2.1  实验动物数量分析  纳入32只幼兔制备右股骨远端骺板上方5 mm骨折模型，随机分4组，26只进入结果分析数量，实验过程中有6只因腹泻、营养不良等原因死亡。补齐后32只幼兔进入结果分析。

2.2  实验创新性  ①通过建立动物实验模型，经内固定一段时间后，继续观察2周，动态观察骺板受抑制情况；②观察骺板肥大细胞个数及骺板厚度生长速率，了解跨骺钢板内固定对兔肢体生长发育抑制的影响。

2.3  该实验更接近临床实践  内固定一段时间后，取出钢板继续观察2周，了解骺板受抑制及其恢复情况。对儿童骨骺骨折，经跨骺板钢板内固定后，骺板受压力限制影响产生可逆损害的时间界域提供了方向。 

2.4  造模后2，4，8，12周取出钢板，继续观察2周后的股骨增长长度变化  跨骺锁定钢板固定一定周期(术后2，4，8，12周)取出钢板，继续观察2周。经测量，术后≤2周(+2周)，股骨长度无显著变化；术后≥4周(+2周)，股骨长度出现不同长度短缩、畸形，甚至生长停滞，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.001)，见图1，2及表2。

      由表2可见，内固定2周取出钢板，继续观察2周，实验组与对照组股骨长度差异无显著性意义(P > 0.05)。内固定4，8，12周取出钢板，继续观察2周，实验组股骨长度小于对照组，股骨出现不同程度生长停滞或短缩，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.001)。

2.5  造模后2，4，8，12周取出钢板，继续观察2周骺板厚度比较  见图3及表3。

由表3可见，内固定2周取出钢板，继续观察2周，实验组与对照组骺板厚度差异无显著性意义(P > 0.05)。内固定4，8，12周取出钢板，继续观察2周，实验组骺板厚度小于对照组，骺板厚度受到不同程度抑制，经过统计，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.001)。
2.6  造模后2，4，8，12周取出钢板，继续观察2周单位柱肥大细胞个数比较  跨骺板钢板内固定2周取出钢板，继续观察2周，实验组与对照组单位柱内肥大细胞个数差异无显著性意义(P > 0.05)。内固定4，8，12周取出钢板，继续观察2周，实验组单位柱内肥大细胞个数小于对照组，差异有显著性意义(P < 0.001)，见表4。

2.7  骺板软骨细胞的苏木精-伊红染色和特殊染色 

2.7.1  苏木精-伊红染色  镜下见，内固定早期(≤2周)，软骨细胞、肥大细胞体积略变小，但尽早取出内固定物，骺板厚度及单位柱内肥大细胞个数无显著变化。随着时间推移(内固定≥4周)，软骨细胞层逐渐变薄，且逐渐变为无序。肥大细胞体积、数量减少，细胞核逐渐出现固缩、碎裂，见图4。



2.7.2  特殊染色  术后2周(+2周)对照组透明软骨细胞染呈深蓝色。术后2周(+2周)实验组特染软骨细胞呈深蓝色；术后4周(+2周)实验组骺板软骨细胞层继续变薄，软骨肥大细胞数量减少，体积减小，局部骺软骨板骨桥形成，特染软骨细胞染呈蓝色；术后8周(+2周)骺板断裂，厚度变薄，软骨细胞层存在，细胞数量减少，软骨肥大细胞柱固缩深染；特染软骨细胞染呈浅蓝色，肥大细胞核固缩淡染；术后12周(+2周)骺板断裂，骺板软骨层变薄，软骨细胞减少、消失；特染软骨细胞染呈淡蓝色，肥大细胞少见，部分细胞核碎裂，见图5。

