2.1  寒湿痹颗粒主要成分  在TCMSP中数据中检索找到化合物：附子65个、川乌12个、黄芪87个、桂枝220个、麻黄363个、白术55个，当归125个，白芍85个，威灵仙57个，木瓜80个，细辛192个，甘草280个。经1.4.1中的筛选条件进一步筛选并删去重复化合物及没有对应靶点的化合物，获得62个化合物，经查阅文献补充，最终获得69个化合物，见表1。

2.2  寒湿痹颗粒化合物-药物靶点网络图分析  寒湿痹颗粒中所含有69个化合物对应靶点基因142个，使用Cytoscape3.6.1构建化合物-药物靶点网络并分析。通过使用Cytoscape3.6.1中Network Analyzer工具对进行网络拓扑结构分析，使用节点的度值(degree)的大小来判断节点在整个网络中的重要程度，见图1。通过软件分析可知，网络有211个节点，911条边组成，将degree值前10的化合物及药物靶点绘制成柱状图，如图2，其中化合物排名前五位的分别是：MOL000098(槲皮素，quercetin)的degree值为(73个靶点)，其节点最大，MOL000378 (7-O-甲基异丙醇胺，7-O-methyliso-mucronulatol)的degree值为45，MOL000354 (异鼠李素，isorhamnetin)的degree值为33，MOL000358 (β-谷甾醇，beta-sitosterol)的degree值为31，MOL000449(豆甾醇，Stigmasterol)的degree值为31；其药物靶点基因排名前五位分别是：前列腺素G/H合成酶2 (prostaglandin G/H synthase2，PTGS2)的degree值为51，前列腺素G/H合成酶1(prostaglandin G/H synthase1，PTGS1)的degree值为34，热休克蛋白(heat shock protein HSP90，HSP90)的degree值为31，核受体辅激活蛋白2 (nuclear receptor coactivator 2, NCOA2)的degree值为28，钙调蛋白1基因(Calmodulin-1, CALM1)的degree值为24，从化合物与靶点之间的关系可知，一个化合物往往与多个靶点相对应，而一个靶点同时也与多个化合物存在相互作用关系，这说明寒湿痹颗粒是通过多成分、多靶点、多途径协同来起效的。

2.3  强直性脊柱炎疾病靶点及交集基因分析  GeneCards数据中按照Gifts=50检索获得强直性脊柱炎疾病靶点450个，DRUGBANK数据库中115疾病靶点，NCBI数据中获得属于OMIM收录的疾病靶点230个，通过PALM-IST文本挖掘得到87个(文献支持量≥10)，汇总删除重复靶点获得595个强直性脊柱炎疾病靶点。使用Draw Venn Diagrams在线分析工具将所有的强直性脊柱炎疾病靶点与药物靶点进行分析，获得交集靶点基因39个，见表2。

2.4  交集基因PPI分析  将交集基因导入STRING数据及结合Cytoscape分析得到，交集基因中肿瘤坏死因子、白细胞介素6、前列腺素内过氧化物合酶2、血管内皮生长因子A、丝裂原活化蛋白激酶1的degree值较高，这说明炎症因子与强直性脊柱炎的发病与治疗存在密切的联系，见表2、图3中PPI。使用MCODE插件对PPI进行模块分析，获得两个模块并构建化合物-靶点网络图，见图3中MCODE1、MCODE2，其中绿色节点为靶点，红色节点化合物。

2.5  交集基因GO富集分析  交集基因利用ClueGO插件，富集条件为P ≤ 0.05，Cluster#1=4，Kappa Score等于0.4，其余条件为默认设置，获得与强直性脊柱炎相关的项目有16条，主要包括：活性氧代谢过程的调节(positive regulation of reactive oxygen species metabolic process)、活性氧的生物合成过程(reactive oxygen species biosynthetic process)、长链脂肪酸的代谢(long-chain fatty acid metabolic process)、急性炎症反应(acute inflammatory response)、神经递质生物过程(neurotransmitter biosynthetic process)、花生四烯酸的代谢过程(arachidonic acid metabolic process)、经JAK-STAT对受体信号传导途径的调节(positive regulation of receptor signaling pathway via JAK-STAT)等，见表3。使用CluePedia插件将GO富集条目与靶点绘制生物学功能网络图，同时根据每条项目的P值及基因数的不同绘制成气泡图，见图4。从生物学功能网状图可知，肿瘤坏死因子、前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1、白细胞介素6等交集基因与作用于多种生物学功能，而一种生物学功能与多个交集基因存在相互作用联系，这提示寒湿痹颗粒治疗强直性脊柱炎可能是通过多靶点多种生物学功能整体调节。

