心室内注射人脐带间充质干细胞改善心肌梗死大鼠心功能及作用机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子：主要由体内激活的 T细胞、单核巨噬细胞等产生。近年研究发现它是一种有广泛免疫活性的效应因子，在激活免疫反应中起重要作用，参与特异性抗体的产生。主要作用于髓系祖细胞，通过与其高亲和力受体结合发挥生物学效应，使其迅速进入细胞周期向粒系和巨噬系分化，最后为成熟细胞，并能延长成熟细胞的寿命，增强成熟细胞的功能。
转化生长因子β：是指具有刺激细胞从贴壁依赖性生长转变成为贴壁非依赖性生长的一类物质，广泛存在于动物正常组织细胞及转化细胞中，人体内几乎所有细胞均可产生转化生长因子β。其生物学功能有促进胚胎发育，调节免疫，创伤修复，促进血管生成和细胞外基质沉积等。

摘要
背景：人脐带间充质干细胞具有分化潜力大，增殖能力强，免疫原性较低等特点，在创伤修复、局部缺血组织的血管再生等方面发挥不可估量的作用。
目的：探讨心室内注射人脐带间充质干细胞对心肌梗死大鼠心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达的影响。
方法：选取成年雄性健康SD大鼠120只，随机选取20只为健康对照组，余100只于腹腔皮下多点注射异丙肾上腺素建立心肌梗死大鼠模型。造模成功后随机分为模型组、人脐带间充质干细胞上清液组、人脐带间充质干细胞低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只。造模后24 h，分别将生理盐水注射液、人脐带间充质干细胞上清液、含0.25×10⁶个，1.0×10⁶个，4.0×10⁶个人脐带间充质干细胞悬液2 mL缓慢注入心室。治疗2周后应用心脏超声测定左室射血分数、收缩末期左室容积及舒张末期左室容积。ELISA法测定血清乳酸脱氨酶、肌酸激酶及脑钠肽前体水平。取心脏标本，硝基四氮唑蓝染色法测定心肌梗死面积，Western blot法测定心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达。
结果与结论：①人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组左室射血分数高于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组，而收缩末期左室容积、舒张末期左室容积低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，人脐带间充质干细胞中、高剂量组上述指标优于低剂量组(P < 0.05)；②人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组血清乳酸脱氨酶、肌酸激酶及脑钠肽前体水平及心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达均低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，而人脐带间充质干细胞中、高剂量组上述指标低于低剂量组(P < 0.05)；③人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组心肌梗死面积小于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，而人脐带间充质干细胞中、高剂量组心肌梗死面积小于低剂量组(P < 0.05)；④结果表明，人脐带间充质干细胞能明显降低心肌梗死大鼠心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达，进而有效保护心肌组织，改善心功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3352-7370(赵璐洋)

关键词: 干细胞, 移植, 人脐带间充质干细胞, 心肌梗死, 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子, 转化生长因子β1, 心功能

