含抗骨增生胶囊血清预处理骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.023

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
抗骨增生胶囊促进骨愈合：抗骨增生胶囊为复方制剂，由熟地黄、肉苁蓉、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、牛膝、狗脊、女贞子、莱菔子等药物组成的，临床上常用于骨关节炎的治疗。课题组在前期研究中发现其对骨折的愈合有促进作用，对于骨髓间充质干细胞成骨分化有无促进作用，目前尚未见相关报道。在研究中，通过MTT检测结果发现，中、高剂量组对骨髓间充质干细胞增殖有促进作用，高剂量组对骨髓间充质干细胞的增殖促进作用更明显。
成骨分化标志：碱性磷酸酶是骨形成的早期标志，与成骨细胞分化成熟正相关，其活性可反映骨髓间充质干细胞成骨方向分化趋势的强弱。在分化的早期，碱性磷酸酶便开始表达，而碱性磷酸酶的高峰表达则出现在增殖期，为矿化期磷酸盐的积聚提供有利多条件。茜素红染色常用于检测细胞外基质中矿化结节的形成，随着诱导分化时间增加，成骨分化越来越好，钙盐沉积也越来越多。

摘要
背景：课题组前期研究发现抗骨增生胶囊可促进骨折愈合。
目的：观察含抗骨增生胶囊血清对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。
方法：将40只SD大鼠随机分4组，低、中、高剂量组分别灌胃给予抗骨增生胶囊药粉11.6，34.8，104.4 g/kg，空白组灌胃给予等量生理盐水，1次/d，连续灌胃12 d后，腹主动脉采血，分离血清备用。应用全骨髓贴壁培养法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞，分4组培养，分别加入含上述4种血清的成骨培养基中诱导培养，培养24，48，72 h，检测细胞增殖；培养7，14 d，检测细胞碱性磷酸酶活性；培养7 d，进行碱性磷酸酶染色；培养14 d，进行茜素红染色。
结果与结论：①与空白组比较，低剂量组细胞增殖无明显变化，中、高剂量组培养48，72 h的细胞增殖显著升高(P < 0.05)；②与空白组比较，低剂量组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化，中、高剂量组培养7，14 d的细胞碱性磷酸酶活性显著升高(P < 0.05)；③低、中、高剂量组均可见碱性磷酸酶及茜素红染色阳性，以高剂量组效果最明显；④结果表明，含抗骨增生胶囊血清可促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-6870-909X(马维)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 增殖, 碱性磷酸酶, 含药血清, 骨向分化

Abstract:

BACKGROUND: Our previous studies have found that the Kangguzengsheng Capsules can promote fracture healing.
OBJECTIVE: To explore the influence of Kangguzengsheng Capsules-containing serum on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups. The capsule powder was resolved into 1 mL natural saline and intragastrically administered into rats according to 1.16 g/100 g, 3.48 g/100 g, 10.44 g/100 g in low, medium and high dose groups. Rats in control group were given equal volume of natural saline. After consecutive administration for 12 days, blood samples from the abdominal aorta were collected and serum samples were isolated and preserved until use. Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified by the whole marrow adhesion method, and identified by flow cytometry. Harvested cells were divided into four groups and cultured in the osteogenic culture medium containing different kinds of serum samples as described above. MTT method was adopted to test the cell proliferation at 24, 48 and 72 hours of culture. Alkaline phosphatase activity in cells was detected at 7 and 14 days of culture. Alkaline phosphatase staining was performed at 7 days of culture, and alizarin red staining performed at 14 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, bone marrow mesenchymal stem cells showed no significant changes in the proliferative ability and alkaline phosphatase activity in the low dose group, but these two indices were significantly increased in the high and medium dose groups at 48 and 72 hours of culture or at 7 and 14 days of culture, respectively (P < 0.05). Cells positive for alkaline phosphatase and alizarin red staining were observed in the low, medium and high dose groups, and the cell staining was most remarkable in the high dose group. To conclude, Kangguzengsheng Capsules-containing serum can promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

宋永周，童九辉，刘会玲，马维，李明. 含抗骨增生胶囊血清预处理骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1439-1443.

Song Yong-zhou, Tong Jiu-hui, Liu Hui-ling, Ma Wei, Li Ming. Effects of Kangguzengsheng Capsules-containing serum on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1439-1443.

图/表（结果） 2

2.1 BMSCs培养和表型测定 原代培养的细胞形状不规则，有长梭形、多角形等，培养的第一二天开始有少量细胞贴壁，半量换液后，细胞团块克隆生长，增殖迅速，7-9 d长满瓶底，呈纺锤形，细胞整体排列呈漩涡状、辐射状样排列；传代后细胞贴壁及生长更加迅速，24 h内即可完全贴壁，六七天可铺满瓶底，细胞形态更均一，整体呈现漩涡状、辐射状或鱼群样排列(图1)。经流式细胞仪检测，CD44、CD29、CD90均为阳性表达，阳性表达率分别为99.3%、99.2%及99.97%；CD14、CD34、CD45均为阴性表达(图2)，符合BMSCs的生物学特性。

