外周血干细胞输注对肺腺癌免疫行为的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.017

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
外周血干细胞：外周血干细胞是存在于外周血中的干细胞。正常情况下，外周血中的干/祖细胞的含量占单个核细胞的 0.01%-0.1%，相当于骨髓的1%-10%，动员后外周血单个核细胞中CD34⁺细胞数及CFU-删数均明显高于骨髓。迄今已发现多聚阴离子化合物(如硫酸葡聚糖)、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能有效地动员骨髓和其他部位的造血干/祖细胞进入外周血。
密度梯度离心法：是自体外周血干细胞分离中最为普遍的方法之一，该方法主要利用细胞在物理学(密度)等方法存在的差异对细胞进行分离，该方法获得的细胞纯度相对较高，操作也相对比较简单，能够克服传统分离方法产生的弊端。

摘要
背景：目前临床上自体外周血干细胞分离鉴定方法相对较多，尚缺乏统一的标准。同时自体外周血干细胞在肺腺癌移植治疗过程中对免疫的影响也缺乏报道。
目的：探讨自体外周血干细胞的分离、鉴定方法，观察自体外周血干细胞移植对肺腺癌大鼠免疫功能的影响。
方法：采用密度梯度离心法从Wistar大鼠外周血分离单个核细胞并进行鉴定。将18只Wistar大鼠随机分为常规处理组和细胞移植组，每组9只，建立肺腺癌模型，常规处理组不给予任何方法治疗，细胞移植组经尾静脉注入0.2 mL含有2.5×10⁶ L^-1的自体外周血干细胞悬液，大鼠治疗后检测其免疫指标。2组大鼠分别于治疗4，10，14 d后麻醉处死(n=3)，观察自体外周血干细胞移植治疗对肺腺癌免疫行为的影响。
结果与结论：①从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现圆形或者椭圆形，且体积相对较小；自体外周血干细胞培养5 d后细胞生长迅速，圆形细胞开始向两端伸展，并呈现梭形，从而能够形成较小的细胞集落；自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期；②流式细胞仪分选纯化的细胞，干细胞因子受体CD90、CD133及Flk-1均有表达，提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞；③自体外周血干细胞培养4，10，14 d后检测其表面抗原表达结果显示，CD90，CD133呈现先升高后下降趋势；Flk-1呈现上升趋势；④在移植治疗后第4，10，14天，细胞移植组免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6显著高于常规处理组(P < 0.05)，而核因子κB显著低于常规处理组(P < 0.05)；⑤结果提示，自体外周血干细胞分离、鉴定方法比较简单，并且应用于治疗肺腺癌能够分泌大量营养因子，治疗过程中能够增强机体免疫。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-6612-8961(王美江)

关键词: 干细胞, 移植, 自体外周血干细胞, 分离, 鉴定, 肺腺癌, 治愈率, 免疫指标, 增殖能力, 肿瘤坏死因子诱导蛋白6, 核因子κB

Abstract:

BACKGROUND: Although clinical methods for autologous peripheral blood stem cell separation and identification are relatively more, there is no unified standard. Moreover, little is reported on immune effects on lung adenocarcinoma during autologous peripheral blood stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To study the effect of autologous peripheral blood stem cell transplantation on immunological function of lung adenocarcinoma rats by exploring the separation and identification methods of autologous peripheral blood stem cells.
METHODS: The mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of Wistar rats by density gradient centrifugation method and then identified. Eighteen Wistar rats were randomly divided into routine treatment group and cell transplantation group, with nine rats in each group. Animal models of lung adenocarcinoma were established in the rats, and underwent no treatment in the routine treatment group but injection of autologous peripheral blood stem cell suspension (0.2 mL, 2.5×10⁶/L) via the tail vein in the cell transplantation group. Immune indicators were detected in two groups after treatment. Three rats from each group were anesthetized and scarified at 4, 10, 14 days after treatment, respectively. Afterwards, we detected the effects of autologous peripheral blood stem cell transplantation on immunological function of lung adenocarcinoma rats.
RESULTS AND CONCLUSION: Newly isolated mononuclear cells from rat peripheral blood showed a round or oval shape and were relatively small in size. After 5 days of culture, autologous peripheral blood stem cells grew rapidly, and the round cells began to spread to both ends and became spindle-shaped, thereby forming small colonies. Autologous peripheral blood stem cells induced in vitro experienced three stages successively: cell arrest, logarithmic and plateau phases. Flow cytometry showed that sorted cells were identified as autologous peripheral blood stem cells by expressing CD90, CD133 and Flk-1. After 4, 10 and 14 days culture, the expression of CD133 increased first and then descended, and Flk-1 showed an increasing trend. Compared with the routine treatment group, the expression of tumor necrosis factor-α induced protein 6 in the cell transplantation group was significantly higher (P < 0.05), while the expression of nuclear factor κB was significantly lower (P < 0.05). In conclusion, the isolation and identification methods of autologous peripheral blood stem cells are simple and can be used to secrete a large number of nutritional factors in the treatment of lung adenocarcinoma, which can enhance body immunity in the treatment.