2.6  交集基因KEGG通路富集分析  为了进一步阐述其作用通路，使用ClueGO插件进行KEGG通路分析，通路富集条件为P ≤ 0.05，Cluster#1=4，Kappa Score=0.4，其余条件为默认设置，其中与强直性脊柱炎直接相关的通路有16条，主要包括：AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、类风湿关节炎、低氧诱导因子1信号通路、Toll样受体信号通路等，见表4。使用CluePedia插件绘制通路网络图，将KEGG富集得到的靶点数及P值绘制气泡图，见图5。从图5可知，一条KEGG通路往往富集到多个靶点基因，而一个靶点基因同时又可以出现在多条通路中。

强直性脊柱炎是一种以侵犯骶髂关节与脊柱为主的自身免疫性疾病，多发生在18-22岁的青年男性，属于风湿病范畴，具有较高的致残性^[1-3]。脊柱关节疼痛、活动障碍、强直与畸形为强直性脊柱炎较为常见的临床症状，附着点炎症、骨破坏、新骨形成是强直性脊柱炎主要病理特征^[4-6]，消炎镇痛、防止新骨形成、骨损伤是现代医学常用的治疗手段，其目的主要是减缓与控制患者的病情发展。西药治疗强直性脊柱炎虽取得较大的进展，但其不良反应也较为明显，在阻滞关节和脊柱发生强直方面疗效还是欠佳。与现代医学相比，中成药在治疗强直性脊柱炎方面具有独特的优势，不仅能减缓患者疼痛的同时还能兼顾人体的正气，通过补益正气来增强患者的免疫力，控制疾病发展。寒湿痹颗粒由附子、制川乌、黄芪、桂枝、麻黄、白术、当归、威灵仙、木瓜、细辛等10多味中药组成，具有温肾散寒、祛风、益气活血、止痛等功效，临床用于治疗强直性脊柱炎与类风湿性关节炎^[7]，属于国家三类新药痹病系列药之一^[8]。临床观察发现，寒湿痹颗粒能够降低寒湿痹阻型强直性脊柱炎的血沉和类风湿因子，同时还能改善关节疼痛、晨僵及关节功能障碍等症状^[9-10]，动物实验研究表明其还能抑制炎症细胞的浸润和滑膜增生，减轻软骨损伤程度^[11-12]。但由于寒湿痹颗粒成分多而复杂，药理机制还待进一步挖掘。因此，课题组基于网络药理学从成分-靶点-通路预测其药理作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  生物信息学实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年12至2019年4月在广东药科大学完成。

1.3  材料 化合物数据来源于TCMSP(http://lsp.nwu. edu.cn/index.php)；靶点数据来源于DRUGBANK(https:// www.drugbank.ca/)、Uniprot(https://www.Uniprot. org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)OMIM-NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)、PAL-M-IST(http:// www. hpppi.iicb. res.in/ctm/index.html)。

1.4  方法

1.4.1  寒湿痹颗粒活性成分筛选  通过使用TCMSP数据库对寒湿痹颗粒潜在活性成分及其药物靶点进行筛选。因为甘草在寒湿痹颗粒中作为佐使药，所以其口服利用度(Obioavail，OB)≥60和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18^[13]，其余药物筛选条件为利用度(OB)≥30，类药性(DL)≥0.18。有些化合物虽类药性(DL)值较低，但已有文献报道其确有活性，故纳入此次研究中。

1.4.2  寒湿痹颗粒成分-药物靶点网络图的构建  见图1。

1.4.3  强直性脊柱炎疾病靶点基因及交集基因  在DRUGBANK、PALM-IST、GeneCards、NCBI数据库筛选出与强直性脊柱炎相关的靶点，其中GENECARDS^[14]按照Gifts值大小进行筛选。将筛选获得的靶点基因作为疾病靶点，最后使用Uniprot数据库校正所得的疾病靶点与药物靶点，并使用Draw Venn Diagrams在线分析工具获得交集基因。

1.4.4  交集基因PPI及模块分析  将获得交集基因导入STRING(https://string-db.org/)数据进行蛋白-蛋白互作分析(protein protein interaction，PPI)，其分析结果导入Cytoscape3.6.1分析并绘制PPI网络图。使用MCODE插件对PPI分析，将获得的模块构建化合物靶点网络图。

1.4.5  交集基因GO富集与KEGG通路富集分析  通过使用Cytoscape3.6.1软件的ClueGO插件对获得交集基因进行GO(Gene ontology)富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，进一步说明寒湿痹颗粒治疗强直性脊柱炎的潜在作用机制。

