聚乳酸共聚物复合脂肪干细胞对骨质疏松性骨折愈后生物力学的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
聚乳酸共聚物：是一种高分子材料，生物相容性与成膜性好且无毒，在医药工程领域和现代化工领域中应用广泛。聚乳酸共聚物已通过FDA认证，作为药用辅料被收入美国药典。近几年，生物材料学日趋发展，聚乳酸共聚物制备而成的骨支架材料被广泛应用于各类骨折临床治疗中，该类聚合物具有优异的生物降解性，且易被塑造为三维立体支架，能促进骨组织和血管生成、生长。
脂肪干细胞/聚乳酸共聚物复合体：脂肪干细胞和聚乳酸共聚物复合体能够显著增强骨质疏松性骨折后的骨愈合质量和效果。也可促进新骨生成、生长速度，从而保证断骨可以承受较高压力机剪切力及抵抗高强度弹性变形。

背景：聚乳酸共聚物骨支架具有优异的生物降解性且易被塑造为三维立体支架，能促进骨组织和血管的生成、生长。
目的：观察骨质疏松骨折后，聚乳酸共聚物复合脂肪干细胞对骨折愈合后生物力学的影响。
方法：将60只SD大鼠随机分为4组，空白对照组不做任何处理；模型组切除双侧卵巢3个月后，制作双侧胫骨骨折模型；细胞治疗组切除双侧卵巢3个月后，制作双侧胫骨骨折模型，于骨折周围植入脂肪干细胞；联合治疗组切除双侧卵巢3个月后，制作双侧胫骨骨折模型，于骨折周围植入聚乳酸共聚物-脂肪干细胞复合体。治疗4周后，观察各组骨密度、骨痂厚度、生物力学参数及骨小梁微结构变化。
结果与结论：①骨密度：模型组骨密度低于空白对照组(P < 0.05)；细胞治疗组、联合治疗组骨密度高于模型组(P < 0.05)，但低于空白对照组(P < 0.05)；联合治疗组骨密度高于细胞治疗组(P < 0.05)；②骨痂厚度：细胞治疗组、联合治疗组骨痂厚度高于模型组、空白对照组(P < 0.05)，且联合治疗组高于细胞治疗组(P < 0.05)；③生物力学测试：与空白对照组比较，模型组破坏载荷、极限应力、剪切强度、弹性模量降低(P < 0.05)，剪切应变升高(P < 0.05)；与模型组比较，细胞治疗组、联合治疗组破坏载荷、极限应力、剪切强度、弹性模量升高(P < 0.05)，剪切应变降低(P < 0.05)，且以联合治疗组改变更显著(P < 0.05)；④骨小梁微结构：模型组骨小梁排列紊乱，间距增大，甚至出现断裂和陷窝；细胞治疗组、联合治疗组骨小梁数目增多且增粗增厚，间距减小，陷窝减少；⑤结果表明：聚乳酸共聚物复合脂肪干细胞治疗骨质疏松骨折可明显改善愈合后骨组织的生物力学参数。

ORCID: 0000-0001-8363-2908(唐宇星)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 聚乳酸共聚物, 骨质疏松骨折, 大鼠脂肪干细胞, 生物力学参数

Abstract:

BACKGROUND: Polylactic acid copolymer bone scaffold has excellent biodegradability, and it is easy to be shaped and can promote the formation and growth of bone tissue and blood vessel.
OBJECTIVE: To observe the effects of adipose-derived stem cells (ADSCs)/poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) complex on the biomechanical properties after fracture healing in osteoporotic bone.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: blank control group received no treatment; the bilateral tibial fracture model was made after 3 months of bilateral ovarian resection in model group; the bilateral tibial fracture model was made and ADSCs were implanted into the bone after 3 months of bilateral ovarian resection in cell therapy group; the bilateral tibial fracture model was made and the PLGA/ADSCs complex was implanted after 3 months of bilateral ovarian resection in combined treatment group. The bone mineral density, callus thickness, biomechanical parameters and the microstructure of the trabecular bone were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The bone density: The bone density of the model group was significantly lower than that of the blank control group (P < 0.05); the bone mineral density of the cell therapy group and the combined treatment group was higher than that of the model group (P < 0.05), but lower than that of the control group (P < 0.05); and the bone mineral density of the combination treatment group was higher than that of the cell therapy group (P < 0.05). (2) Thickness of the callus: The thickness of the callus in the cell therapy group and combined treatment group was higher than that of the model group and blank control group (P < 0.05); moreover, the thickness of the callus in the combined treatment group was higher than that of the cell therapy group (P < 0.05). (3) Biomechanical test: The failure load, stress and shear strength, elastic modulus were decreased in the model group compared with the blank control group (P < 0.05), while the shear strain increased (P < 0.05). Compared with the model group, the failure load, ultimate stress, shear strength, elastic modulus were increased in the cell therapy group and combined treatment group (P < 0.05), and the shear strain was decreased (P < 0.05). Moreover, the combined treatment group showed more changes in these biomechanical parameters (P < 0.05). (4) The trabecular bone microstructure: The model group presented with trabecular derangement, spacing increases, and even fracture and lacuna. After ADSCs or ADSCs/PLGA transplantation, the trabecular bones increased in number, thickness, and spacing, and the number of lacunae reduced. In conclusion, ADSCs combined with PLGA in the treatment of osteoporotic fracture can significantly improve the biomechanical parameters of bone tissue after healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Osteoporotic Fractures, Stem Cells, Biomechanics, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

