骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1522

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
腱-骨愈合：指肌腱与骨道之间的生长愈合，以及相应的组织改变过程，其特征性结构为移行的纤维软骨带；腱-骨愈合方式大体上可分为直接愈合和间接愈合。
骨形态发生蛋白：是广泛存在于骨基质中的酸性多肽，具有明显的诱导成骨活性。实验中应用的骨形态发生蛋白2是研究最广泛且诱导成骨效果最明显的生长因子，在骨折、骨创伤、骨缺损等基础与临床试验中都显示了良好的效果，但是其单独应用存在半衰期短、降解过快的问题。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶联合应用可提高前交叉韧带重建后的早期腱-骨界面断裂强度与刚度，促进移植物与骨隧道早期愈合。
目的：探讨骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶对前交叉韧带重建术后腱-骨愈合的影响。
方法：将腺病毒载体Ad-GFP-骨形态发生蛋白2转染至骨髓间充质干细胞，48 h后检测GFP基因表达及骨形态发生蛋白2表达。将54只新西兰大白兔(购买于重庆市医学实验动物中心)随机分为空白组、实验组、对照组，每组18只，均建立前交韧带重建模型，实验组将基因转染48 h的骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶混合，注射至腱-骨界面；对照组将未转染的骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶混合，注射至腱-骨界面；空白组未注射任何材料。术后第4，8，12周分别获取股骨-移植肌腱-胫骨标本，进行组织学检测与生物力学检测。
结果与结论：①转染48 h后，荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光，转染效率为(86.1±6.3)%；SP免疫组织化学检测细胞胞浆内骨形态发生蛋白表达阳性；Western-blot检测可见骨形态发生蛋白2阳性表达条带；②苏木精-伊红染色显示，实验组、对照组腱-骨愈合效果明显优于空白组，实验组腱-骨愈合效果优于对照组；③生物力学检测显示，实验组、对照组的最大载荷、刚度均强于空白组(P < 0.05)，实验组的最大载荷、刚度均强于对照组(P < 0.05)；④结果表明，骨形态发生蛋白2进一步增强了骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7055-4875(朱乐全)

关键词: 前交叉韧带重建, 骨形态发生蛋白2, 骨髓间充质干细胞, 纤维蛋白胶, 腱-骨愈合, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The combination of bone marrow mesenchymal stem cells and fibrin glue can improve the early rupture strength and stiffness of the tendon-bone interface after anterior cruciate ligament reconstruction, and promote the early healing of graft and bone tunnel.
OBJECTIVE: To explore the effect of bone morphogenetic protein 2 transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with fibrin glue on the tendon-bone healing after the reconstruction of the anterior cruciate ligament.
METHODS: Adenovirus vector Ad-GFP-bone morphogenetic protein 2 was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells, and the expressions of GFP gene and bone morphogenetic protein 2 were detected after 48 hours. Fifty-four New Zealand white rabbits purchased from the Medical Animal Center of Chongqing were randomly divided into blank group, experimental group and control group, with 18 rats in each group. The anterior cruciate ligament reconstruction model was established in each rat. In the experimental group, after 48 hours of transfection, the transfected bone marrow mesenchymal stem cells were mixed with fibrin glue and injected into the tendon-bone interface. In the control group, non-transfected bone marrow mesenchymal stem cells were mixed with fibrin glue and injected into the tendon-bone interface. In the blank group, no treatment was given. After 4, 8, 12 weeks, the femur-tendon-tibia specimens were taken for histological and biomechanical examinations.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After transfection of 48 hours, the cells expressed green fluorescence under the fluorescence microscope, and the transfection efficiency was (86.1±6.3)%. The expression of cytoplasmic bone morphogenetic protein was positive as shown by SP immunohistochemical test, and the positive band of bone morphogenetic protein 2 was detected by western blot. (2) Findings from the hematoxylin-eosin staining showed best better tendon-bone healing in the experimental and control group than the blank group, and the tendon-bone healing was further better in the experimental group than in the control group. (3) The biomechanical results showed that the maximum load and stiffness were ranked as follows: the experimental group > control group > blank group (P < 0.05). Therefore, bone morphogenetic protein 2-transfected bone marrow mesenchymal stem cells combined with fibrin glue can further enhance the tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction.

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Key words: Anterior Cruciate Ligament, Bone Morphogenetic Proteins, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Fibrin Tissue Adhesive, Tissue Engineering

中图分类号:

朱乐全，卢剑华，冉俊岭，杨卫保，王辉. 骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(1): 30-34.

Zhu Lequan, Lu Jianhua, Ran Junling, Yang Weibao, Wang Hui. Bone morphogenetic protein 2 transfected bone marrow mesenchymal stem cells and fibrin glue to promote tendon-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(1): 30-34.