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs), characterized by great differentiation potential, strong proliferation ability and low immunogenicity, exert an immeasurable role in wound repair and vascular regeneration in ischemic tissues.
OBJECTIVE: To investigate the effect of intraventricularly injected UC-MSCs on expression of granulocyte-colony stimulating factor (GM-CSF) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in the myocardium of myocardial infarction rats.
METHODS: 120 adult male Sprague-Dawley rats were selected randomly, among which, 20 healthy rats were randomly selected as controls and the rest rats were subcutaneously injected with isoproterenol to establish the myocardial infarction model. Model rats were randomized into model group, UC-MSC supernatant group, UC-MSC low-dose group, middle-dose group and high-dose group, with 20 rats in each group. Twenty-four hours after modeling, normal saline, UC-MSC supernatant, UC-MSC suspensions containing 0.25×10⁶, 1.0×10⁶, 4.0×10⁶ cells (2 mL) were injected intraventricularly into the rats in the corresponding groups, respectively. Left ventricular ejection fraction (LVEF), end-systolic left ventricular volume (LVESV) and left ventricular end-diastolic volume (LVEDV) were measured by echocardiography at 2 weeks after treatment. Serum lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and pro-brain natriuretic peptide (Pro-BNP) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). At the end of the experiment, 10 rats were killed by dislocation and the cardiac specimens were taken. The myocardial infarct size was determined by nitroblue tetrazolium staining. The expressions of GM-CSF and TGF-β in the myocardium of rats in each group were determined by western blot method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Higher LVEF levels and lower LVESV and LVEDV were found in the low-, middle- and high-dose UC-MSC groups than the model group and UC-MSC supernatant group (P < 0.05). LVEF, LVEDV and LVEDV in the middle- and high-dose UC-MSC group were lower than those in the low-dose UC-MSC group (P < 0.05). (2) The levels of serum LDH, CK, Pro-BNP and myocardial tissue GM-CSF and TGF-β1 in the low-, middle- and high-dose UC-MSC group were significantly lower than those in the model group and UC-MSC supernatant group (P < 0.05). Compared with the low-dose UC-MSC group, the levels of serum LDH, CK, Pro-BNP and myocardial tissue GM-CSF and TGF-β1 were significantly lower in the middle- and high-dose UC-MSC groups (P < 0.05). (3) The myocardial infarct sizes of the low-, middle- and high-dose UC-MSC groups were significantly lower than those of the model and UC-MSC supernatant groups (P < 0.05), while the myocardial infarct sizes of middle- and high-dose UC-MSC groups were significantly lower than that of low-dose UC-MSC group (P < 0.05). To conclude, UC-MSCs can significantly reduce the expression of GM-CSF and TGF-β1 in the rat myocardium after myocardial infarction, effectively protect myocardial tissues, and improve cardiac function.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵璐洋，孙瑛，李连冲. 心室内注射人脐带间充质干细胞改善心肌梗死大鼠心功能及作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 4026-4031.

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图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 20只SD大鼠均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 各组大鼠心脏超声诊断结果比较 人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组左室射血分数值高于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组，而收缩末期左室容积、舒张末期左室容积低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组 (P < 0.05)，人脐带间充质干细胞中、高剂量组左室射血分数值高于人脐带间充质干细胞低剂量组，而收缩末期左室容积、舒张末期左室容积低于人脐带间充质干细胞低剂量组(P < 0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平比较 人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、脑钠肽前体水平均低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，而人脐带间充质干细胞中、高剂量组血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、脑钠肽前体水平均低于人脐带间充质干细胞低剂量组(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组大鼠心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达水平 人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达均低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，而人脐带间充质干细胞中、高剂量组心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达低于人脐带间充质干细胞低剂量组(P < 0.05)，见表3。

2.5 各组大鼠心肌梗死面积比较 人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组心肌梗死面积小于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，而人脐带间充质干细胞中、高剂量组心肌梗死面积小于人脐带间充质干细胞低剂量组(P < 0.05)，见表4。

2.6 各组大鼠心肌组织病理变化 健康对照组大鼠心肌组织呈紧密排列，淋巴细胞减少；模型组、人脐带间充质干细胞上清液组大鼠心肌细胞大量坏死，淋巴细胞明显浸润；人脐带间充质干细胞低剂量组大鼠心肌细胞坏死减少，淋巴细胞浸润明显；人脐带间充质干细胞中剂量、高剂量组大鼠心肌细胞坏死减少，淋巴细胞浸润减轻，见图1。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年2月在南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管外科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选取成年雄性健康SD大鼠120只，SPF级，体质量150-200 g，购于山东鲁抗医药有限公司，批号：SCXK(鲁)20160002，室温下常规喂养。

1.3.2 主要细胞、试剂 人脐带间充质干细胞(广东省医院干细胞研究中心)；人脐带间充质干细胞上清液(广东省医院干细胞研究中心)；盐酸异丙肾上腺素(批号：100166-201004，上海科鉴生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶试剂盒、肌酸激酶试剂盒(德国罗氏诊断有限公司)；脑钠肽前体(Pro-BNP)试剂盒(武汉明德生物科技有限公司)；兔抗鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子一抗(艾美捷科技有限公司)；兔抗鼠转化生长因子β1一抗(上海康朗生物科技有限公司)；羊抗兔二抗(南京生兴生物技术有限公司)。