Key words: Peripheral Blood Stem Cell Transplantation, Lung Neoplasms, Adenocarcinoma, Cell Separation, Immunity, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 纳入18只Wistar大鼠进行分组实验，分为2组，全部进行结果分析，中途无脱失。

2.2 自体外周血干细胞形态学观察 从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现出圆形或者椭圆形且体积相对较小，见图1A。自体外周血干细胞培养5 d后细胞生长迅速，圆形细胞开始向两端伸展，并呈现梭形，从而能够形成较小的细胞集落，见图1B。

2.3 自体外周血干细胞传代生长情况 自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期。自体外周血干细胞第1-3代整体呈现增长趋势，但是随着代数的增加细胞增殖能力出现下降，见表1。

从图2可以看出，自体外周血干细胞总体呈现正增长趋势，且随着代数降低，细胞增殖降低。

2.4 自体外周血干细胞鉴定 原代细胞经过传代扩增，再由流式细胞仪分选纯化的细胞，干细胞因子受体CD90、CD133及Flk-1均有表达，见图3。提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞。

2.5 流式细胞仪鉴定结果 自体外周血干细胞培养第4，10及14天检测其表面抗原表达结果显示，CD90，CD133呈现先升高后下降趋势，Flk-1呈现上升趋势，见表2。从图4可以看出，自体外周血干细胞CD90、CD133呈现先上升后下降的趋势；ELK-1呈现上升趋势。

2.6 自体外周血干细胞对肺腺癌移植治疗的免疫影响 细胞移植组自体外周血干细胞移植治疗后免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6在第4，10，14天显著高于常规处理组 (P < 0.05)；核因子κB在第4，10，14天显著低于常规处理组(P < 0.05)，见表3。由此看出，自体外周血干细胞能发挥其抗炎和免疫调节作用。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年11月至2015年11月在遵义医学院完成。

1.3 材料

实验动物：选取18只Wistar大鼠，清洁级，体质量350-450 g，平均(423±38) g，雌雄不拘，实验动物均由遵义医学院提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为许可证号：SYXK(黔)2011-0039。对Wistar大鼠进行等条件喂养，处理方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[12-13]。

18只大鼠按随机数字表法分为2组，常规处理组及细胞移植组各9只。

主要仪器及试剂：DMEM培养基(Gibco公司)，CO₂培养箱(美国Thermo Forma公司)，乙二胺四乙酸(EOTA)(北京化工厂)，倒置相差显微镜(日本 OLYMPUS公司)，通用型SP-9000免疫组化染色试剂盒(北京天来生物医学科技公司)，小鼠抗细胞角蛋白多抗(武汉博士德生物工程公司)，抗体稀释液(武汉博士德生物工程公司)等。

1.4 方法

自体外周血干细胞分离、鉴定：①外周血单个核细胞获取：肺腺癌模型制备前取细胞移植组9只Wistar大鼠，在腹腔注入10%浓度为3 mL/kg水合氯醛进行麻醉，待麻醉生效后将大鼠固定在手术台上，仰卧，在其背部置入一个粗食管，充分暴露主动脉，抽取10 mL血液，加入PBS混合均匀，5 min离心，离心速度为1 500 r/min^[14-15]；②细胞培养：将获得的末次洗涤液，取出上层清液，将浓度为2×10⁶/cm²接种在载玻片上，并将其放置在37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中，每2 d换液1次，观察细胞生长情况及其形态^[16-17]；③细胞传代：待细胞融合培养皿80%后开始传代培养，在显微镜下观察细胞形态，看见细胞变圆脱离瓶底后终止消化，离心5 min，获取自体外周血干细胞^[18-19]；④自体外周血干细胞鉴定：利用传代方法收集细胞，将处理好的自体外周血干细胞单个细胞悬液按照5×10⁹ L^-¹细胞浓度分装到EP管中，向每个EP管中各加入1 μL抗体(包括Flk-1、PE-CD133、PE-CD90)，充分混合均匀后放置在4 ℃冰箱进行30 min反应，向每个样品中各加入1 mL含有体积分数2%胎牛血清的终止染色反应，5 min离心，速度1 200 r/min，去除上层清液，350-400 μL PBS回溶沉淀并转移到流式管中送检。

肺腺癌模型大鼠建模及处理方法：18只Wistar大鼠均采用浓度为3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾。大鼠仰卧固定在手术台上，将50 mL浓度为2.5×10⁷ pfu的AsCre Capi加入到69ilMEM中，再加入6 μL的2.5 mol/L的氯化钙的供沉淀物，滴入Wistar大鼠鼻腔，共滴入125 μL，分2次滴入，间隔5 d重复滴入，重复2次，连续滴入30 d，建立Wistar大鼠肺腺癌模型。在影像学检查下观察大鼠肺部情况，对于存在明显占位大鼠视为建模成功。