图/表（结果） 1

2.1 基因转染效果 转染48 h后，荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光，见图1，提示GFP阳性表达，转染效率为(86.1±6.3)%；SP免疫组织化学检测显示，细胞胞浆内可见棕黄色染色，见图2，即骨形态发生蛋白2表达阳性；Western-blot检测显示，转染骨髓间充质干细胞可见较强骨形态发生蛋白2表达条带，见图3。

2.2 实验动物数量分析 实验选用54只新西兰大白兔，实验组与对照组造模过程中如有动物死亡，则按照实验方法重新造模，将动物补齐，最终保证每组有18只新西兰大白兔。

2.3 实验动物大体观察结果 实验组、对照组所有兔膝关节切口均愈合，重建的前交叉韧带完整，饮食、活动及精神状态正常，未发生异位骨化。

2.4 苏木精-伊红染色结果 见图4。

空白组术后第4周，腱-骨界面结合不紧密，其内主要为成纤维细胞及一些炎性细胞；术后第8周，腱-骨界面结合仍不紧密，可见少量无序排列的胶原纤维及少量血管生成；术后第12周，腱-骨界面出现大量排列不规则的胶原纤维，并聚集成束。

对照组术后第4周大部分腱-骨界面局部结合较紧密，其内主要为新生的肉芽组织，可见较多不规则排列的胶原纤维，少量血管出现于肌腱内；术后第8周，腱-骨界面结合较4周时紧密，大量规则排列的胶原纤维集结成束，并沿隧道长轴排列；术后第12周，腱-骨界面可见少量规则排列的软骨细胞。

实验组术后第4周腱-骨界面结合紧密，可见少量排列不规则的软骨细胞，少量骨质长入肌腱内，同时可见大量胶原纤维；术后第8周，腱-骨界面可见大量排列规则的软骨细胞；术后第12周，腱-骨界面有大量软骨生成，出现胶原纤维-软骨细胞移行带变化，形成了韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨的结构，接近正常前交叉韧带结构。

2.5 生物力学检测结果 随着术后时间的延长，各组最大载荷与刚度均呈现逐渐增高趋势；相同时间点下，实验组、对照组最大载荷与刚度均高于空白组，并且实验组最大载荷与刚度均高于对照组(P < 0.05)，具体结果见图5。

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引言

前交叉韧带在维持膝关节稳定性方面起着重要作用，一旦其受损，自愈能力极差，需进行前交叉韧带重建治疗，但腱-骨界面愈合过程复杂且缓慢，愈合强度较差，直接影响了患者术后早期康复，进而影响治疗效果^[1-3]。因此，如何促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合过程，成为医学领域的热门研究问题。

相比于单纯肌腱或骨之间的愈合，腱-骨愈合是一个极其复杂的生物学过程，受很多因素影响，例如手术方式、移植材料及内固定物等^[4-6]。广大研究者着眼于这些影响因素，运用间充质干细胞、富血小板血浆复合物、骨膜包裹肌腱、诱导成骨、生长因子、体外冲击波等方法来改善腱-骨愈合，都取得了一些成果^[7-12]。但是随着研究的深入，研究者发现上述方法均不完善。利用组织工程技术促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合成为新的研究方向。

骨髓间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，已被广泛应用于重建多种组织和器官的结构与功能，成为组织工程中较为理想的种子细胞^[13-14]。将骨髓间充质干细胞移植至前交叉韧带重建的腱-骨界面，其可促进腱-骨界面细胞的增殖，促进愈合过程^[15-16]。纤维蛋白胶是一种临床广泛应用的功能性材料，具有良好的骨传导性、生物相容性及可降解性，其作为生物基质已被用于组织工程骨与软骨研究中^[17-18]。已有研究将骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶联合应用于前交叉韧带重建的动物模型中，发现二者联合应用可提高前交叉韧带重建后的早期腱-骨界面断裂强度与刚度，促进移植物与骨隧道早期愈合^[19]。

骨形态发生蛋白是广泛存在于骨基质中的酸性多肽，具有明显的诱导成骨活性，骨形态发生蛋白2是其中研究最广泛且诱导成骨效果最明显的生长因子^[20-21]。为进一步增强骨髓间充质干细胞/纤维蛋白胶复合物的促腱-骨愈合效果，此次研究将腺病毒载体Ad-GFP-骨形态发生蛋白2转染至骨髓间充质干细胞，联合纤维蛋白胶用于前交叉韧带重建腱-骨界面。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机分组，动物观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年2至9月在重庆市黔江中心医院实验室完成。