临床上儿童骨骺损伤颇为多见，虽然儿童骨骺损伤后有很强的塑形能力，可以选择保守治疗，但也有相当一部分病例需要手术治疗。关于骨骺损伤或骺板周围骨折的手术固定治疗，目前尚无有效确切固定方式。骨骺损伤如果不能及时得到有效治疗，会导致肢体畸形，其中25%-33%可导致肢体短缩或畸形，5%-10%出现生长障碍^[1]。在临床实践中，针对骨骺损伤及骺板周围骨折，有时候在固定骨折时为避免伤及骺线，常采用跨越骺板钢板内固定。庄云强等^[2]报道应用解剖钢板治疗肱骨近端骨骺分离伴干骺端骨折患儿12例，螺钉离骺线1 cm跨骨骺固定，取得良好疗效。王兆红等^[3]报道应用Y型锁定钢板跨骺板治疗股骨髁部骨骺损伤患者15例，可有效固定骨折及良好促进膝关节功能恢复。纪开亮等^[4]应用股骨近端锁定板治疗青少年股骨髁上骨折10例，取得较好效果。虽然目前跨骺板锁定钢板治疗儿童骨骺损伤及骺板周围骨折取得一定优势，但跨骺板内固定多长时间，以及何时取出内固定物，对骨骺生长抑制影响较小，一直是临床骨科医生困惑的问题。        

为探索跨骺板钢板内固定一段时间，取出内固定物，观察骺板抑制及其恢复情况。此次实验设计建立骨骺或骺板周围骨折模型，利用钢板跨越骺板、骺板周围骨折线固定，以对照组作为对照。经跨骺板固定一段时间后取出钢板。观察、测量不同时间点肢体生长长度、骺板厚度、肥大细胞形态等骺板抑制情况，从而为骨骺周围骨折及骺板损伤的临床治疗提供重要的实验依据和参考。

  中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年9月至2019年1月在哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  选择健康中国大耳白家兔32只，四五周龄，体质量450-550 g，由哈尔滨医科大学动物实验室提供(合格证编号：35701)。标准兔粮适应性饲养，自由饮水，室温恒定，间隔12 h照明，定期消毒、通风。

1.3.2  植入物介绍  见表1。

1.4  方法

1.4.1  造模方法  将兔按随机直抽样法分为4组，每组8只。选用耳缘静脉注射麻醉，异戊巴比妥钠2-5 mg/(kg·h)静脉维持(哈药集团有限公司，批号：H20122183)。取右股骨远端关节外侧切口，显露股骨远端骺板(银白色)及髁部，注意勿伤及骺板周围的软骨膜，制备右后肢股骨远端距骺板上方大约5 mm骨折模型。跨骺板置入1块锁定钢板，螺钉固定。冲洗，缝合切口，无菌敷料包扎。术前30 min给予头孢呋辛(珠海经济特区粤康医药有限公司，批号：H20110593)预防感染1次。

1.4.2  造模成功的标准  术中可见股骨髁部银白色骺线，于骺线上方约5 mm予以标记，保护周围软组织，在股骨外侧跨骺线及骨折置入钢板螺钉内固定，应用细线锯将股骨远端予以完全离端，造模成功。

1.5  主要观察指标  造模后2，4，8和12周4个时点取出钢板，继续观察2周。取出双侧股骨，测量离体股骨长度恢复情况。骺板行病理切片，常规苏木精-伊红染色和特殊染色。经光镜检后，将图像传入fpax系统，测量骺板厚度和单位柱内肥大细胞计数。将骨折模型作为实验组，以左股骨远端骺板作为对照。

1.6  统计学分析  观察股骨长度恢复情况、骺板厚度及单位柱内肥大细胞个数，连续型变量采用x(_)±s表示。实验组与对照组相关指标的比较采用两独立样本t 检验。应用SPSS 18.0统计软件处理，P < 0.05为差异有显著性意义。

