非接触共培养条件下软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0088

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (4): 548-552.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0088

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非接触共培养条件下软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化

李威1，袁峰2，沃金1，张腾1，高鹏1

1徐州医科大学，江苏省徐州市 221000；2徐州医科大学附属医院，江苏省徐州市 221000

收稿日期:2017-08-24 出版日期:2018-02-08 发布日期:2018-02-08
通讯作者: 袁峰，博士，主任医师，教授，徐州医科大学附属医院，江苏省徐州市 221000
作者简介:李威，男，1990年生，江苏省宿迁市人，汉族，2017年徐州医科大学毕业，硕士，主要从事骨外科学临床与基础方面的研究。
基金资助:
江苏省“科教兴卫”医学重点建设人才项目(H201129)

Indirect co-culture with chondrocytes induces periosteum-derived cells to differentiate into chondrocytes

Li Wei1, Yuan Feng2, Wo Jin1, Zhang Teng1, Gao Peng1

1Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China; 2the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China

Received:2017-08-24 Online:2018-02-08 Published:2018-02-08
Contact: Yuan Feng, M.D., Chief physician, Professor, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
About author:Li Wei, Master, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Jiangsu Provincial Key Talent Training Program in Medicine, No. H201129

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
非接触共培养：通过Tanswell小室放入培养板进行细胞培养，该小室有一层带有微孔的具通透性的聚碳酸酯膜，孔径≤4.0 μm，允许生物大分子自由通过，而共培养的两种细胞分别位于膜的两侧，这种细胞间不进行直接接触的培养方式，有利于观察细胞的生长状态，探究细胞间相互作用的机制。
骨膜：骨膜是被覆在除关节以外的骨表面上坚固的含有微血管的结缔组织包膜，由外部的纤维层和内部的形成层组成。在骨端和肌腱附着部位，非常致密地附着在骨上。其他部位的骨膜厚，容易从骨上剥离。

摘要
背景：在非接触共培养条件下，软骨细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞。骨膜细胞作为软骨修复的种子细胞，其与软骨细胞共培养的作用及影响鲜有研究。
目的：通过软骨细胞与骨膜细胞非接触共培养，利用软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化。
方法：采用胰酶、Ⅱ型胶原酶消化法分离兔关节软骨细胞；组织块培养法分离兔骨膜细胞。分别取第2代软骨细胞和骨膜细胞，按1∶1比例通过transwell培养板进行非接触共培养作为实验组，单纯骨膜细胞培养作为对照组。培养2周后，倒置显微镜观察2组细胞形态; Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色检测2组细胞的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成；RT-PCR检测2组细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1和性别决定区Y框蛋白9 mRNA表达水平。
结果与结论：①培养2周后，实验组共培养骨膜细胞逐渐变为类圆形软骨细胞形态，对照组骨膜细胞仍为长梭形；②实验组共培养骨膜细胞的Ⅱ型胶原免疫组化、甲苯胺蓝染色均为阳性，对照组为阴性；③RT-PCR结果显示，实验组共培养骨膜细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1、性别决定区Y框蛋白9 mRNA相对表达量明显高于对照组；④结果提示，非接触共培养条件下，软骨细胞可以诱导骨膜细胞向软骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-5371-589X(李威)

关键词: 骨膜细胞, 软骨细胞, 非接触共培养, 诱导, 分化, 微环境, 基质, 组织构建, Ⅱ型胶原, 蛋白聚糖

Abstract:

BACKGROUND: Under indirect co-culture conditions, chondrocytes can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into chondrocytes. Osteocytes are the seed cells of chondrocytes, but co-culture of osteocytes with chondrocytes is rarely reported.
OBJECTIVE: To induce the chondrogenic differentiation of periosteum-derived cells (PDCs) by indirect co-culture with chondrocytes.
METHODS: Chondrocytes were isolated from the rabbits by trypsin and collagenase II digestion. Rabbit PDCs were obtained by the explants culture method. Passage 2 chondrocytes and PDCs underwent indirect co-culture at 1:1 in Transwell system as experimental group. PDCs cultured alone were as control group. After 2 weeks of culture, the cellular morphological changes were observed by inverted contrast phase microscope. The expression levels of collagen type II and proteoglycan were detected by collagen type II immunohistochemistry and toluidine blue staining. The mRNA expression levels of proteoglycan, collagen type II and SRY-related protein-9 were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: After 2 weeks of culture, PDCs in the experimental group were gradually transformed to chondrocyte-like cells, while PDCs in the control group still remained long spindle-shaped. Collagen type II immunohistochemistry staining and toluidine blue staining were positive in the experimental group, while the results were negative in the control group. Additionally, RT-PCR results indicated that the relative mRNA expression levels of proteoglycan, collagen type II and SRY-related protein-9 in the experimental group were significantly higher than those in the control group. Therefore, chondrocytes can induce PDCs to differentiate into chondrocytes under indirect co-culture conditions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chondrocytes, Periosteum, Cell Differentiation, Collagen Type II, Proteoglycans, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李威，袁峰，沃金，张腾，高鹏. 非接触共培养条件下软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(4): 548-552.