唐宇星，赵庆，杨中萌，叶永恒，胡仁安. 聚乳酸共聚物复合脂肪干细胞对骨质疏松性骨折愈后生物力学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1577-1582.

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图/表（结果） 3

2.1 脂肪干细胞的原代培养在24 h后，原代培养的脂肪干细胞呈的纤维细胞样，首次传代8 d，之后三四天传代一次，经10代传代后细胞形态均衡，仍呈长梭形、多边形且保持了良好的增殖能力。

2.2 各组骨密度与骨痂厚度的比较造模前，各组大鼠骨密度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后，模型组骨密度低于空白对照组和造模前(P < 0.05)，说明骨质疏松造模成功；治疗4周后，细胞治疗组和联合治疗组骨密度高于造模前和模型组(P < 0.05)，但低于空白对照组(P < 0.05)；联合治疗组治疗4周后的骨密度高于细胞治疗组(P < 0.05)，见表1。

细胞治疗组和联合治疗组治疗4周后的骨痂厚度高于模型组(P < 0.05)，联合治疗组高于细胞治疗组(P < 0.05)，见表1。

2.3 各组生物力学参数的比较模型组的破坏载荷、极限应力、剪切强度、弹性模量均低于空白对照组(P < 0.05)，剪切应变高于空白对照组(P < 0.05)；细胞治疗组和联合治疗组的破坏载荷、极限应力、剪切强度、弹性模量均高于模型组(P < 0.05)，剪切应变低于模型组(P < 0.05)；联合治疗组的破坏载荷、极限应力、剪切强度、弹性模量均高于细胞治疗组(P < 0.05)，剪切应变低于细胞治疗组(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组骨小梁微结构的变化空白对照组大鼠骨小梁排列有序，连接紧密；模型组大鼠的骨小梁排列紊乱，间距增大，甚至出现断裂和陷窝；细胞治疗组、联合治疗组治疗后的大鼠的骨小梁数目增多且增粗增厚，间距减小，陷窝减少，见图1。

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引言

在骨科临床中，骨质疏松性骨折属于常见性骨折，临床表现一般为骨折、身高变矮、驼背、疼痛等，患者主要以老年女性为主，有老龄化趋势^[1-2]。据调查，中国是骨质疏松症患者数量最多的国家，其引发的骨折发生率呈不断增高趋势^[3]。骨质疏松症的主要特征为骨吸收和骨形成不平衡，这是引起骨折的主要原因，该不平衡使得骨密度降低，骨显微结构异常，力学特性改变，进而增加骨折危险性^[4-5]。

骨质疏松性骨折的外科治疗应包括3个阶段：骨折闭合与切开(即复位)、固定(包括外固定和内固定)、功能康复与功能锻炼^[6]。常规治疗该类骨折的方式为内固定植入，但由于患者骨质较脆，易造成内固定稳定性较低、骨愈合较差，增加再次骨折的概率^[7]。也有研究者选择磷酸盐结合陶瓷人工骨或骨水泥移植治疗骨质疏松性骨折，但该类手术可致患者机体出现严重排斥反应^[8-9]。骨水泥植入椎体的硬度明显大于相邻椎体，此种差异增加了骨折发生率，甚至患者术后患肢活动障碍，预后较差^[10-11]。磷酸三钙等的出现实现了骨植入物的可降解性，新生骨能逐步将其替代，但缺点是即刻固化时强度不足，无法达到力学承载的要求，并且降解时间长^[12]。

脂肪组织中能够提取到具有向多种组织(成骨、软骨、神经等)分化的潜能的干细胞，称为脂肪干细胞，其来源丰富，获取方便且对机体伤害小^[13]。2001年，Zuk等首次从人体组织中提取出脂肪干细胞^[14]。在体外单纯的脂肪干细胞微球或微团诱导成骨能力有限，生物机械性能弱，无法满足骨构建和骨损伤修复的要求，临床应用受限^[15]。目前，已证实大鼠脂肪干细胞亦有加快新骨生成、生长速度的生理性功能，能够显著增强断骨再生效果，具有较重要的促进骨折修复作用^[16-17]。

