牛膝总皂苷调控Nampt/NAD/Sirt1轴诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1621

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (9): 1313-1318.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1621

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牛膝总皂苷调控Nampt/NAD/Sirt1轴诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

岳宗进，刘汝银，于露，彭晓艳，鲁花

河南省中医院脊柱科，河南省郑州市 450000

修回日期:2018-11-26 出版日期:2019-03-28 发布日期:2019-03-28
通讯作者: 刘汝银，硕士，副主任医师，河南省中医院脊柱科，河南省郑州市 450000
作者简介:岳宗进，男，1979年生，河南省台前县人，汉族，2009年河南中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱相关疾病的临床与科研研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项课题(2016ZY2001)，项目负责人：刘汝银

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposusk-like cells induced by Nampt/NAD/Sirt1 axis of Achyranthes bidentata Bl. saponins

Yue Zongjin, Liu Ruyin, Yu Lu, Peng Xiaoyan, Lu Hua

Department of Spine, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Revised:2018-11-26 Online:2019-03-28 Published:2019-03-28
Contact: Liu Ruyin, Master, Associate chief physician, Department of Spine, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Yue Zongjin, Master, Attending physician, Department of Spine, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the Special Project of Traditional Chinese Medicine Research in Henan Province, No. 2016ZY2001 (to LRY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
牛膝总皂苷：牛膝类药材属于苋科多年生草本植物，具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经及引血下行的功效，其三萜皂苷类化合物是主要活性成分，具有抗骨质疏松、保护关节等药理作用。
Nampt/NAD/Sirt1轴：NAD⁺作为沉默信息调控因子Sirt1的激活物，其含量严格调控Sirt1的活性，与Sirt1的反应速率直接相关，进而影响细胞的增殖和分化。NAD⁺是NAM经由Nampt的催化作用合成，Nampt直接参与并限制NAD⁺合成，影响细胞内NAD⁺的含量。

摘要
背景：研究表明，骨髓间充质干细胞可向髓核样细胞分化，但分化机制尚不明确。
目的：利用牛膝总皂苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，并探讨Nampt/NAD/Sirt1轴在其中的作用。
方法：取第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞，随机分成4组：①骨髓间充质干细胞组；②骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组；③骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组(烟酰胺单核苷酸为促NAD合成的外源性小分子物质)；④骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组(FK866为烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂)。连续诱导培养14 d，阿尔新蓝染色法检测细胞内糖胺多糖含量，RT-PCR检测髓核样细胞相关基因COL2、Aggrecan、KRT19和PAX1 mRNA表达，Western blot检测COL2的蛋白表达，Sirt1测定试剂盒检测Sirt1活性，NAD⁺/NADH试剂盒检测NAD⁺含量。

结果与结论：①与骨髓间充质干细胞组相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组能够使糖胺多糖、髓核样细胞相关基因表达、COL2蛋白表达、Sirt1活性、NAD⁺含量明显增加(P < 0.05)；②与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组糖胺多糖、髓核样细胞相关基因表达、COL2蛋白表达、Sirt1活性和NAD⁺含量增加(P < 0.05)；相反，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组上述指标均降低(P < 0.05)；③结果表明，牛膝总皂苷可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，Nampt/NAD/ Sirt1轴在其中发挥促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5197-5850(岳宗进)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 髓核样细胞, 牛膝总皂苷, 烟酰胺单核苷酸, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can differentiate into nucleus pulposus-like cells, but the mechanism of differentiation is not clear.
OBJECTIVE: To induce bone BMSCs into nucleus pulposus-like cells using Achyranthes bidentata Bl. saponins (ABS) and to explore the role of Nampt/NAD/Sirt1 axis in the differentiation of BMSCs.
METHODS: BMSCs were collected from Sprague-Dawley rats. Cells at passage 3 were divided into four groups: BMSCs group, BMSCs+ABS group, BMSCs+ABS+nicotinamide mononucleotide (an exogenous small molecule substance promoting NAD synthesis) group, BMSCs+ABS+FK866 (nicotinamide phosphoribosyltransferase inhibitor) group, in which the cells were induced for 14 days. Alcian blue staining was used to show the changes of glycosaminoglycan in the cells. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of COL2, Aggrecan, KRT19, Pax1. The protein expression level of COL2 was detected by western blot. The activity of Sirt1 was detected by Sirt1 assay kit and the content of NAD⁺ was measured by NAD⁺/NADH kit.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the BMSCs group, BMSCs+ABS group showed significant increases in the expression levels of glycosaminoglycan, Aggrecan, KRT19, and Pax1 (P < 0.05), and the protein expression levels of COL2, activity of Sirt1, and content of NAD⁺ were also significantly increased (all P < 0.05). (2) Compared with the BMSCs+ABS group, the above-mentioned indicators were significantly increased in the BMSCs+ABS+nicotinamide mononucleotide (P < 0.05); on the contrary, these indicators were all decreased significantly in the BMSCs+ABS+FK866 group (P < 0.05). To conclude, ABS could induce the differentiation of rat BMSCs into nucleus pulposus-like cells, in which the Nampt/NAD/Sirt1 axis might play a promotion role.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Lamiaceae, Nicotinamide Mononucleotide, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

岳宗进，刘汝银，于露，彭晓艳，鲁花. 牛膝总皂苷调控Nampt/NAD/Sirt1轴诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(9): 1313-1318.