2.2 MTT检测细胞增殖结果 低剂量组不同时间点的细胞A值与空白组无差异(P > 0.05)，提示对BMSCs增殖无促进作用；除中剂量组24 h外，中、高剂量组其余各时间点细胞A值均高于空白组(P < 0.05)，提示对BMSCs增殖有促进作用；高剂量组不同时间点的A值高于中剂量组(P < 0.05)，见表1，说明高剂量组对BMSCs的增殖促进作用更明显。

2.3 碱性磷酸酶活性测定结果 低剂量组不同时间点的A值与空白组无差异(P > 0.05)；中、高剂量组不同时间点的A值高于空白组(P < 0.05)，说明中、高剂量抗骨增生胶囊对BMSCs分泌碱性磷酸酶有促进作用；高剂量组不同时间点的A值高于中剂量组(P < 0.05)，说明高剂量组对BMSCs分泌碱性磷酸酶作用更明显，见表2。

2.4 碱性磷酸酶及茜素红染色结果 诱导第7天，碱性磷酸酶染色可见胞浆内被染成红色颗粒状碱性磷酸酶，表明诱导后的细胞有内源性碱性磷酸酶的表达，其中低、中、高剂量组胞浆阳性颗粒数均较空白组增加，且随剂量增加阳性颗粒数增加(图3)。诱导第14天，胞外基质中有大小不等的聚集团状结节，茜素红染色将结节中沉积的钙盐染成红色，低、中、高剂量组钙结节数量及面积均较空白组增多，高剂量组形成的结节更大、更致密(图4)。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外对比细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2015年10月在河北医科大学第二医院实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：体质量200 g左右清洁级(SPF)SD大鼠50只，雌雄不拘，由河北医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

药品及试剂：L-DMEM培养基、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、MTT、茜素红(Sigma公司)；胎牛血清(北京元亨圣马公司)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物公司)；抗骨增生胶囊(江苏康缘药业)；CD29-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、CD45-FITC单克隆抗体(美国BD公司)；二甲基亚砜(美国R&D公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天生物科技公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清的制备 取抗骨增生胶囊，倒出药粉，称质量后配成1 mL悬浊液。将40只SD大鼠随机分为空白组及低、中、高剂量组，每组10只。按人与大鼠体表面积比值折算抗骨增生胶囊给药量^[9]，低、中、高剂量组分别灌胃给予抗骨增生胶囊药粉11.6，34.8，104.4 g/kg，空白组灌胃给予等量生理盐水，1次/d，连续灌胃12 d。末次给药后2 h，戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，分离血清后于56 ℃烤箱中灭活30 min，0.22 μm滤膜抽滤除菌，分装后-20 ℃低温保存备用。

1.4.2 BMSCs的培养 采用全骨髓贴壁法培养BMSCs，具体为：取SD大鼠，麻醉后无菌条件下获取双侧股骨、胫骨并剪断，用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基冲出骨髓，吹打制成单细胞悬液，离心、弃上清，L-DMEM重悬后接种，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。3 d后半量换液，5 d后全量换液。待细胞生长已铺满瓶底的95%以上时进行传代培养。

1.4.3 BMSCs的分子表型鉴定 取第3代细胞，制成单细胞悬液，按每管(3.0-4.0)×10⁵分装，各管中加入含有PE、FITC标记的单克隆抗体，充分混匀，4 ℃避光保存30 min，以流式细胞仪进行流式细胞检测。

1.4.4 含药血清干预BMSCs

培养液的成分：所有培养液均含有成骨性诱导剂，包括L-DMEM(含维生素C 50 mg/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松0.1 μmol/L)、体积分数5%胎牛血清和体积分数5%的含药血清。

MTT法检细胞增殖：取第3代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于96孔培养板，每孔200 μL，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h。弃上清，分别加入含4种不同血清的培养液各200 μL，每组设6个复孔，于培养的第24，48，72小时，每孔加5 g/L的MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清，各孔加150 μL二甲基亚砜，震荡10 min，490 nm波长处测定吸光度值。

碱性磷酸酶活性测定：取第3代对数生长期细胞，制成单细胞悬液，按1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于12孔板，24 h后弃上清，分别加入含4种不同血清的培养液，每2 d换液1次，培养7，14 d后弃培养液，PBS清洗，加入0.5 mL 0.1% TritonX-100，超声裂解细胞后，按碱性磷酸酶试剂盒说明书于490 nm 波长下进行吸光度检测。

碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定：取第3代细胞，制成单细胞悬液，接种至预置盖玻片的6孔板中，分别加入含4种不同血清的培养液，诱导第7天进行碱性磷酸酶染色，显微镜下观察；诱导第14天行茜素红染色观察。

1.5 主要观察指标 含抗骨增生胶囊血清对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以x(_)表示，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。 ±s

