真皮脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞修复比格犬关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1405

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (4): 532-537.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1405

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真皮脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞修复比格犬关节软骨缺损

靳少锋，郑蕊，杰永生，陈磊，綦惠，孙磊，舒雄

北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所，北京市 100035

收稿日期:2018-10-24 修回日期:2018-11-05 接受日期:2018-12-08 出版日期:2020-02-08 发布日期:2020-01-07
通讯作者: 舒雄，研究实习员，北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所，北京市 100035
作者简介:靳少锋，男，1981年生，河北省曲周县人，汉族，2007年解放军第四军医大学毕业，技师，主要从事组织修复材料方面的实验研究。
基金资助:
北京市属医学科研院所科技发展项目(PXM2017_026275_000004)

Bone marrow mesenchymal stem cells combined with acellular dermal matrix repair beagle dog articular cartilage defects

Jin Shaofeng, Zheng Rui, Jie Yongsheng, Chen Lei, Qi Hui, Sun Lei, Shu Xiong

Beijing Jishuitan Hospital/Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China

Received:2018-10-24 Revised:2018-11-05 Accepted:2018-12-08 Online:2020-02-08 Published:2020-01-07
Contact: Shu Xiong, Research assistant, Beijing Jishuitan Hospital/Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China
About author:Jin Shaofeng, Technician, Beijing Jishuitan Hospital/Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China
Supported by:
the Science and Technology Development Project of Beijing Municipal Medical Research Institutes, No. PXM2017_026275_000004

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨髓间充质干细胞作为软骨组织工程中的种子细胞：目前软骨细胞作为种子细胞在体外已经构造出各种不同的成熟软骨组织，但软骨细胞体外扩增能力差，且易发生老化和去分化，效果都不够理想，而且软骨细胞在体内来源有限，取材时还会引起新的创伤，这些问题显著限制了其临床应用潜能。骨髓间充质干细胞是一种多能成体干细胞，具有多向分化及自我更新的潜能，还具有明显的可塑性，易于体外培养、扩增。在体外被诱导分化为软骨细胞，而且在体内可迁移到软骨损伤处，参与软骨缺损的修复。
真皮来源细胞外基质：是动物皮肤组织通过各种物理和化学方式处理，去除其表皮及真皮层的细胞成分，保留完整的细胞外基质蛋白和基底膜。由于具有合适的孔隙率，良好的生物相容性和支撑效果，是一种修复软骨缺损合适的支架材料。

背景：真皮来源细胞外基质作为软骨修复支架为软骨组织的生长提供空间支持，同时促进细胞黏附和增殖，骨髓间充质干细胞具有向软骨细胞诱导分化的作用，两者单独应用均有不足。

目的：探索比格犬骨髓间充质干细胞复合小牛真皮脱细胞基质修复比格犬膝关节软骨缺损的可行性。

方法：抽取比格犬骨髓血，采用密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞并传代。取新生小牛背部真皮组织，通过物理和化学方法脱除细胞成分，制备真皮脱细胞基质。真皮脱细胞基质表面缓慢滴加0.2 mL细胞悬浮液至完全覆盖支架，放在37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中静置48 h备用。选取12只成年比格犬构建膝关节软骨缺损动物模型，随机分为3组：支架复合骨髓间充质干细胞组软骨缺损处缝合真皮脱细胞基质复合自体骨髓间充质干细胞；单纯支架组软骨缺损处缝合真皮脱细胞基质；模型对照组不进行处理。术后12周获取比格犬右膝关节组织，进行体视显微镜观察、苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。

结果与结论：①扫描电镜显示骨髓间充质干细胞在脱细胞基质中黏附和生长良好；②苏木精-伊红染色显示，支架复合骨髓间充质干细胞组修复平面略低于周边正常组织，修复组织与周围软骨整合很好，单纯支架组软骨缺损处为纤维组织填充，模型对照组缺损周边仅有少量修复；③Ⅱ型胶原免疫组化染色显示，支架复合骨髓间充质干细胞组软骨缺损处为类软骨组织填充，单纯支架组软骨缺损处为纤维组织填充，模型对照组软骨缺损处无修复组织填充；④结果表明，新型小牛真皮脱细胞基质具有良好的生物相容性，可以促进骨髓间充质干细胞增殖，自体骨髓间充质干细胞与真皮脱细胞基质复合物可有效修复比格犬膝关节软骨缺损。

ORCID: 0000-0002-5030-0349(舒雄)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 真皮脱细胞基质, 膝关节软骨缺损, 软骨修复, 类软骨组织, 细胞黏附, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Dermis-derived extracellular matrix, as a cartilage repair scaffold, provides a space for the growth of cartilage tissue, and promotes cell adhesion and proliferation. Bone marrow mesenchymal stem cells have the potential to differentiate into chondrocytes. Both of them used alone have disadvantages.