Yue Zongjin, Liu Ruyin, Yu Lu, Peng Xiaoyan, Lu Hua. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposusk-like cells induced by Nampt/NAD/Sirt1 axis of Achyranthes bidentata Bl. saponins[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(9): 1313-1318.

图/表（结果） 4

2.1 各组培养基中糖胺多糖含量 见图1。在第1天，各组培养基中糖胺多糖含量差异无显著性意义。从第4-14天，与骨髓间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组糖胺多糖含量显著增加(P < 0.01)；与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比，加入烟酰胺单核苷酸组糖胺多糖含量显著增加(P < 0.01)，而加入FK866组糖胺多糖含量减少 (P < 0.05)。结果说明，随着培养时间的增加，加入牛膝总皂苷明显增加糖胺多糖含量，加入促进剂烟酰胺单核苷酸进一步增加糖胺多糖含量，而加入抑制剂FK866明显降低糖胺多糖含量。

2.2 RT-PCR检测各组髓核样细胞相关基因表达 与骨髓间充质干细胞组相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组中COL2 mRNA相对表达量显著增加(P < 0.01)，Aggrecan、KRT19和Pax1 mRNA的相对表达量增加(P < 0.05)；与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比，加入促NAD合成的外源性小分子物质烟酰胺单核苷酸，COL2、KRT19和Pax1 mRNA的相对表达量均增加(P < 0.05)，Aggrecan mRNA相对表达量显著增加(P < 0.01)；而加入抑制剂FK866，COL2、KRT19和Pax1 mRNA的相对表达量均减少(P < 0.05)，见图2。结果说明，牛膝总皂苷促进COL2、Aggrecan、KRT19和Pax1基因表达，加入烟酰胺单核苷酸进一步加强该促进效应，而加入FK866抑制该效应。

2.3 Western blot检测各组骨髓间充质干细胞COL2蛋白表达 与骨髓间充质干细胞组相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组的COL2表达量显著增加(P < 0.01)；与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比，加入烟酰胺单核苷酸组的COL2表达量显著增加(P < 0.01)，加入FK866组的COL2表达量减少(P < 0.05)，见图3。该结果说明，牛膝总皂苷促进COL2蛋白表达，加入烟酰胺单核苷酸进一步加强该促进效应，而加入FK866抑制该效应。

2.4 各组骨髓间充质干细胞NAD⁺含量 与骨髓间充质干细胞组相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组NAD⁺含量显著增加(P < 0.01)；与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比，加入烟酰胺单核苷酸组的NAD⁺含量增加(P < 0.05)，加入FK866组的NAD⁺含量减少(P < 0.05)，见图4。该结果说明，牛膝总皂苷促进NAD⁺含量增加，加入烟酰胺单核苷酸进一步加强该促进效应，而加入FK866抑制该效应，牛膝总皂苷可能通过调节Nampt/NAD/Sirt1轴促骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化。

2.5 各组骨髓间充质干细胞Sirt1活性 与骨髓间充质干细胞组相比，骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组的Sirt1活性升高(P < 0.05)；与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比，加入烟酰胺单核苷酸组的Sirt1活性升高(P < 0.05)，加入FK866组的Sirt1活性降低(P < 0.05)，见图5。该结果说明，牛膝总皂苷促进Sirt1活性增加，加入烟酰胺单核苷酸进一步加强该促进效应，而加入FK866抑制该效应，牛膝总皂苷可能通过调节Nampt/NAD/Sirt1轴促骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化。

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引言

椎间盘在承受压力时被压缩，除去压力后复原，具有“弹簧垫”缓冲压力的作用。随着年龄的不断增长，由于椎间盘退变加重引起腰痛、腰椎支撑功能下降、下肢疼痛麻木、间歇性跛行，严重者可导致尿便失禁及性功能障碍^[1-3]，是临床常见且危害性极大的疾病。现今临床治疗手段只能减缓腰部疼痛，却难以从根本上减轻椎间盘退变的进程。伴随着干细胞治疗研究手段出现^[4-5]，利用生物学手段修复已退变椎间盘已成为新的研究热点^[6-8]。