1.5  主要观察指标  寒湿痹颗粒主要化学成分及其药物与疾病的共同靶点之间的联系，及共同靶点的生物学功能、作用通路等。

中医并无强直性脊柱炎的记载，根据关节屈伸不利、僵硬、腰背疼痛等临床症状，将其归为“痹证”“历节病”“骨痹”“背偻”等范畴。《素问·痹论》记载：“风寒湿三气杂至，合而为痹也……故骨痹不已，复感于邪，内舍肾……肾痹者，善胀，尻以代踵，脊以代头。”其中“尻以代踵，脊以代头”是指痹证日久不愈，反复受风寒湿三邪入侵，深入筋骨所出现腰背弯曲畸形乃至残疾，符合强直性脊柱炎晚期临床特征。而寒湿痹颗粒由附子、制川乌、威灵仙、黄芪、桂枝、麻黄、白芍等10多味中药组成，制川乌、附子具有温肾阳、散寒祛湿止痛，细辛直达三阴散结除痼冷，威灵仙性善走，可通十二经之络，增强散寒之功，当归、桂枝、麻黄、芍药以温经和营止痛，黄芪、白术、木瓜舒筋、健脾祛湿，甘草调和诸药。诸药相配具有散寒除痹、调和营卫、通经络等功效，其主要基于寒湿痹型强直性脊柱炎的关节屈伸不利、疼痛、关节僵硬等而设。

此次研究通过运用网络药理学方法预测寒湿痹颗粒潜在活性成分有69个，药物靶点有142个，节点的度(degree)值较前的槲皮素可以抑制NF-κB的生物活性、抑制白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α等炎症因子的表达、减轻氧化应激反应、抑制滑膜细胞的异常增殖与环氧合酶活性等，从而起到消炎镇痛、抑制骨损伤的效果^[15-19]；范轶鑫等^[20]发现槲皮素还可以抑制脊髓小胶质细胞基质金属蛋白酶活化，对术后疼痛有一定的改善作用。晁杲等^[21]发现异鼠李素不仅能促进骨保护素的表达，还能抑制NF-κB信号通路活化，降低了活化T细胞核因子c1的表达，使骨钙素与破骨细胞中的抗酒石酸酸性磷酸酶表达减少，从而抑制骨质损伤；β-谷甾醇具有类激素样作用，可以调节下丘脑-垂体-肾上腺素轴系统而起到类似于氢化可的松的抗炎作用^[22]，同时还具有调节骨代谢平衡、增强T细胞及NK细胞增殖、抗氧化、保护神经元等多种药理活性作用^[23]。在化合物-靶点网络中，前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1、HSP90、NCOA2、CALM1等靶点的节点的度(degree)值较高。前列腺素内过氧化物合酶又称环氧合酶，主要包括结构型(前列腺素内过氧化物合酶1)和诱导型(前列腺素内过氧化物合酶2)两种同工酶，是非类固醇类抗炎药物重要靶点。研究表明，非类固醇类抗炎药物治疗强直性脊柱炎主要通过抑制环氧合酶活性来减少前列腺素(PG)生成，减少炎症因子对分泌而起到抗炎、镇痛、解热的作用^[24]；HSP90、NCOA2、CALM1等基因通过能量代谢、免疫及繁殖、Ca²⁺调节等引起机体发热、软骨细胞损伤、激素应答及保护细胞免受损伤等^[25-27]；周熹^[28]发现CALM1基因与特发性脊柱侧凸相关性较大，这提示强直性脊柱炎出现脊柱强直变形与CALM1基因可能存在一定联系。以上基因功能与炎症、骨损伤、镇痛、免疫等相关，这说明寒湿痹颗粒治疗强直性脊柱炎可能是通过这些关键基因间接或直接发挥作用。

