2/Ch17数值≥2.0且HER2/细胞信号均值≥4.0，则判为阳性；②HER2/Ch17数值≥2.0且HER2/细胞信号均值<4.0，则判为阴性；③HER2/Ch17数值<2.0且HER2/细胞信号均值≥6.0，则判为阳性；   ④HER2/Ch17数值<2.0且6.0≥HER2/细胞信号均值≥4.0，结合免疫组织化学结果为3+则判为阳性。反之，若免疫组织化学结果为0、1+、2+则判为阴性；⑤HER2/Ch17数值<2.0且HER2/细胞信号均值<4.0，则判为阴性。

1.5  主要观察指标  两组标本HER2/细胞比值均数、Ch17/细胞比值均数、HER2/Ch17比值均数、HER2基因信号均数、Ch17信号均数。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0软件包完成统计学分析，计数资料的比较采用χ²检验，计量资料的的比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

病理诊断是疾病诊断的金标准。目前病理科医务人员日常工作中接触到大量的甲醛、二甲苯等有毒有害化学试剂，使用后的试剂废液更是严重污染环境，尤其是在通风设备欠佳、污水处理系统缺乏的实验室条件不佳的病理科中表现尤为明显。

正确检测HER2蛋白和基因状态对于乳腺癌的精准治疗及预后判断的临床价值已得到了全球公认。杨文涛教授、步宏教授牵头，众多病理学家组成的研究团队编写了《乳腺癌HER2检测指南(2009版)》《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》《乳腺癌HER2检测指南(2019版)》，对于促进中国的乳腺癌精准治疗及提高患者生存率起到了极其重要的作用。上述3版检测指南对组织样本的制备过程中标本的固定液均有明确的规定，但目前尚缺乏环保型脱水、透明和脱蜡等标本前期处理试剂对HER2蛋白和基因状态检测影响的研究报道。实验通过比对环保型试剂套装与传统试剂制作组织切片在浸润性乳腺癌的HER2蛋白表达、基因扩增中差异，以期对HER2检测的标本制备过程进一步提出相关建议和补充。

环保型组织样本制备套装中的固定液是利用环保型化学试剂对蛋白质的凝固特性，终止或减少水解酶的作用，防止组织和细胞发生自溶，最大程度上保存组织、细胞的活体状态。脱水液是利用环保型有机溶液与水互溶的特点，把组织、细胞中的水分置换出来。透明液是利用环保型有机溶剂与脱水剂、石蜡均能互溶的特性，使石蜡能渗入组织细胞中。脱蜡液是采用环保型有机溶剂与石蜡的“相似相溶”原理对切片的组织、细胞进行脱蜡处理。

从实验形态学检测结果来看，与传统试剂相比较，使用环保型试剂套装不影响生物显微镜下HER2蛋白的免疫组织化学染色结果。为增加实验的严谨性，在两组实验中设置了HER2蛋白从阴性(0/1+)、不确定性(2+)到阳性(3+)的对照实验，发现配对的对照实验着色癌细胞的比例及染色强度相同。此外研究发现，荧光显微镜下HER2基因荧光原位杂交镜检结果也不受影响，说明环保型试剂套装在HER2检测的形态学效果并不差于传统试剂。研究结论与陈志强等^[10-11]利用Van-clear环保透明脱蜡液替代二甲苯制备病理切片，证实环保透明脱蜡液不影响浸润性乳腺癌的HER2蛋白和基因形态学检测结论相一致。陈志强等^[10-11]研究的是单一环保透明脱蜡液对非特殊型浸润性乳腺癌HER2状态的影响。刘柱新等^[4]研究的是环保脱蜡液制作的蜡块对切片组织细胞苏木精-伊红染色的影响。程凯等^[5]报道的是环保试剂制作的甲状腺穿刺液基细胞块在苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色的效果。朱卫东^[6]研究了新型病理环保试剂套装在脂肪、子宫肌瘤、淋巴结、皮肤组织等病理标本的制片效果。而此次实验采用的是环保型试剂套装，且囊括了非特殊型浸润性癌与特殊亚型，组织学类型更为丰富、样本量更大，更能从统计学上客观反映环保试剂套装制备乳腺癌标本HER2流程的可行性。

正确评估浸润性乳腺癌的HER2状态对患者精准治疗和临床预后判断至关重要。此次实验结果显示两组HER2蛋白阳性率、不确定性率、阴性率之间的比较无差异(P > 0.05)，两组之间HER2蛋白符合率为95%，95%CI囊括了1。并且两组HER2基因扩增阳性率、阴性率比较无差异(P > 0.05)，两组间HER2基因扩增符合率为95%，95%CI也囊括了1，表明两组HER2总阳性率比较无差异(P > 0.05)。实验中两组HER2基因扩增阳性率、阴性率及两组HER2总阳性率与张虹等^[12]、许燕等^[13]研究的数据基本一致。