实验发现，椎间盘内细胞外基质减少是导致椎间盘退变的主要原因^[9-11]，常表现为髓核细胞数量减少^[12-15]。骨髓间充质干细胞可分化成多种细胞表型，成为转分化为髓核细胞的首选细胞^[16]，但骨髓间充质干细胞需在特定条件下实现转分化，且转分化效率不高^[17]。有研究发现，Nampt/NAD/Sirt1轴能够调控骨髓间充质干细胞定向分化^[18-19]。如何调控Nampt/NAD/Sirt1轴促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化成为亟需解决的问题。

牛膝类药材属于苋科多年生草本植物，具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经及引血下行的功效^[20]，其三萜皂苷类化合物是主要活性成分，具有抗骨质疏松、保护关节等药理作用。牛膝总皂苷在促进软骨细胞增殖方面也有大量报道^[21-22]，课题组前期研究发现其具有促骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的诱导作用。该实验旨在研究Nampt/NAD/Sirt1轴在牛膝总皂苷促骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化过程中的调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外探索性实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年4月至2018年4月在西安益劢新生物科技有限公司实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级3周龄SD大鼠20只，雌雄不限，体质量250-300 g，由郑州大学医学院实验动物中心提供，合格号：SCXK(豫)20090001。

1.3.2 实验药品 采用乙醇热回流及大孔吸附树脂方法提取制备牛膝总皂苷^[20^，^22]，含量大于50%。称取牛膝饮片1 kg(亳州市药通中药材有限公司提供)，略破碎，加入4倍体积的体积分数为75%乙醇，水浴加热，回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，称质量。采用大孔吸附树脂作为固定相，依次用10倍柱体积的水、体积分数为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液以4 mL/min的流速进行梯度洗脱，收集50%洗脱液，经回流浓缩，浸膏称质量。采用400-800 nm的吸收光谱测定牛膝总皂苷的含量^[23]。

1.3.3 实验试剂 DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、Ⅱ型胶原蛋白酶、Alcian Blue、DMEM培养基(高糖)、SYBRR Select Master Mix、胎牛血清(Sigma公司)；HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒(杭州诺扬生物技术有限公司)；GREENspin细胞RNA快速提取试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；引物合成(上海生工生物)；总蛋白提取试剂盒、Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific公司)；抗COL2抗体、Goat Anti-Rabbit IgG、GAPDH多克隆抗体、HRP(Abcam公司)；SIRT1检测试剂盒(Sigma公司)；NAD/NADH检测试剂盒(Biovision公司)；烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂FK866(北京福珺生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养、诱导 将实验用大鼠处死后，于体积分数为75%乙醇中浸泡1 h。无菌条件下取出大鼠股骨和胫骨，剪断两端后将骨髓腔暴露，用胎牛血清分3次冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心待用，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，细胞密度为1×10⁶/cm²。待细胞增殖至90%汇合时，按1∶3传代。采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞，反复贴壁纯化，取第3代细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，接种于6孔板中，并按以下分组进行诱导：①骨髓间充质干细胞组(对照组)；②骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组；③骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组；④骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组。将上述4组细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养14 d，其中牛膝总皂苷的终浓度约为10 μmol/L，烟酰胺单核苷酸的终浓度为2 μmol/L，FK866的终浓度为10 μmol/L。

1.4.2 阿尔新蓝法检测培养基内糖胺多糖含量 收集第1，4，7，10，14天的培养基，制作硫酸软骨素浓度与吸光度的标准曲线，采用阿尔新蓝法检测培养基内糖胺多糖含量。

1.4.3 RT-PCR检测髓核样细胞相关基因表达 取诱导培养14 d后的各组细胞，按试剂盒要求提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，以cDNA作为模板进行Realtime PCR 反应。引物序列见表1，根据试剂盒要求进行定量分析。

1.4.4 Western blot检测COL2蛋白表达 诱导培养14 d后，提取各组细胞总蛋白，并溶解于SDS蛋白上样缓冲液。每组上样蛋白量为40 μg(15-20 μL)，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、TBST室温封闭1 h，一抗COL2多克隆抗体(稀释比例1∶100) 4 ℃孵育过夜，以GAPDH做为内参(稀释比例1∶2 000)，洗膜后采用二抗(稀释比例1∶4 000)室温孵育2 h，曝光、定影后晾干拍照，Image J软件分析。