为了进一步阐述其作用靶点基因之间的关系，取药物靶点与疾病靶点的交集基因进行蛋白-蛋白互作分析。通过对交集基因分析发现，这些交集基因主要包括白细胞介素6、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子A、丝裂原活化蛋白激酶1、前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1、ACHE、白细胞介素1B(β)等。肿瘤坏死因子α作为最重要的炎症因子，可以激发炎症级联反应，诱导多种炎症因子上调表达如白细胞介素6，它可以直接血管内皮细胞及炎症细胞，催化和放大炎症反应和毒性作用，造成组织细胞损害^[29-31]，故PPI分析中呈现较高的degree值即与其他基因联系较为密切。使用ClueGO插件将交集基因再进行GO富集，发现其生物学功能主要包括了活性氧生物合成及代谢的调节、脂肪酸代谢、急性炎症反应、神经递质的生物合成过程、花生四烯酸的代谢过程、经JAK-STAT对受体信号传导途径的调节等。花生四烯酸主要是经过环氧合酶、脂氧合酶和细胞色素P450这三大代谢途径，其代谢过程会产生前列腺素类，血栓烷素类，白细胞三烯类等活性物质，这些产物主要参与了炎症反应^[32]、细胞凋亡^[33]、血管生成反应等^[34]；活性氧代谢与多种疼痛的关系比较密切如内脏痛、炎症性疼痛等，其在体内含量增加会诱发慢性神经病理性疼痛^[35]；脂肪酸代谢可以引起内质网反应，而内质网反应可以诱导炎症反应、免疫反应如激活天然免疫系统受体Toll样受体4^[36]；急性炎症反应与神经递质的生物过程、平滑肌细胞增殖这些生物学功能与强直性脊柱炎患者出现关节屈伸不利，肌肉酸痛、关节红肿热痛等症状有关；宋俊垚^[37]发现中医补肾、活血法可以通过JAK-STAT信号通路来抑制JAK2与STAT3的磷酸化，从而抑制了Th17的增殖分化，控制强直性脊柱炎炎症发展。这提示寒湿痹颗粒治疗强直性脊柱炎可能是作用于肿瘤坏死因子、丝裂原活化蛋白激酶1、前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1等这些交集基因，从而调节花生四烯酸、活性氧、脂肪酸代谢、神经递质的生物合成等多种生物学功能来起到治疗效果。

交集基因经过KEGG通路富集分析，其通路包括AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、类风湿关节炎、低氧诱导因子1信号通路、Toll样受体信号通路等。研究表明，晚期糖基化终末产物通过与其受体结合，可以引起氧化应激反应与激活NF-κB，进而引起多种基因表达，诱发一系列炎症级联反应，从而破坏髓鞘、微管、细胞骨架等蛋白，使神经的再生和修复功能受阻^[38-39]，而NF-κB又可以增强晚期糖基化终末产物的表达或协同其他信号通路持久作用细胞^[40]；骨细胞能感应液体流动产生的剪切应力并产生破骨和成骨的信号，并通过树突将信号传递给骨表面的成骨细胞和破骨细胞，从而调节骨骼重建^[41-42]，而流体剪切应力又可以导致动脉粥样硬化，从而出现关节局部淤阻。秦臻等^[43]发现黄芪与当归配伍使用可以改善流体剪切应力，保护内皮细胞，从而改善动脉粥样硬化。白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、类风湿关节炎、Toll样受体信号通路等已存在大量研究证明其与炎症反应有密切联系，不再赘述。

综上，从网络药理分析结果，寒湿痹颗粒治疗强直性脊柱炎主要是通过槲皮素、异鼠李素、β-谷甾醇等多种潜在活性成分作用于肿瘤坏死因子、丝裂原活化蛋白激酶1、前列腺素内过氧化物合酶2、前列腺素内过氧化物合酶1等基因，从而调节多种生物学功能及多条通路达到治疗作用。同时也直观的验证了寒湿痹颗粒多成分、多靶点、多途径的作用特点。但是，研究中仍存在很多不足之处，故其预测结果还待进一步实验验证。

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文题释义：
寒湿痹颗粒：由附子、制川乌、黄芪、桂枝、麻黄、白术、当归、白芍、威灵仙、木瓜、细辛、甘草等10多味中药组成，具有温肾散寒、祛风、益气活血、止痛等功效，可用于治疗强直性脊柱炎、风湿性关节炎、骨关节炎等病。
网络药理学：基于系统生物学的理论，对生物系统网络进行分析，从成分-靶点-通路进行整体预测及阐明药物在体内作用机制。

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网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点(Nodes)进行多靶点药物分子设计的新学科。网络药理学强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用。

在以前的药物研发模式中，主要遵循"一个药物、一个基因、一种疾病"的模式，这是导致70%的新药在临床试验失败的主要原因。实际上，临床上的多种慢性病如肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病等都是多基因、多因素作用的疾病，仅根据单一作用靶点难以达到良好治疗的效果。以肿瘤的发生为例:形成一个立方厘米的实体瘤需要10年的时间，经过6大步骤:克服凋亡、抑制衰老(无限增殖)、分泌自我增殖信号、对生长信号不敏感、血管新生和侵袭，其中有大量的基因和蛋白参与作用。

基于网络药理学形成药物分子设计新模式，是发展创新药物的重要途径。

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