3.1  骺板周围骨折动物模型建立的优势  骺板周围骨折动物模型主要在参照景金珠等^[5]、陈梓峰等^[6]、JANARV等^[7]制备方法的基础上，做适当调整后建立。设计跨骺板上5 mm制造骺板周围骨折模型，对研究儿童骨骺损伤或骺板周围骨折具有一定优势。最主要表现在跨骺板钢板固定一段时间后，取出内固定继续观察一段时间，了解骺板受抑制后软骨细胞修复情况。此动物模型虽然与儿童骺板常见损伤类型不完全一致，但仍然对研究骺板受抑制后骺软骨细胞修复过程具有非常重要的临床意义。          

3.2  钢板内固定对骺板软骨细胞的影响  当骺板周围骨折后，会启动再生修复机制，骨折端会产生大量细胞因子，包括转化生长因子β、胰岛素样生长因子及血管内皮生长因子等，它们在调节细胞增殖、分化以及生物学行为方面起着关键作用^[8]。张菁等^[9]研究发现，若对骺板适当压力一段时间，当压力解除后，发现骺板未见封闭，光镜下观察亦未见骺板及干骺端之间骨桥形成；若骺板压力过高，时间过长，骺板会出现闭合，骨骼纵向生长活动停止。近年研究发现，应用钢板跨骺板固定4周以上，与对照组相比会产生不同程度的影响，主要表现在股骨长度短缩畸形，骺板早闭，发育停滞等方面^[10-11]。

3.3  内固定一段时间后取出钢板，观察骺板软骨影响程度骺板软骨细胞共分为4层。骨骺损伤后，骺软骨的结构发生了一系列修复重建性改变^[12]，其中骺板软骨增生层和肥大细胞层的细胞增生、分化、代谢活跃。由于肥大细胞层细胞增大，基质稀少，形成了骺板中最薄弱部位，故受到压力时变化最为显著。燕铁斌等^[13]的研究结果发现，不同的损伤时间，可以引起骺板发生不同形状的裂隙或镜下骨折，其发生与损伤的压力和持续时间有关。关于钢板对骺板软骨细胞的压力与骺板生长之间的关系，多数人赞同骺板受压时间越长，骨骺板越狭窄，肥大层是较为敏感的标志。EHRLICH等^[14]用特制钉在幼鼠的股骨远端跨骺板固定，发现术后早期是刺激生长阶段，以后逐步出现肥大细胞分化减少，骺板进行性狭窄。他们认为刺激生长是创伤所为，而骺板狭窄可能是压力使分化的肥大细胞难以形成柱状排列所引起。

此次实验通过跨骺板钢板固定一段时间，取出内固定物后动态观察骺板变化情况。研究结果发现，在内固定2，4，8，12周，骺板始终受到压力作用，均出现不同程度的骺板厚度变化。但跨骺板内固定2周后，取出内固定继续观察2周。镜下见，单位柱内肥大细胞体积变小，个数无显著变化，细胞核与对照组无明显变化。细胞柱上段有丝分裂较为旺盛。测量股骨长度和骺板厚度与对照组比较，差异无显著性意义(P均> 0.05)。

跨骺板固定4周，取出内固定继续观察2周。骺板软骨细胞层变薄，软骨细胞层演变仍有一定的规律，肥大细胞数量变少，体积减小，部分细胞开始变性，局部骺软骨板骨桥形成，可见新生骨小梁。测量股骨长度、骺板厚度均比对照组小，单位柱内肥大细胞个数比对照组数量减少，差异有显著性意义(P均< 0.05)。

跨骺板固定8周，取出内固定继续观察2周。骺板软骨细胞层继续变薄，部分骺板层断裂，软骨细胞柱状排列顺序紊乱，肥大细胞数量减少，细胞核变性固缩。测量股骨长度短缩，骺板总厚度变薄，单位柱内肥大细胞数量减少，差异有显著性意义(P < 0.001)。

跨骺板固定12周，取出内固定继续观察2周。发现骺板断裂清晰可见，骺板软骨层很薄，软骨细胞呈岛状分布，局部软骨细胞减少、消失，肥大细胞较少见，细胞已经出现变性固缩坏死凋亡，细胞核碎裂，失去分化增殖能力。部分骨骺被致密板层骨小梁取代，骺板大部分闭合。测量股骨长度明显短缩，外翻畸形，骺板厚度很薄；单位柱内肥大细胞数量显著减少，差异有显著性意义(P < 0.001)。说明骺板软骨细胞受长时间钢板压力的限制，股骨长度和骺板厚度难以恢复到正常程度。