聚乳酸共聚物是一种高分子材料，生物相容性与成膜性好且无毒，在医药工程领域和现代化工领域中应用广泛^[18]。聚乳酸共聚物已通过FDA认证，作为药用辅料被收入美国药典^[19]。近几年，生物材料学日趋发展，聚乳酸共聚物制备而成的骨支架材料被广泛应用于各类骨折临床治疗中，该类聚合物具有优异的生物降解性，且易被塑造为三维立体支架，能促进骨组织和血管生成、生长^[20]。聚乳酸共聚物有望复合脂肪干细胞利于骨质疏松性骨折的愈合，改善骨折愈合后生物力学参数^[21-22]。为进一步提高骨质疏松性骨折的治疗效果，实验集中探讨了脂肪干细胞和聚乳酸共聚物联合治疗对模型大鼠骨折愈合后生物力学的影响。

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材料方法

1.1 设计前瞻性动物观察实验。

1.2 时间及地点　实验于2015年3至9月在中山大学附属第五医院动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：选取健康成年SPF级雌性SD大鼠63只，体质量(210±25)g，由中山大学实验动物中心提供，许可证号： SYXK(粤)2012-0081，其中3只用于脂肪干细胞的培养；12 h黑暗和白光交替，温度(20±3)℃，自由进食和饮水喂养。

主要材料、试剂及仪器：聚乳酸共聚物(济南迈康公司)；骨密度仪(南京科进实业有限公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；倒置显微镜(上海普丹光学仪器有限公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司) ；青霉素(国药准字H23020930，哈药集团制药总厂)；万能力学测定机(扬州华辉检测仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞的原代培养取3只大鼠，采取颈椎脱臼处死，对其颈部、背部及下肢备皮、消毒后，取其皮下脂肪。注意清除干净筋膜和血管，以PBS冲洗3次，5 min/次，后将脂肪组织分成1 mm×1 mm ×1 mm组织块，浸泡于37 ℃1.5 g/LⅠ型胶原酶内1 h。选择100目筛网对浸泡液进行过滤，放入离心机1 000 r/min离心10 min，滴入含体积分数10%胎牛血清的DMEM液进行细胞悬浮、接种。每天对其进行常规检查，若培养液浑浊并呈柠檬黄色，说明已被污染；培养液呈紫色说明有漏气，细胞可能大量死亡；培养液呈橘红色说明其生长状态良好。待融合至90%时，即倒置显微镜下观察细胞为致密单层，滴入2.6 g/L胰蛋白酶进行传代培养。根据细胞形态判定为干细胞。脂肪干细胞接种增殖过程中对细胞密度检测时，应保证各组细胞密度保持基线一致。

1.4.2 构建脂肪干细胞/聚乳酸共聚物复合体将细胞浓度为3×10⁹ L^-1的脂肪干细胞悬液100 μL接种于聚乳酸共聚物，后将其放于培养皿内，滴入5 mL含体积分数10%小牛血清的DMEM培养液内培养1 d，备用。

1.4.3 模型制作及分组干预取大鼠60只，随机分为4组，每组15只，其中空白对照组不做任何处理；模型组行卵巢结扎摘除术并制成骨折模型；细胞治疗组行卵巢结扎摘除术并制成骨折模型后，进行单纯脂肪干细胞治疗；联合治疗组行卵巢结扎摘除术并制成骨折模型后，进行脂肪干细胞复合聚乳酸共聚物治疗。

造模方法：模型组、细胞治疗组及联合治疗组大鼠静脉注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg全麻后，于腹腔取正中切口，逐层分离皮肤、腹肌、腹膜入腹腔，丝线结扎、摘除双侧卵巢，后缝合切口。常规喂养3个月后，采用骨密度仪测量其骨密度，筛选骨质疏松大鼠进入下一步实验。选择线锯于大鼠双侧股骨转子下侧0.7-0.9 cm造横向骨折，再取20 mL针头将骨折断口逆行引导，并用1 mm克氏针行髓内固定，制备好模型。

分组干预：骨折造模后，联合治疗组双侧股骨骨折周围植入脂肪干细胞/聚乳酸共聚物复合体，细胞治疗组植入3×10⁹ L^-1脂肪干细胞悬液100 μL。大鼠复苏后，肌肉注射青霉素20×10⁴ U进行抗感染，采取正常喂养、自由活动。治疗4周后，各组处死大鼠5只，取出完整股骨，清除干净肌肉后，测量骨密度、骨痂厚度和生物力学及组织学变化。