Li Wei1, Yuan Feng2, Wo Jin1, Zhang Teng1, Gao Peng1. Indirect co-culture with chondrocytes induces periosteum-derived cells to differentiate into chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(4): 548-552.

图/表（结果） 2

2.1 骨膜细胞的形态学观察骨膜组织块培养三至四天后，原代骨膜细胞从骨膜组织块周围长出，细胞呈短梭形，贴壁性良好。换液传代后，骨膜细胞形态更加均一，呈长梭形，细胞呈平行或旋涡状生长，增殖迅速，无接触抑制现象(图1)。

2.2 软骨细胞的形态学观察原代软骨细胞接种12 h开始贴壁，细胞形态多为圆形、多角形，48 h后迅速增殖，第五至六天软骨细胞融合达90%。传代后，软骨细胞形态良好，为不规则卵圆形，增殖迅速，呈“铺路石样”排列，三至四天可达90%融合(图2)。

2.3 各组细胞的形态培养2周后，对照组骨膜细胞仍以长梭形细胞为主，细胞呈平行或旋涡状生长(图3A)。实验组骨膜细胞逐渐由长梭形变为多角形、类圆形，随着培养天数增加多角形、类圆形细胞明显增多，呈聚集生长，形态接近软骨细胞(图3B)。

2.4 甲苯胺蓝染色检测2组细胞蛋白聚糖合成单纯骨膜细胞培养2周后，甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖合成为阴性(图4A)。软骨细胞与骨膜细胞共培养2周后，甲苯胺蓝染色检测下层6孔板内骨膜细胞蛋白聚糖合成为阳性(图4B)。
2.5 细胞免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原合成单纯骨膜细胞培养2周后，细胞免疫组化染色检测Ⅱ型胶原合成为阴性(图5A)。软骨细胞与骨膜细胞共培养2周后，细胞免疫组化染色检测Transwell 6孔板底部骨膜细胞Ⅱ型胶原合成为阳性(图5B)。

2.6 RT-PCR检测2组细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1、SOX-9 mRNA的表达培养2周后，实验组中骨膜细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1、SOX-9 mRNA高度表达，明显高于单纯骨膜细胞培养的对照组，且2组差异有显著性意义(P < 0.01)，见图6及表1。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点于2015年6月至2016年4月在徐州医科大学中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物新西兰大白兔4只，6月龄，雌雄不限，由徐州医科大学动物中心提供。

1.3.2 实验用主要试剂和仪器 DMEM/F12(Thermo公司，美国)；青/链霉素(碧云天生物技术研究所)；胎牛血清(杭州天杭生物科技公司)；Transwell共培养板(美国Corning公司)；Ⅱ型胶原酶(碧云天生物技术研究所)；胰蛋白酶(碧云天生物技术研究所)；兔超敏两步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；甲苯胺蓝(合肥博美生物科技公司)；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-PCR反应试剂(北京天根生化科技有限司)；RT-PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；YMT-Z型倒置显微镜(Olympus，日本)；体积分数5%CO2细胞培养箱(Thermo公司，美国)；DYY-10C型电泳仪 (北京市六一仪器厂)；PTC-200型PCR仪(美国MJ公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔关节软骨细胞分离、培养取6月龄新西兰大白兔，10%水合氯醛经耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下取兔双侧膝关节软骨，用含抗生素(5%青链霉素)的PBS清洗3遍，将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块，加入等体积0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化30 min。1 500 r/min离心5 min弃去胰蛋白酶，加入体积分数0.2%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化3 h，用200目滤网过滤^[10]。滤液以1 500 r/min离心 5 min，收集细胞，以5×10⁷ L^-1浓度接种于25 cm²培养瓶内培养。按1∶3比例传代。第2代用于实验。

1.4.2 兔骨膜细胞分离、培养无菌条件下取出兔双侧胫骨骨膜，用含抗生素的PBS(5%青链霉素)清洗3遍，将骨膜剪成1 mm×1 mm组织块，置于DMEM/F12培养基(含体积分数15%胎牛血清、青链霉素100 U/mL)中，37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱培养^[11]。于倒置相差显微镜下观察，待骨膜细胞长至80%-90%时消化传代。吸尽培养基，培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化5 min，加入含血清的培养基终止消化，吹悬，按1∶3比例传代。第2代用于实验。

1.4.3 细胞非接触共培养及实验分组将分离培养的第2代软骨细胞和骨膜细胞消化悬浮后，分为2组：对照组(A组)，将骨膜细胞以4×10³/cm²浓度接种于普通6孔板进行单独培养；实验组(B组)，将软骨细胞与骨膜细胞等比例 (1∶1，细胞浓度为4×10³/cm²)通过Transwell 6孔板进行非接触共培养，软骨细胞接种于小室内，骨膜细胞接种于6孔板底部。加入DMEM/F12培养基(含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素)，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱培养，每3 d换1次液。