作者通过动物实验发现，若跨骺板内固定一段时间(≤2周)，及时取出钢板，骺板生长受压力限制作用及时解除，股骨长度、骺板厚度与肥大细胞的细胞核形态能够恢复至正常。若跨骺板固定较长时间(≥4周)，即内固定对骺板压力限制时间过长，虽然也及时取出钢板，但光镜下见骺板软骨中肥大细胞逐渐出现变性，核出现固缩，甚至碎裂。最终导致股骨纵向和横向发育阻滞，股骨髁部发育迟缓、停止，引起股骨远端关节面发育障碍、关节咬合不良等，远期出现肢体不等长、畸形等严重的并发症。

3.4  该实验对医学转化的意义  骺板软骨对骨骼的生长发育至关重要。综览相关文献，大多研究集中骨骺损伤的临床诊断和治疗方面^[15]，动物实验研究报道相当较少。临床上若儿童骨骺损伤治疗不当，容易在骨骺与干骺端之间形成骨桥，骺板早期闭合，造成肢体短缩、畸形，可导致儿童肢体生长发育迟缓、障碍，严重影响儿童身心健康^[16]。在选择手术治疗儿童骨骺损伤、骺板周围骨折或骺板病理骨折时，跨骺板钢板内固定是一种较为可靠的固定方式，但易产生骨骺生长抑制。一般认为，行跨骺板固定后，早期取出内固定物可最大程度上减轻对骺板软骨压力。可是取出内固定过早又会影响骨折端稳定性，以至于骨折再移位，出现肢体畸形愈合。洪加源等^[17]曾报道应用跨骨骺滑动钢板治疗13例儿童股骨远端骨折，从固定形式上已有较大创新，且平均7.5周全部达到骨性愈合，但骨折愈合后，骺板受抑制情况未能继续追踪。此次研究通过实验模型，为骨骺损伤提供可靠固定一段时间的前提下，取出内固定物，动态观察不同时间点骺板软骨损伤及其恢复情况，为骺板软骨细胞受压力限制影响产生可逆损害的时间界域，提供了一定的方向。对跨骺板钢板固定治疗骨骺损伤或骺板周围骨折患儿，在内固定一段时间后，何时取出内固定的时间区域上，提供了重要的参考和理论指导意义。目前，骨骺损伤的治疗仍然存有很多的不足和缺陷，随着生物医学材料学和组织工程学进一步发展，一定能够解决目前存在的不足和缺陷，造福于骨骺损伤的患儿。

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文题释义：
骨骺损伤：骺板软骨细胞共分为4层，骨骺损伤后骺软骨的结构发生了一系列修复重建性改变，其中骺板软骨增生层和肥大细胞层的细胞增生、分化、代谢活跃。由于肥大细胞层细胞增大，基质稀少，形成了骺板中最薄弱部位，故受到压力时变化最为显著。
骺板厚度变化率：为随着时间延长，骺板厚度逐渐增加，单位时间内骺板厚度增长的比率。主要是指不同时间节点，骺板厚度生长变化情况。用于观察跨骺板钢板内固定一段时间，取出内固定物后骺板厚度的生长变化情况。

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①建立动物实验模型：跨骺板钢板内固定一段时间取出内固定物，继续观察一段时间后骺板生长发育情况。②在不同时间节点，动态观察骺板中肥大细胞形态及骺板厚度变化率，了解跨骺钢板内固定对骺板抑制的后期影响。③动物实验模型虽与临床常见儿童骺板损伤类型不完全吻合，但仍对评价儿童骨骺损伤经跨骺板内固定取出时间节点具有较强的参考意义。

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