1.5 主要观察指标

骨密度与骨痂厚度：采用骨密度仪测量各组大鼠在造模前、骨质疏松造模后12周及治疗后4周的骨密度差异，采用Micro-CT扫描获得各组大鼠骨痂厚度的差异。

生物力学参数：采用三点弯曲实验检测各组大鼠破坏载荷、极限应力、剪切强度、剪切应变、弹性模量等生物力学参数的差异。

骨痂厚度：采用Micro-CT扫描获得骨小梁微结构形态学参数，比较各组大鼠骨小梁微结构变化的差异。

组织学观察：各组各取2只大鼠，取取骨折处组织进行von kossa染色。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行数据分析，骨密度、骨痂厚度和生物力学参数用x(_)±s表示，用单因素方差分析进行组间和组内比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨质疏松性骨折患者多为老年女性^[23-24]，该病的临床特点为：①患者骨骼自修复能力差，合并疾病较多，对手术和药物的治疗耐受性均较差；②患者骨硬度差、骨质脆性易破，因此传统内固定稳定性较差，术后外力冲击造成再次骨折的概率增大；③骨质疏松性骨折多发于皮质骨数量少的桡骨远端、胸及腰椎椎体和股骨上端等部位，因该类骨骼需经常活动，易诱发骨折复位后再移位；④老年患者易出现焦虑、烦躁和恐惧等负面心理，减弱了其对治疗及护理的配合度，治疗效果差。由此可见，加快骨质疏松性骨折的骨愈合速度是有效治疗的关键^[25-26]。

脂肪干细胞主要从机体脂肪组织中提取得到，具有在引导下向多种组织细胞分化的特性^[27]。参阅文献可知，该细胞能够在特殊生长因子刺激下转化为脂肪、软硬骨、神经及肌肉等器官或组织细胞，来源广泛、获取容易，可一次性得到较多数量的细胞^[28]。因此，可选取该细胞作为研究促骨生成的种子细胞^[29-30]。

骨质疏松性骨折患者多以老年女性为主，此类患者缺乏间充质干细胞，使得其机体无法获得足够的成骨细胞^[31]。推断通过引入外源性干细胞例如脂肪干细胞，可弥补其内源性具有分化潜能干细胞的劣势，加快其骨折愈合^[32]。随着骨组织工程研究的发展，各类基于生物学特性的生物材料骨支架被广泛引入骨折治疗，其中以高分子及生物性聚合物或陶瓷为主^[33-34]。聚乳酸共聚物作为近几年刚刚兴起一种高分子有机生物材料，具有较好的生物降解和生物相容性且无毒性^[35]，能够快速贴合真骨提供低排斥性的人工骨囊及骨膜^[36]，应用范围广泛、临床疗效优秀^[37]。正是基于聚乳酸共聚物的以上优点，有望做为骨支架联合脂肪干细胞治疗骨质疏松性骨折^[38-39]。

脂肪干细胞培养结果显示，原代培养的脂肪干细胞呈纤维细胞样，经10代传代后细胞形态均衡，仍呈长梭形、多边形且保持了良好的增殖能力。从大鼠体内获取脂肪干细胞进行体外培养后发现，单纯脂肪干细胞诱骨能力有限，仅能使得断骨获得较低的生物力学强度，无法充分保证骨折愈合的要求。接着将培养细胞种植于聚乳酸共聚物，发现脂肪干细胞/聚乳酸共聚物组细胞流失数量多于直接在培养皿接种细胞，推断其原因可能由于聚乳酸共聚物材料上孔隙较多，而造成脂肪干细胞种子细胞通过孔径丢失。

获取可进行此次实验的脂肪干细胞/聚乳酸共聚物复合体后，将其植入骨折模型大鼠，同时选择单纯脂肪干细胞植入骨折模型大鼠，实验结果显示，细胞治疗组和联合治疗组骨密度、骨痂厚度高于造模前和模型组，但低于空白对照组；联合治疗组骨密度要优于细胞治疗组，结果提示脂肪干细胞和聚乳酸共聚物复合体能够显著增强骨质疏松性骨折后的骨愈合质量和效果。进一步结果也显示，脂肪干细胞/聚乳酸共聚物也可促进新骨生成、生长速度，从而保证断骨可以承受较高压力机剪切力及抵抗高强度弹性变形，因此，脂肪干细胞/聚乳酸共聚物复合体治疗后大鼠的破坏载荷，极限应力、剪切强度、弹性模量均高于细胞治疗组和模型组，虽低于空白对照组大鼠，但经过4周后，其恢复接近于正常大鼠。

研究发现，聚乳酸共聚物具有优秀的孔隙率及孔径，能够保证脂肪干细胞在其上生长增殖，促进新骨和新血管生长，加快骨愈合，但应选择孔径>300 μm的聚乳酸共聚物。但实验仅证明脂肪干细胞和聚乳酸共聚物适用于动物实验，将其应用于临床治疗仍需要进一步研究。

综上所述，骨质疏松性骨折治疗难度主要表现为骨愈合力差，单纯脂肪干细胞能够促进新骨形成及骨愈合，但不及脂肪干细胞联合聚乳酸共聚物的疗效，可在临床上进一步推广应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程