将18只大鼠按随机数字表法分为2组，常规处理组不给予任何方法治疗；细胞移植组采用自体外周血干细胞移植治疗，经大鼠尾静脉注入0.2 mL含有2.5×10⁶ L^-¹的自体外周血干细胞悬液。2组大鼠治疗4，10，14 d后麻醉处死(n=3)，进行相关指标观察^[20-21]。

1.5 主要观察指标 ①观察自体外周血干细胞形态：待自体外周血干细胞成功分离鉴定后在细胞生长过程采用倒置显微镜观察细胞的形态^[22]；②观察自体外周血干细胞传代生长情况：利用细胞计数板完成细胞计数；③采用流式细胞仪鉴定细胞表面因子水平^[23-24]；④观察自体外周血干细胞移植治疗对肺腺癌免疫行为的影响：为了进一步说明自体外周血干细胞对抗炎和免疫调节的作用，采集大鼠3 mL静脉血，利用细胞计数板完成细胞计数，从mRNA和蛋白质水平分析抗炎因子肿瘤坏死因子诱导蛋白6和转录因子核因子κB的表达，相关操作必须严格遵循试剂盒参数指标进行测定^[25-26]。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较2组数据间差异有显著性意义。

讨论

肺癌是临床上常见的疾病，这种疾病发病率较高，且近年来该疾病发生率呈现上升趋势。根据《2013年中国肿瘤登记年报》结果显示，肺癌发生率和死亡率占据恶性肿瘤首位，已经成为近2年威胁人类健康的头号杀手^[27-28]。而肺腺癌占肺癌的40%，属于肺癌的主要形式^[29]。常规方法更多的以化疗为主，该方法虽然能改善患者症状，但是创伤较大，治疗预后较差，5年生存率仅有15%。自体外周血干细胞是一种特殊的细胞，从传统理论上来说，出生后血管的生成以及血管损伤修复就得到更新，该方法能够为肿瘤的治疗提供新的思路^[30-32]。

目前，临床上对于自体外周血干细胞的分离方法相对较多，如免疫磁珠法、流式细胞仪法以及密度梯度离心法等^[33]。密度梯度离心法是自体外周血干细胞分离中最为普遍的方法之一，该方法主要利用细胞在物理学(密度)等方法存在的差异对细胞进行分离，该方法获得的细胞纯度相对较高，操作也相对比较简单，能够克服传统分离方法产生的弊端^[34-35]。本实验从大鼠外周血新分离的单个核细胞呈现出圆形或者椭圆形且体积相对较小。自体外周血干细胞培养5 d后细胞生长迅速，圆形细胞开始向两端伸展，并呈现梭形，从而能够形成较小的细胞集落。对于胚胎干细胞还是成体干细胞的诱导、分化均需要适合的微环境，对分离出的细胞应该根据目的细胞的需要增加不同的生长因子，以保证能进行预期培养^[36-37]。本研究中，自体外周血干细胞体外诱导培养后先后经历了生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期。自体外周血干细胞第1到第3代整体呈现增长趋势，但是随着代数的增加细胞增殖能力出现下降。自体外周血干细胞是一种具有游走功能并且能增殖分化为成熟内皮细胞，单一的从细胞形态上难以做出准确的鉴定^[38]。本文中原代细胞经过传代扩增，再由流式细胞仪分选纯化的细胞，主要表达干细胞因子受体c-kit，但是CD34、CD45、CD31及Lineage等几乎不表达。提示分离培养获得的细胞为自体外周血干细胞。同时，自体外周血干细胞与一些造血干细胞相同的细胞标记，如CD90，CD134等，这些细胞标记能够更加清晰的显示自体外周血干细胞的生物学特性，能为肿瘤的治疗提供新思路^[39]。

本文中自体外周血干细胞培养4，10以及14 d后检测其表面抗原表达结果显示，CD90呈现先升高后下降趋势；CD133呈现先升高后下降趋势；Flk-1呈现上升趋势。

自体外周血干细胞在植入治疗肺腺癌时能够发挥其抗炎和免疫抑制作用，其机制相对复杂，可能与一些抑制因子等关系密切。并且，部分因子已经被报道参与自体外周血干细胞的免疫调节中，如一氧化氮合成酶、吲哚胺2，3等，但是其具体机制尚需要进一步研究和探讨^[40-49]。本实验中细胞移植组移植治疗后免疫指标肿瘤坏死因子诱导蛋白6在第4，10，14天，显著高于常规处理组(P < 0.05)；细胞移植组移植治疗后免疫指标核因子κB在第4，10，14天显著低于常规处理组(P < 0.05)。由此看出，自体外周血干细胞能发挥其抗炎和免疫调节作用，通过植入自体外周血干细胞能调节机体免疫，改善大鼠症状，从而能发挥明显的抑瘤作用。

综上所述，自体外周血干细胞分离、鉴定方法比较简单，并且运用与肺腺癌中能够分泌大量营养因子，引导和促进组织再生，进行自我更新和增殖，且治疗过程中能够增强机体免疫，具有较高的临床应用价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程