1.3.3 主要仪器 -80 ℃深低温冰箱(日本SANYO公司)；普通光学显微镜(日本Nikon公司)；分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；低温离心机(日本KUBOTA公司)；酶标检测仪(美国BIO-RAD公司)；自动切片机(厦门宇电自动化有限公司)；恒温箱(上海天呈科技有限公司)；BT125D型电子分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；KQ-300TDV心脏超声仪(丹麦Cortex公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌梗死大鼠模型建立 每只大鼠于腹腔皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素200 mg/kg，隔24 h注射1次，共注射2次，注射完毕后正常喂养，注射后1周应用心脏超声进行诊断，左室射血分数<45%则提示为心肌梗死。

1.4.2 实验分组 选取成年雄性健康SD大鼠120只，随机选取20只为健康对照组，另外100只成功建模后，随机分为模型组、人脐带间充质干细胞上清液组、人脐带间充质干细胞低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组20只。造模后24 h，大鼠肌内注射3%戊巴比妥钠麻醉并固定在动物手术台上，寻找心尖搏动最强点，分别将生理盐水注射液2 mL、人脐带间充质干细胞上清液2 mL、含0.25×10⁶个人脐带间充质干细胞悬液2 mL、含1.0×10⁶个人脐带间充质干细胞悬液2 mL、含4.0×10⁶个人脐带间充质干细胞悬液2 mL缓慢注入心室。达到满意点后稍回抽注射器，如出现鲜红色血液瞬间流回注射器则提示注射位置准确，术毕应用无菌纱布按压注射点止血，待大鼠麻醉苏醒后放回鼠笼精心饲养。

1.4.3 各组大鼠心功能 于治疗2周后应用心脏超声测定心功能，选用RMV-716探头，频率为17.5 MHz，测定各组大鼠左室射血分数(LVEF)、收缩末期左室容积(LVESV)及舒张末期左室容积(LVEDV)。所有参数测定值均取3个连续心动周期平均值。

1.4.4 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平 于治疗2周后于尾端抽取静脉血3 mL，离心处理后留取上清液，应用ELISA法测定各组血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶及脑钠肽前体水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 各组大鼠心肌梗死面积 实验结束时(即治疗8周)每组随机抽取10只大鼠采用脱臼法处死，取出心脏，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干多余液体后秤质量，平行冠状动脉沟均匀将心室切成等厚5片，置于0.2%硝基四氮唑蓝常温避光染色两三分钟，应用扫描仪分别扫描5片心肌的正反面，获得扫描图像，用多媒体色彩病理图像分析系统测量每片心肌双侧的梗死区和非梗死区面积，并计算心室梗死区总面积占全心面积的百分比。

1.4.6 Western blot法测定心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达 治疗8周后每组随机取10只大鼠，完成心脏标本取材后，取1 g冷冻心脏组织放入匀浆器中，加入40 µL蛋白酶抑制剂及1 mL RIPA冰上裂解15 min，离心20 min，留取上清液，取定量蛋白25 µg于5%积层胶、10%分离胶进行SDS-PAGE电泳，先120 V电泳15 min，再150 V电泳40 min，溴酚蓝至胶底部则停止电泳。剪一块与胶大小一致的湿法电转膜(PVDF膜)，甲醇浸泡10 min，转移至buffer溶液中浸泡10 min，打开并平放转移，阳极朝上，放入转膜槽中，加入冰盒，倒入转移buffer溶液。转膜结束后应用丽春红染色液染PVDF膜并观察蛋白条带确保蛋白成功转移至膜上，常温下应用0.5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子一抗、转化生长因子β1一抗，37 ℃恒温孵育1 h后4 ℃过夜，应用PBS冲洗4次，加入二抗(1︰100)，7 ℃恒温孵育1 h，PBS冲洗4次，显色后应用分光光度仪测定吸光度值。

1.4.7 各组大鼠心肌组织病理观察 取上述各组大鼠心脏，平行冠状动脉沟切取心脏组织块，常规脱水、透明、石蜡包埋，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察心肌组织病理形态变化。

1.5 主要观察指标 ①大鼠左室射血分数、收缩末期左室容积及舒张末期左室容积；②大鼠血清心肌损伤标志物水平；③大鼠心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达水平；④大鼠心肌梗死面积。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。数据先行正态分布检验，符合正态分布的计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用F 检验，进一步两两比较采用LSD-t 法，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