OBJECTIVE: To evaluate the feasibility of bone marrow mesenchymal stem cells combined with calf acellular dermal matrix to repair beagle dog articular cartilage defects.

METHODS: Beagle dog bone marrow blood was extracted from Beagle dogs. Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained by density gradient centrifugation and passaged. Acellular dermal matrix was prepared from the dorsal dermis of neonatal calves by ultrasonic oscillation, freeze-drying and pepsin. 0.2 mL of cell suspension was added to the surface of acellular dermal matrix until covered, then which was placed in a 5% CO₂ incubator at 37 °C for 48 hours. Twelve adult beagle dogs were used to establish knee joint cartilage defect models, and then randomized into three groups: In the acellular dermal matrix combined with bone marrow mesenchymal stem cells group (combination group), cartilage defects were repaired with acellular dermal matrix combined with bone marrow mesenchymal stem cells. In the single acellular dermal matrix group, cartilage defects were repaired with acellular dermal matrix. The model control group received no treatment. At 12 weeks after surgery, the right knee joints were observed by stereomicroscope, hematoxylin-eosin staining and type II collagen immunohistochemical staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that bone marrow mesenchymal stem cells adhered to and grew well in the acellular dermal matrix. (2) Hematoxylin-eosin staining revealed that the repaired surface in the combination group was slightly lower than that of the surrounding normal tissues, and the repaired tissues integrated well with the surrounding cartilages. The defects in the single acellular dermal matrix group were filled with fibrous tissues. Few surrounding tissues of defect were repaired in the model control group. (3) Type II collagen immunohistochemical staining showed that in the combination group, articular cartilage defects were filled with chondrocyte-like tissues. In the single acellular dermal matrix group, the defect was filled with fibrous tissues. No tissue was found in the model control group. (4) These results indicate that the new calf acellular dermal matrix has good biocompatibility and can promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. Autologous bone marrow mesenchymal stem cells combined with acellular dermal matrix can effectively repair beagle dog knee joint cartilage defects.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells, acellular dermal matrix, knee joint cartilage defects, chondrocyte-like tissues, cell adhesion, cell proliferation

中图分类号:

靳少锋, 郑蕊, 杰永生, 陈磊, 綦惠, 孙磊, 舒雄. 真皮脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞修复比格犬关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(4): 532-537.

Jin Shaofeng, Zheng Rui, Jie Yongsheng, Chen Lei, Qi Hui, Sun Lei, Shu Xiong. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with acellular dermal matrix repair beagle dog articular cartilage defects [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(4): 532-537.

图/表（结果） 6

2.1 比格犬骨髓间充质干细胞的形态和鉴定结果原代培养24 h后可见圆形贴壁细胞，72 h细胞数量明显增加，排列密集。第3代细胞增殖速度较快，六七天时细胞长满培养瓶底，呈斡旋状排列，见图1。流式细胞仪检测结果显示，骨髓间充质干细胞表型呈CD44⁺，CD105⁺，CD90⁺，CD14^-，CD19^-，CD45^-，见图2。

2.2 小牛真皮脱细胞基质支架与骨髓间充质干细胞复合情况培养7 d后有活细胞黏附在真皮脱细胞基质。当培养时间达14 d时，支架上层内增殖为更多的活细胞，具有良好的生长状态并完全覆盖真皮脱细胞基质，适应支架结构并向外分泌胞外基质，见图3。

2.3 实验动物数量分析造模时12只比格犬，最终12只比格犬进入结果分析，其中支架复合骨髓间充质干细胞组4只，单纯支架组4只，模型对照组4只，中途无脱落。

2.4 实验动物大体观察结果实验动物比格犬手术后12周处死，支架复合骨髓间充质干细胞组缺损处完全填充，修复后的组织外相与周围正常关节软骨界限模糊，结合紧密，见图4A；单纯支架组缺损处部分修复，缺损处欠平整，与正常组织界限明显，见图4B；模型对照组缺损处无软骨修复组织，不起填充作用，仅部分有少量修复，见图4C。