1.4.5 Sirt1活性测定试剂盒检测Sirt1活性 诱导培养14 d后，按总蛋白提取试剂盒要求提取蛋白，根据Sirt1检测试剂盒中标准品制作标准曲线。根据标准曲线，计算出Sirt1的活性。

1.4.6 NAD/NADH测定试剂盒检测NAD⁺含量 诱导培养14 d后，收集各组细胞，根据NAD/NADH测定试剂盒中标准品制作标准曲线，根据标准曲线，计算出NAD⁺含量。

1.5 主要观察指标 ①各组培养基中糖胺多糖含量；②各组细胞中COL2、Aggrecan、KRT19和Pax1 mRNA表达；③各组细胞中COL2蛋白表达；④各组细胞中NAD⁺含量和Sirt1活性。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

随着椎间盘退变程度的加重，髓核细胞的数量逐渐减少且伴随生物活性降低，导致细胞外基质合成减少，造成髓核异变。利用组织工程学手段修复退变椎间盘，通过定向分化移植髓核样细胞，补充椎间盘中细胞外基质，成为恢复椎间盘功能的重要内容之一。已有研究表明，骨髓间充质干细胞和髓核样细胞共培养可促进其向髓核样细胞分化^[24-25]，但髓核细胞生长缓慢，不易培养，且分化作用机制仍不清楚。

骨髓间充质干细胞具有多细胞表型分化能力，根据所处微环境不同，即可分化为该条件下所需细胞。研究骨髓间充质干细胞向髓核样细胞定向分化、增殖，对治疗包括椎间盘退变在内的多种腰椎疾病具有重要的临床意义^[25]。骨髓间充质干细胞的定向分化受转录因子、微环境及信号转导通路等多方面作用^[26]。Nampt/NAD/Sirt1轴信号转导通路是调控干细胞包括骨髓间充质干细胞增殖、分化的重要通路之一^[27]。Imai提出的“NAD world”理论中指出^[28]：细胞增殖和分化明显受到NAD⁺含量的影响，NAD⁺作为沉默信息调控因子Sirt1的激活物，其产量严格调控Sirt1的活性，与Sirt1的反应速率直接相关，进而影响细胞的增殖和分化。NAD⁺是尼克酰胺经由烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化作用合成^[27]，烟酰胺磷酸核糖转移酶直接参与并限制NAD⁺合成，影响细胞内NAD⁺的含量。细胞内NAD⁺含量由烟酰胺磷酸核糖转移酶决定，而NAD⁺水平进一步对Sirt1活性产生影响^[29]。细胞增殖和分化的调控过程，是由烟酰胺磷酸核糖转移酶作为整个反应启动因子，终端产生Sirt1，影响下游通路对细胞进行调控^[30]。哺乳动物中，烟酰胺磷酸核糖转移酶是影响NAD⁺生物合成及Sirt1活性的关键因素，Nampt/NAD/Sirt1轴作为调控细胞代谢通路之一，对细胞代谢、衰老、周期的维持起到关键作用。烟酰胺单核苷酸作为参与催化合成NAD⁺的关键物质，与NAD⁺的含量和Sirt1活性正相关，促进骨髓间充质干细胞分化；而烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂FK866通过抑制尼克酰胺的合成，抑制Sirt1活性，而减少骨髓间充质干细胞的分化。在软骨细胞和髓核样细胞中COL2和Aggrecan基因均能表达，虽然不能用来区分二者表型，但可评估细胞活性，而KRT19和PAX1作为髓核样细胞的特有基因，可用来判断骨髓间充质干细胞分化后的细胞谱系。

实验在体外运用牛膝总皂苷诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，检测到Nampt/NAD/Sirt1轴关键元件NAD⁺含量和Sirt1活性相对于对照组明显增加，说明牛膝总皂苷诱导骨髓间充质干细胞成髓核样细胞分化过程中经典Nampt/NAD/Sirt1轴被激活。添加NAD合成的外源性小分子物质烟酰胺单核苷酸激活后，检测到NAD⁺含量和Sirt1活性明显提高，表明Nampt/NAD/Sirt1轴进一步被活化，同时髓核样细胞标记基因COL2、Aggrecan、KRT19和Pax1表达水平均明显增加；添加Nampt/NAD/Sirt1轴抑制剂FK866后，NAD⁺含量和Sirt1活性明显下降，相应的髓核样细胞标记基因表达水平均明显下降，说明牛膝总皂苷诱导骨髓间充质干细胞成髓核样细胞分化过程中，激活Nampt/NAD/Sirt1轴促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，且二者之间发挥着独立作用。

综上所述，体外细胞实验表明，牛膝总皂苷能够诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化，其分化过程可能受Nampt/NAD/Sirt1轴调控。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

牛膝总皂苷调控Nampt/NAD/Sirt1轴诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposusk-like cells induced by Nampt/NAD/Sirt1 axis of Achyranthes bidentata Bl. saponins

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