因此，两组HER2蛋白和基因检测结果可为临床的有效性互补，作者认为环保型生物组织样本制备套装可满足临床上对HER2状态的诊断需求，也能满足病理实验室的实验要求。2019版乳腺癌HER2检测指南推荐免疫组织化学与荧光原位杂交相结合的检测策略，特别是对于免疫组织化学2+的病例，应该进一步做荧光原位杂交检测。实验中131例免疫组织化学2+的两组荧光原位杂交杂交实验均成功，并且两组杂交成功细胞数量比较无差异，为后续判读结果作下了良好的基础。有学者认为部分浸润性乳腺癌患者的第17号染色体可能存在HER2基因和着丝粒同时扩增的现象，HER2基因信号数对其状态判断的重要性不亚于HER2/Ch17比值^[14-15]。因此，HER2/细胞比值均数、Ch17/细胞比值均数、HER2/Ch17比值均数、HER2基因信号均数、Ch17信号均数都能影响到HER2基因结果的判读。实验中对两组HER2基因检测的双探针信号数量及比值比较发现，上述5个指标在两组HER2基因检测中均无差异(P > 0.05)。因此，使用保型生物组织样本制备套装不会影响到HER2/细胞比值均数、Ch17/细胞比值均数、HER2/Ch17比值均数、HER2基因信号均数、Ch17信号均数，进而不会影响荧光原位杂交实验结果。

至于实验中有个别浸润性乳腺癌病例HER2蛋白和基因在实验组和与对照组中检测结果不一致，作者认为之所以出现这种现象跟组织处理的试剂无关，因为两组配对的对照实验结果是一致的，很可能与浸润性乳腺癌组织中HER2表达和扩增的异质性相关^[16]。

此外此次实验中严格按照2019版乳腺癌HER2检测指南对标本固定的相关规定，标本离体后迅速使用3.7%中性缓冲甲醛液固定24 h，再根据组织标本前期处理试剂的不同采用了相应的处理试剂。但是能否在标本获取后立刻用环保固定液进行固定？后期的研究将在标本获取后直接使用环保型试剂套装完成整个标本制备过程，观察HER2蛋白表达及基因扩增状态的变化，相信这一有趣味性的学术悬念就能迎刃而解。

综上所述，使用保型生物组织样本制备套装对乳腺癌HER2蛋白表达及基因扩增的检测效果并不劣于传统试剂。反之，保型生物组织样本制备套装的使用改善了病理实验室环境，避免了病理人员接触更多有毒有害的物质，且制备套装与现有的病理科仪器相匹配，与原有的组织处理程度大体相同。此外，保型生物组织样本制备套装由厂家提供的统一配方与使用说明，更有利于实现实验室的标准化和规范化，进而更易保证检测结果的重复性和可靠性，具有一定的应用潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

环保型生物组织样本制备套装：无醛、无苯，用于组织样本制备过程中对组织样本的固定、脱水和透明处理，其中固定液是利用无水乙醇、甲醇等化学试剂的蛋白质凝固作用，终止或减少分解酶的作用，防止自溶，保存组织、细胞的离体前结构状态；脱水液是利用能够与水互溶的有机溶液，将已固定和水洗过的组织中的水分彻底驱除；透明液是采用既能与脱水剂互溶，又能作为石蜡溶媒的有机溶剂，使浸蜡过程中石蜡渗入组织中。由于透明剂作用之后其折射指数与组织蛋白折射指数接近，组织显示出半透明状态，因此通常又称此过程为透明。

HER2蛋白：定位于染色体17q12-21.32上，编码相对分子质量为185 000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。检测方法有免疫组织化学、荧光原位杂交等。HER2是指重要的乳腺癌及胃癌预后判断因子，HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌/胃癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌/胃癌有很大的区别。目前已有针对该蛋白过度表达的药物——注射用曲妥珠单抗。

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研究依据最新的2019版乳腺癌HER2检测指南，结合临床工作中浸润性乳腺癌免疫组织化学2+的131例病例，采用了免疫组织化学与FISH相结合的检测策略，从HER2/细胞比值均数、Ch17 /细胞比值均数、HER2/ Ch17比值均数、HER2基因信号均数、Ch17信号均数等五个指标考核了传统试剂与保型生物组织样本制备套装对乳腺癌HER2蛋白和基因实验结果的影响，为优化乳腺癌HER2检测提供了实验数据，进而确保了乳腺癌精准的靶向治疗得以实施。

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