1.3 材料 兔骨髓间充质干细胞(赛业生物科技有限公司，细胞纯度为89%)；冻干纤维蛋白胶(华兰生物工程股份有限公司，国药准字S20020084，活性成分由冻干人纤维蛋白原、冻干人纤维蛋白原溶解液、冻干人凝血酶、冻干人凝血酶溶解液组成)；腺病毒载体Ad-GFP-骨形态发生蛋白2由上海汉恒生物科技有限公司构建、鉴定后提供；胎牛血清(江苏科特生物科技有限公司)；α-MEM培养基(上海慧颖生物科技有限公司)；鼠抗兔骨形态发生蛋白2单克隆抗体(艾美捷科技有限公司)；免疫组织化学SP试剂盒(KL-D3876，上海康朗生物科技有限公司)；荧光显微镜(LWD300-38LFT，北京测维光电仪器厂)。

实验动物：选用健康成年雄性新西兰大白兔54只，SPF级，体质量(2.5±0.3) kg，购买于重庆市医学实验动物中心。

1.4 实验方法

1.4.1 骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞 将兔骨髓间充质干细胞以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板内，加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养。

取对数生长期的骨髓间充质干细胞，弃掉培养液，PBS清洗2次，以感染复数MOI=150加入2 mL含Ad-GFP-骨形态发生蛋白2的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数5%二氧化碳培养箱内，24 h后弃掉培养基，以PBS清洗1次，加入含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基培养。

1.4.2 基因转染效果检测

荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达：转染48 h后，荧光显微镜下观察GFP表达情况。每个样本随机选取3个视野，观察GFP表达阳性细胞与同视野下存活的细胞总数，计算细胞转染效率。

免疫组织化学观察骨形态发生蛋白2表达：转染48 h后，胰酶消化细胞，制备细胞爬片，多聚甲醛固定，严格按照免疫组织化学SP试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封固，镜下观察细胞被染成棕黄色为阳性表达。

Western-blot检测骨形态发生蛋白2表达：转染48 h后，PBS清洗细胞，加入细胞裂解液，利用BCA法检测蛋白浓度，随后进行10%SDS-PAGE电泳分离，转膜，封闭，加入鼠抗兔骨形态发生蛋白2单克隆抗体，4 ℃孵育1 h；加入辣根过氧化酶标记的鼠抗兔抗体孵育1 h，洗膜，加入TMB显色1 min，胶片曝光显影，以β-actin为内参，观察蛋白表达。

1.4.3 纤维蛋白胶的配制 将冻干人纤维蛋白原溶解液注入冻干人纤维蛋白原瓶内，得冻干人纤维蛋白原溶液；将冻干人凝血酶溶解液注入冻干人凝血酶瓶内，得冻干人凝血酶溶液，配制2种溶液时的环境温度均为37 ℃。将2种溶液混合即得纤维蛋白胶，可于使用4 h前制备。

1.4.4 实验动物分组 取54只新西兰大白兔，随机分为空白组、实验组、对照组，每组18只，再分为术后第4，8，12周3个时间点，每组每个时间点6只。空白组仅建立前交叉韧带重建模型，不注射任何材料；实验组建立前交叉韧带重建模型，并以骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶修复；对照组建立前交叉韧带重建模型，并以骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶修复。

1.4.5 前交叉韧带重建模型及分组处理 取各组新西兰大白兔，采用30 g/L戊巴比妥钠1 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，麻醉后常规消毒，于跟腱内侧作一纵行切口，切取趾长屈肌腱，然后将肌腱对折，肌腱两游离端以无菌缝线编织缝合，折叠处用无菌丝线穿过后备用。于膝关节髌内侧做一长约2 cm的纵行切口，依次切开皮肤及皮下组织，暴露膝关节，使髌骨向外侧脱位，清除髌下脂肪垫，使前交叉韧带充分显露，随后切除前交叉韧带股骨端，保留胫骨端；采用克氏针分别钻取胫骨及股骨骨隧道，使股骨骨隧道长度约为6 mm；将趾长屈肌腱由下骨隧道外口穿过胫骨及股骨骨隧道，将穿出股骨端的肌腱反复打结，固定于股骨骨隧道皮质外，缝合于周围软组织上，屈膝30°位收紧肌腱，通过胫骨结节下骨桥固定胫骨端肌腱，收紧打结。冲洗关节腔，实验组取0.2 mL骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞悬液，细胞浓度为5×10⁹ L^-1，与2 mL纤维蛋白胶混合均匀，注射至骨道与移植肌腱的间隙内；对照组取0.2 mL未转染骨髓间充质干细胞悬液，细胞浓度为5×10⁹ L^-1，与2 mL纤维蛋白胶混合均匀，注射至骨道与移植肌腱的间隙内。复位髌骨，逐层间断缝合切口，患肢不制动，切口不包扎。术前及术后3 d肌注青霉素预防感染。