近年研究指出，心肌梗死导致心脏局部浸润性炎症反应，炎症递质起到重要的作用^[12]。炎症递质可趋化炎症因子至心肌炎症部位，进一步促使炎症细胞增殖及刺激炎症因子释放，并持续刺激纤维结缔组织增生及损伤心肌细胞，导致心功能下降^[13-14]。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是由巨噬细胞、内皮细胞、活化的单核细胞及淋巴细胞、肿瘤细胞及胸腺上皮细胞等多种细胞合成及分泌的巨噬细胞特异性生长因子，其主要作用是维持单核-巨噬细胞生长、增殖及分化，并促使血祖细胞生成单核-巨噬细胞^[15-18]。在炎症递质下粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子可被激活并作用其受体从而引起内皮细胞释放更多粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，引起机体炎症级联反应。转化生长因子β1是心血管疾病中的重要生物效应因子，在心肌细胞外基质、心肌细胞肥大增殖及心室重塑中起到重要的作用^[19-20]。Sun等^[21]研究指出，心肌梗死后转化生长因子β表达水平显著升高，且与胶原纤维蛋白含量呈正相关。Kim等^[22]也发现，转化生长因子β表达在心肌梗死后1个月内持续表达增强。

人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，可在特定环境下诱导分化为多种组织细胞(如骨骼细胞、神经细胞、软骨细胞及心肌细胞)，是目前用于身体各器官修复治疗的理想种子细胞^[23]。目前多向研究表明，人脐带间充质干细胞在心脏修复及治疗中具有较高的安全性及有效性^[24-27]。实验结果显示，人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组左室射血分数水平高于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组，而收缩末期左室容积、舒张末期左室容积低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组(P < 0.05)，人脐带间充质干细胞中、高剂量组左室射血分数高于人脐带间充质干细胞低剂量组，而收缩末期左室容积、舒张末期左室容积低于人脐带间充质干细胞低剂量组，提示人脐带间充质干细胞移植后能有效改善心肌梗死大鼠心功能，且心肌梗死心功能的改善与人脐带间充质干细胞移植剂量有关。

血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、脑钠肽前体是心肌细胞损伤标志物，当心肌细胞损伤后被大量分泌到血清中，因此其水平高低与心肌梗死程度呈正相关。人脐带间充质干细胞低、中、高剂量组血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、脑钠肽前体水平均低于模型组及人脐带间充质干细胞上清液组，而人脐带间充质干细胞中、高剂量组血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、脑钠肽前体水平均低于人脐带间充质干细胞低剂量组，提示人脐带间充质干细胞移植后能有效减轻大鼠心肌损伤及梗死程度。

目前多项研究指出，人脐带间充质干细胞对心肌梗死有明显的治疗及改善作用^[26]，但其治疗作用机制还存在一定的争议。人脐带间充质干细胞可分化为心肌细胞，这种分化的心肌细胞具有收缩性^[28]，可与宿主细胞形成偶联，参与心肌同步收缩，改善心肌顺应性及修复受损心肌细胞。心肌细胞这种再生机制曾被认为是干细胞治疗的作用机制。然而近年研究指出，人脐带间充质干细胞对心肌梗死的治疗机制主要是通过释放生长因子、抗凋亡因子及细胞因子等发挥细胞生物学作用^[29]，进而修复受损心肌细胞及改善心功能。实验结果表明，人脐带间充质干细胞移植后，心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达水平较模型组及人脐带间充质干细胞上清液组显著下降，由此可知，心肌梗死后大鼠功能的改善与人脐带间充质干细胞移植后心脏局部炎症反应有关。研究指出，免疫细胞能有效识别杀伤应激细胞，心肌梗死后存活的心肌细胞会被自身免疫系统当成抗原被识别^[30]，从而引起心肌细胞免疫性损伤，而人脐带间充质干细胞免疫抑制功能强大，因此能有效抑制机体免疫系统对心肌细胞的损伤，改善心功能。

综上所述，人脐带间充质干细胞能明显降低心肌梗死大鼠心肌组织粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β1表达，进而有效保护心肌组织，改善心功能。

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