2.5 组织学观察结果苏木精-伊红染色显示支架复合骨髓间充质干细胞组再生组织中复合支架已被吸收，再生细胞分布较为规律，糖胺聚糖表达与邻近的软骨组织类似，即软骨下的新骨与再生的软骨整合，见图5A；单纯支架组再生组织中支架大部分吸收，细胞排列较为规律，糖胺聚糖含量较低，但不完整，见图5B；模型对照组软骨缺损处为成纤维组织，修复效果差，见图5C。

2.6 免疫组化检测Ⅱ型胶原表达变化支架复合骨髓间充质干细胞组支架已被吸收，再生软骨Ⅱ型胶原呈阳性表达，见图6A；单纯支架组支架被大部分吸收，再生软骨Ⅱ型胶原呈阳性表达，但修复不完整，见图6B；模型对照组软骨缺损处因无修复组织，再生软骨Ⅱ型胶原呈阴性表达，见图6C。

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引言

关节软骨缺损是一类常见骨科疾病，目前临床治疗方法主要有软骨打孔、微骨折术和自体软骨移植等，短期效果好，但长期效果欠佳^[1-3]。近年组织工程与再生医学的发展，为治疗软骨损伤带来了新的希望^[4-6]。软骨是最早应用组织工程技术构建成功的组织，目前软骨细胞作为种子细胞在体外已经构造出各种不同的成熟软骨组织，但软骨细胞体外扩增能力差，且易发生老化和去分化，效果都不够理想，而且软骨细胞在体内来源有限，取材时还会引起新的创伤，这些问题显著限制了其临床应用潜能。探索合适的种子细胞来源是十分必要的。骨髓间充质干细胞是目前软骨组织工程中常见的种子细胞，具有来源广泛、多向分化特点，体外培养可大量增殖，尤其是自体骨髓间充质干细胞不存在免疫排斥反应，是软骨组织工程理想的种子细胞^[7-9]。自体骨髓间充质干细胞已被应用于修复软骨损伤动物实验和临床，并取得了满意的修复效果^[10-12]。真皮脱细胞基质是一种细胞外基质，能很好地保留天然的细胞外基质成分，去除细胞核物质，仿生细胞生长的微环境，为间充质干细胞提供良好的支架，促进间充质干细胞增殖和分化，促进软骨样细胞的形成^[13]。课题组前期研究表明，小牛真皮通过脱细胞、结构重塑、交联、表面修饰等方法处理后，具有良好组织相容性^[14]，其对兔关节软骨缺损具有良好的修复效果，但对于大动物关节软骨缺损的修复效果报道甚少。因此，该研究拟采用小牛真皮脱细胞基质复合比格犬自体骨髓间充质干细胞进行体外培养，观察其修复比格犬关节软骨缺损的效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年5至8月在北京市创伤骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6月龄健康雄性比格犬12只，普通级，体质量7-9 kg，购自北京玛斯生物技术有限公司，所有动物实验方案均经北京积水潭医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验试剂甲醛、苏木精、伊红、3-3-二氨基联苯等组织切片和染色用试剂(北京索莱宝生物科技有限公司)；高糖DMEM和胎牛血清(GIBCO公司，美国)；抗比格犬CD90、CD105、CD44、CD14、CD45和CD19抗体(BD公司，美国)；Ⅱ型胶原小鼠抗比格犬单克隆抗体(Abcam公司)；免疫组化试剂盒(福州迈新)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞分离及培养 12只比格犬肌肉注射复方氯胺酮麻醉，侧卧位固定于实验台，碘伏消毒，依次铺无菌治疗巾、洞巾。骨穿针无菌穿刺髂骨，单侧抽取骨髓血5 mL，在无菌超净台内，取15 mL无菌离心管，先注入5 mL Percoll淋巴细胞分离液，然后将骨髓血缓慢沿壁注入，以1 800 r/min离心15 min，吸取乳白色的淋巴细胞层，缓慢注入含有4 mL PBS的试管内，反复吹打细胞悬液，再次以1 200 r/min离心15 min，收集细胞沉淀用10 mL H-DMEM完全培养液分散，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1接种入培养瓶内，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内静置培养，隔天换液，去除未贴壁细胞，以后每两三天换液，细胞分裂增殖到80%-90%融合后传代，取第3代骨髓间充质干细胞用于以下实验。