1.4.6 术后取材 术后第4，8，12周，每组每个时间点各取6只兔，麻醉后处死，取双后肢膝关节，剔除周围软组织，胫骨端与股骨端各保留3 cm长度，获取股骨-移植肌腱-胫骨标本，将左侧标本用于组织学检测，右侧标本用于生物力学检测。

1.5 主要观察指标

1.5.1 组织学观察腱-骨界面组织愈合情况 将股骨-移植肌腱-胫骨标本置于多聚甲醛溶液中固定24 h，10% EDTA常温脱钙2周；蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片机切片，切片厚度5 μm，进行苏木精-伊红染色，观察腱-骨界面组织愈合情况。每个样本随机选择3个视野进行观察。

1.5.2 生物力学检测腱-骨界面的最大载荷与刚度 包埋股骨端与胫骨端标本，固定于生物力学试验机夹具上，先进行2 N的预载荷验。游标卡尺测量肌腱长度，进行拉断实验，加载速度1 mm/s，直至肌腱断裂或拔出，得出腱-骨界面的最大载荷与刚度。

1.6 统计学分析 数据处理采用SPSS 21.0软件进行，计量资料用x(_)±s表示，各时间点的最大载荷与刚度两组间比较进行t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨形态发生蛋白2在骨折、骨创伤、骨缺损等基础与临床试验中都显示了良好的效果，但是其单独应用存在半衰期短、降解过快的问题^[22-23]。目前可采用缓释载体技术与基因工程技术解决此问题，两种方法均可最大限度地发挥骨形态发生蛋白2的生物学作用^[24-25]。实验采用GFP作为报道基因，利用腺病毒载体将骨形态发生蛋白2转染至骨髓间充质干细胞中，并且获得了较高的转染效率，为后续实验打下了基础。此外，由于关节内滑液与关节活动的影响，也将导致骨形态发生蛋白2的流失。因此，研究选择了纤维蛋白胶作为载体，以利于骨形态发生蛋白2持续稳定释放。

研究模拟人体前交叉韧带重建手术建立了兔前交叉韧带重建模型，然后将Ad-GFP-骨形态发生蛋白2转染的骨髓间充质干细胞与纤维蛋白胶混合，注射在腱-骨界面，于术后不同的时间点进行组织学观察与生物力学检测，观察腱-骨愈合效果，并与未转染骨髓间充质干细胞基因联合纤维蛋白胶治疗效果进行了比较。组织学检测显示，术后第4周，空白组移植物与骨隧道间主要由成纤维细胞与一些炎性细胞填充，所以腱-骨界面连接不牢固。目前认为，移植肌腱在骨隧道内的愈合过程主要经历3个阶段，分别为界面纤维连接、新骨形成并长入肌腱内及局部塑形改造^[26-27]。空白组在术后第8周可见少量的胶原纤维，腱-骨界面连接未见明显进展，直到术后第12周才见大量无序排列的胶原纤维，腱-骨界面连接有了改善。与空白组的表现不同，对照组术后4周就已经形成了不规则排列的胶原纤维，所以腱-骨界面连接牢固，并且随着时间的延长，移植物与骨隧道间出现少量规则排列的软骨细胞，腱-骨界面连接更加牢固。分析骨髓间充质干细胞在其中发挥了较大作用，推测其可能的作用机制主要有两点：其一是骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞，促进了腱-骨界面愈合；其二是骨髓间充质干细胞分化为肌腱细胞，促进腱-骨界面愈合，但是具体的作用机制还需要进一步的研究^[19]。而实验组在术后第4周就获得了连接牢固的腱-骨界面，主要是由于有新骨生成并长入了肌腱内，术后第12周更是出现了胶原纤维-软骨细胞移行带变化，形成了接近正常韧带的韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨结构，腱-骨界面速度明显快于空白组及对照组，说明骨形态发生蛋白在其中发挥了明显的生物学效应，与其可能通过促进骨髓间充质干细胞分化为骨细胞，进一步促进了前交叉韧带重建后的腱-骨界面愈合速度，与以往研究结果一致^[28-29]。

另外，力学因素在腱-骨界面愈合过程中也具有举足轻重的作用^[30-32]。生物力学检测显示，3组标本的最大载荷与刚度均随着时间的延长逐渐增加，但是实验组术后不同时间点的最大载荷与刚度均明显强于其余两组，并且差异有显著性意义，说明骨形态发生蛋白2进一步增强了骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合强度，其具体机制还需要深入的研究。

综合以上结果发现，骨形态发生蛋白2进一步增强了骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白胶促进前交叉韧带重建后的腱-骨愈合效果。但是实验周期较短，下一步将增加实验观察周期，以进一步明确其作用效果与作用机制。

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