1.5 主要观察指标

1.5.1 细胞的形态学观察培养2周后，观察非接触共培养组骨膜细胞的形态，并与对照组单纯骨膜细胞形态进行对比。

1.5.2 甲苯胺蓝染色培养2周后，将2组细胞消化，制成细胞玻片。细胞玻片用PBS清洗3遍，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，滴加甲苯胺蓝染液染色30 min，水洗，于倒置显微镜下观察，拍照。

1.5.3 Ⅱ胶原免疫组化培养2周后，将各组骨膜细胞消化，制成细胞玻片。细胞玻片用PBS清洗3遍，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.5%Triton破膜20 min，PBS冲洗3遍。体积分数3%过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化氢酶，PBS冲洗3遍。滴加1∶50鼠抗兔Ⅱ型胶原多克隆抗体，湿盒内4 ℃过夜，PBS冲洗3遍。滴加辣根过氧化酶标记的鼠抗兔IgG，孵育30 min，PBS冲洗。滴加DAB溶液显色，于倒置显微镜下观察，拍照。

1.5.4 RT-PCR 共培养2周后，检测2组细胞软骨特异性基因蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1、性别决定区Y框蛋白9(Sex Determining Region Y Box Protein-9，SOX-9) mRNA表达。用总RNA提取试剂盒提取2组细胞总RNA，β-肌动蛋白作内参。引物序列：蛋白聚糖(290 bp)上游引物：5’-CAC AGT ACT CGC CAG-TGT GG-3’，下游引物：5’-GGT ACC GGT GGA TGT TGT CA-3’；Ⅱ型胶原α1 ( 228 bp )上游引物：5’-TCA ACA ACC AGA-TCG AGA GCA TCC G-3’，下游引物：5’-TCC ACC AGT-TCT TCT TGG GCA CG-3’；SOX-9(205 bp)上游引物：5’-TCC ACC TTC-ACC TAC ATG AGC-3’，下游引物：5’- TGG CTG TTT CTT CGG TCA CT-3’；β-actin( 407 bp )上游引物：5’- GAT CTG GCA CC ACA CCT TCT-3’, 5’-CCA CGT AGC A-CAG CTT CTC C-3’。PCR产物用2%凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统成像，应用image J灰度扫描分析结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件对实验所得数据进行统计，数据以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨膜是被覆在骨表面上坚固的含有微血管的结缔组织包膜，骨膜由浅表的纤维层及深面的形成层构成，骨膜细胞主要位于骨膜的形成层。体外培养的骨膜细胞增殖迅速，无接触抑制现象，细胞呈平行或旋涡状生长^[12-15]。在不同诱导条件下，能分别向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。并且这种较强的增殖传代能力和良好的分化潜能不随供体年龄的增大而丧失。这些优点使得骨膜细胞成为组织工程种子细胞的研究热点^[16-17]。

软骨修复过程中，构建工程化软骨需将骨膜细胞诱导分化为软骨细胞。目前主要的诱导方式是通过使用含生长因子的软骨诱导液进行诱导分化^[18-19]。贝抗胜等^[20]报道利用含有骨形态发生蛋白4的软骨诱导液可诱导骨膜细胞分化为软骨细胞。然而软骨诱导分化是一个极其复杂的过程，需要各种生长因子协调完成，单纯使用软骨诱导液及生长因子诱导软骨分化，其诱导效果十分有限，且软骨诱导液及人为添加的生长因子剂量不易把控，易产生毒副作用^[21-23]。这些因素使得软骨诱导液尚无法在临床上应用。寻求更加安全、有效的诱导方法成为骨膜细胞构建组织工程化软骨的关键^[24]。已有研究证明，将骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养后发现，共培养的骨髓间充质干细胞蛋白聚糖及Ⅱ型胶原分泌增多。蛋白多糖及Ⅱ型胶原作为软骨细胞外基质主要成分，被认为是鉴定软骨细胞的标志物。以上说明共培养条件下，软骨细胞可以提供微环境和诱导因子，促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化^[25-27]。基于上述研究，作者通过Transwell小室共培养技术，将软骨细胞与骨膜细胞进行非接触共培养，利用软骨细胞旁分泌的生长因子为骨膜细胞建立一个利于其向软骨细胞定向分化的微环境，通过细胞信号通路，促进骨膜细胞向软骨细胞分化^[28-30]。

通过Transwell非接触共培养2周后，发现共培养组骨膜细胞形态变为多角形、类圆形，接近于软骨细胞形态；实验运用Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝染色对2组细胞进行染色，对照组检测结果阴性，而共培养组检测结果阳性，表明共培养组骨膜细胞已具备分泌Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的能力，同时检测其基因发现共培养组Ⅱ型胶原α1、蛋白聚糖、SOX-9表达较对照组明显增高，由此证明软骨细胞在共培养条件下可以诱导骨膜细胞向软骨细胞方向分化。

综上所述，骨膜细胞体外增殖能力强，在非接触共培养条件下，软骨细胞可以诱导骨膜细胞向软骨细胞方向分化，提示骨膜细胞可作为修复软骨缺损的种子细胞，为骨膜细胞体外组织工程化软骨提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

非接触共培养条件下软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化

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