1.4.2 流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞表面特异性抗原的表达将第3代骨髓间充质干细胞经分离液分离后，调整细胞浓度为1×10⁹L^-1，与直标的流式抗体在常温中避光孵育30 min，离心弃上清，PBS洗2次，用含1%BSA的PBS重悬细胞，采用流式细胞术分析骨髓间充质干细胞表面特异性抗原CD90-FITC、CD105- FITC、CD44-FITC、CD14- FITC、CD45-FITC、CD19-FITC的表达。

1.4.3 小牛真皮脱细胞基质的制备 ①脱细胞处理：取新生小牛背部皮肤，脱毛、清洗，乙酸溶液浸泡溶胀2 h，使皮肤表皮、真皮和皮下组织各层有相对明显的界线，电动取皮刀切取厚度为1.0-2.0 mm的真皮层；流水冲洗乙酸后，室温下用0.5%SDS溶液水平振荡脱细胞2 h，更换新的SDS溶液，再继续作用2 h，流水冲洗过夜；蒸馏水再次冲洗20次后，冷冻干燥机中冻干；常规苏木精-伊红染色，观察脱细胞效果；②结构重塑：取脱细胞真皮基质置于0.5%胰蛋白酶溶液中，室温超声振荡2.5 h，冷冻干燥机冻干；③交联：结构重塑后，用甲醛作为交联剂室温浸泡2 h；PBS冲洗3次，流水冲洗过夜，以去除残留的交联剂，再用蒸馏水清洗20次后冻干；④表面修饰：取交联冻干后的脱细胞真皮基质，浸泡于0.5%硫酸软骨素溶液中，室温超声波振荡1.5-2.0 h，冷冻干燥机冻干；⁶⁰Co照射后备用。

1.4.4 骨髓间充质干细胞与真皮脱细胞基质复合将培养的骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×10¹⁰ L^-1。真皮脱细胞基质表面缓慢滴加0.2 mL细胞悬浮液至完全覆盖支架，放在37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中静置48 h备用。骨髓间充质干细胞复合真皮脱细胞基质培养7 d后，PBS冲洗3次；2.5%戊二醛固定12 h，PBS冲洗3次，30 min/次；1%锇酸处理1 h，PBS冲洗3次，30 min/次；梯度乙醇脱水；乙酸异戊酯处理30 min；干燥8 h后上机喷金，扫描电镜观察细胞在真皮脱细胞基质上的形态和分布。

1.4.5 动物实验分组及干预选取健康比格犬12只，编号后随机分为3组：支架复合骨髓间充质干细胞组、单纯支架组、模型对照组，每组4只。比格犬给予异戊巴比妥钠3 mL/kg耳缘静脉麻醉，常规消毒、铺无菌巾。沿髌骨外侧纵向切口3.0-4.0 cm，进入关节腔后在股骨髁间窝采用7 mm环钻打孔，见创面少许渗血为止。支架复合骨髓间充质干细胞组在孔内外科手术缝合植入的骨髓间充质干细胞复合真皮脱细胞基质，单纯支架组在孔内外科手术缝合植入的真皮脱细胞基质，模型对照组缺损处不作任何处理，清创后分层缝合，术后自由饲养。

1.5 主要观察指标

1.5.1 一般情况动物模型制备后，观察3组比格犬存活及饮食等情况。

1.5.2 大体观察创面愈合情况模型制备后12周，大体观察3组创面愈合情况。

1.5.3 苏木精-伊红染色观察组织学变化模型制备后12周，取比格犬右膝关节组织标本，经甲醛固定、脱钙和石蜡包埋，垂直于缺损区进行切片，苏木精-伊红染色5 min后在光镜下观察。

1.5.4 免疫组化染色观察Ⅱ型胶原的表达模型制备后12周，取比格犬右膝关节组织标本进行免疫组织化学染色，一抗为小鼠抗比格犬Ⅱ型胶原单克隆抗体，二抗为HPR标记的山羊抗鼠多克隆抗体，DAB染色后在光镜下观察。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料以x(_)±s表示，两组计量资料之间的比较采用 t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