讨论

截止2012年，全球有超过2亿人患有骨质疏松症，而中国约有9 000万^[10]。骨质疏松症最主要的临床症状为骨脆性增加，从而导致手臂、髋部和脊椎等部位易骨折，同时伴有内分泌和代谢紊乱等。骨质疏松症使患者遭受精神和身体上的折磨，严重时导致终身残疾甚至死亡^[11]。随着近年来对骨质疏松病理机制研究的深入，以及干细胞和再生医学的发展，人们发现BMSCs成骨性分化能力的下降是发生骨质疏松症的重要原因，因此研究重点逐渐集中于成骨细胞来源的BMSCs上。

BMSCs是存在于骨髓的非造血干细胞，正常情况下处于未分化状态，可自我增殖，具有多向分化潜能和高度自我更新能力，在适宜条件下，可向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、心肌样细胞、脂肪细胞等分化^[11-15]。由于成骨分化潜能，BMSCs被看作是在骨修复和骨再生过程中最有价值的细胞种类，已成为骨组织工程领域研究热点。BMSCs植入体内后可对骨缺损进行相应的修复，新生骨组织也具备完好的功能^[11-18]。随着对BMSCs骨向分化过程的深入了解，可为研究骨质疏松症的发病机制提供一种新的手段和方法，建立防治骨质疏松的药物筛选平台。在研究中，采用全骨髓结合贴壁法培养BMSCs，传代后纯度可达95%以上，生长状态稳定，细胞活性高。通过流式细胞术检测细胞表型，CD44、CD29、CD90呈阳性表达，阳性表达率分别为99.3%、99.2%及99.97%，主要表达于黏附分子中，参与BMSCs的贴壁作用；造血干细胞的表面标志CD45、CD34、CD14呈阴性表达，因此可判定培养的细胞为BMSCs。

中医认为，“肾主骨生髓”，肾虚则髓减骨枯。肾藏精，精生髓而髓又能养骨，肾精足则骨髓生长有源，骨骼得到营养而强劲。补肾壮骨中药方剂用于治疗骨折和骨质疏松症在中国有悠久的历史，许多基础研究也证实多种成分能够促进BMSCs增殖和骨向分化，包括地黄多糖、肉苁蓉、骨碎补总黄酮、淫羊藿等^[19-26]。体外研究表明，淫羊藿苷对于骨代谢过程中的成骨细胞或间充质干细胞的骨形成活性及破骨细胞的骨吸收活性具有重要调节作用。淫羊藿苷能够抑制 RANKL的表达，减少TRAP染色阳性细胞数量，降低骨吸收所需的过氧化物活性。体内研究表明，淫羊藿苷能够抑制骨质疏松模型大鼠的骨量丢失，具有提高青年大鼠峰值骨量的能力。有研究发现，左归丸含药血清能够增强MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶活性和矿化作用，上调碱性磷酸酶蛋白的表达水平，促进MC3T3-E1成骨细胞分化，参与骨形成。实验结果表明，左归丸含药血清可能部分通过p38MAPK信号通路干预MC3T3-E1成骨细胞分化。抗骨增生胶囊为复方制剂，由熟地黄、肉苁蓉、骨碎补、淫羊藿、鸡血藤、牛膝、狗脊、女贞子、莱菔子等药物组成的，临床上常用于骨关节炎的治疗。课题组在前期研究中发现其对骨折的愈合有促进作用，对于BMSCs成骨分化有无促进作用，目前尚未见相关报道。在研究中，通过MTT检测结果发现，中、高剂量组对BMSCs增殖有促进作用，高剂量组对BMSCs的增殖促进作用更明显。

碱性磷酸酶是骨形成的早期标志，与成骨细胞分化成熟正相关，其活性可反映BMSCs成骨方向分化趋势的强弱。在分化的早期，碱性磷酸酶便开始表达，而碱性磷酸酶的高峰表达则出现在增殖期，为矿化期磷酸盐的积聚提供有利条件。茜素红染色常用于检测细胞外基质中矿化结节的形成，随着诱导分化时间增加，成骨分化越来越好，钙盐沉积也越来越多。茜素红染色阳性表明培养的细胞具有成骨功能。实验结果显示，抗骨增生胶囊诱导BMSCs后，碱性磷酸酶活性随时间增加而增高且具有浓度依赖性；碱性磷酸酶染色阳性表达，提示其具有诱导BMSCs合成碱性磷酸酶的作用，并可调节其分化。诱导14 d，可见胞外基质中有大小不等的聚集团状结节，茜素红染色将结节中沉积的钙盐染成红色，高剂量组形成的结节更大、更致密。综合以上结果，抗骨增生胶囊可促进大鼠BMSCs的增殖和骨向分化。

研究观察含抗骨增生胶囊血清预处理对BMSCs增殖及骨向分化的影响，从细胞分子水平考察了抗骨增生胶囊的抗骨质疏松的作用，实验结果显示，含中、高剂量抗骨增生胶囊血清对BMSCs增殖有促进作用，且对BMSCs分泌碱性磷酸酶有促进作用，高剂量组效果更明显。本课题是对抗骨增生胶囊对大鼠BMSCs增殖和骨向分化作用的初步研究，具体机制还有待于进一步的深入研究和总结。实验对于拓展其治疗范畴提供理论依据及实验基础，为骨质疏松症的治疗提供一种新的途径和思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程