组织工程种子细胞来源主要有软骨细胞、干细胞、异体细胞和软骨外组织细胞如成纤维细胞等，其中骨髓间充质干细胞因取材创伤小，来源充足，体外增殖能力强，且具有向软骨分化潜能等优点，被认为是组织工程研究和临床应用的最佳种子细胞来源^[15-17]。理想真皮支架应具有以下特点^[18-21]：①良好的生物相容性：支架材料和相应的降解产物对组织细胞无毒性和致突变作用，在体内时无抗原性、致畸作用；②合适的孔隙率、孔径和相连通的孔形态，以利于细胞种植、细胞和组织生长、细胞外基质形成、血管和神经长入；③适宜比表面积、合适的表面理化性质和良好细胞界面关系，利于细胞黏附、增殖、分化以及负载生长因子等生物信号因子；④具有生物可降解吸收性：即材料在细胞生长、繁殖和组织再生过程中能逐渐被降解吸收；⑤具有可塑性和适宜的力学特性，即易于加工成形，能够在体内外承受一定的压力，保持其外形和结构的完整性。作者在前期研究中发现修饰交联制备小牛真皮脱细胞基质可作为理想的细胞载体，能容纳高密度的细胞黏附、增殖，有利于细胞间信号传递，为维系骨髓间充质干细胞的代谢活动提供适宜的微环境^[22-23]。该实验通过组织工程方法采用小牛真皮脱细胞基质作为多孔三维支架，复合比格犬自体骨髓间充质干细胞对比格犬关节软骨缺损进行修复，初步验证其在大动物实验中修复软骨缺损的可行性。

实验首先抽取比格犬骨髓血，体外培养骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10¹⁰ L^-1，自体骨髓间充质干细胞最先应用于修复关节软骨缺损的动物实验和临床治疗，与胚胎干细胞和诱导多能干细胞相比具有更高的安全性，避免相应的医学伦理风险^[24-27]。课题组前期通过对小牛真皮采用脱细胞方法去除了细胞成分，保留了真皮乳头层表面的基底膜，避免了其在动物体内产生的免疫排斥反应，进一步采用0.5%胰蛋白酶和甲醛溶液对脱细胞真皮基质的胶原纤维进行结构重塑和交联，使胶原纤维表面光滑和孔隙结构更稳定，具备一定可塑性，证实了其良好的生物相容性^[28]。小牛真皮脱细胞基质已在修复家兔关节软骨得到良好的治疗效果^[29]。该实验向真皮脱细胞基质表面缓慢滴加0.2 mL骨髓间充质干细胞悬液至完全覆盖支架，在37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下中静置48 h备用。骨髓间充质干细胞复合真皮脱细胞基质培养7 d后，通过扫描电镜观察发现有活细胞黏附在真皮脱细胞基质；当培养时间达14 d时，支架上层内增殖为更多的活细胞，具有良好的生长状态并完全覆盖真皮脱细胞基质，适应支架结构并向外分泌胞外基质，表明其具有良好的生物相容性。

目前常用诱导方法主要是通过添加外源性生长因子^[30-33]，细胞外基质成分以及转基因技术等诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨表型细胞^[34-37]。然而，这些方法都还不能达到理想的诱导效果，距离临床应用仍有很大差距。作者在动物实验中发现，支架材料贴合在关节缺损处会常常会引起支架脱落，因此在研究关节软骨缺损的大动物实验中，改良了真皮脱细胞基质支架材料与关节软骨缺损处的固定方法，即将真皮脱细胞基质采用外科缝合线在缺损处缝合固定，术后12周通过苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色表明，未经诱导的自体骨髓间充质干细胞复合真皮脱细胞基质可以在关节缺损内向软骨定向分化并形成软骨组织，证实真皮脱细胞基质提供的组织微环境对于骨髓来源干细胞的定向分化也有重要作用。

以上结果证明，骨髓间充质干细胞具有分化为类软骨细胞的潜能，骨髓间充质干细胞与小牛真皮脱细胞基质复合可以显著提高修复效率，为关节软骨缺损的治疗开辟新的路径。但目前该研究还存在一定局限性，还需要进一步通过分子生物学和细胞生物学研究，来验证复合载体对比格犬关节软骨损伤的修复情况，其在修复中的调控机制、修复机制也有待阐明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

真皮脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞修复比格犬关节软骨缺损

Bone marrow mesenchymal stem cells combined with acellular dermal matrix repair beagle dog articular cartilage defects

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