3D打印丝素蛋白/胶原蛋白支架的制备及性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.021

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (2): 280-285.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.021

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3D打印丝素蛋白/胶原蛋白支架的制备及性能

孙凯¹，李瑞欣²，范猛¹，李轶津¹，董宝康¹，李晖³

¹天津市第一中心医院，天津市 300192；²军事医学科学院卫生装备研究所，天津市 300161；³天津医科大学总医院骨科，天津市 300052

收稿日期:2016-11-03 出版日期:2017-01-18 发布日期:2017-02-27
通讯作者: 李晖，天津医科大学总医院骨科，天津市 300052 李瑞欣，副研究员，军事医学科学院卫生装备研究所，天津市 300161
作者简介:孙凯，男，1989年生，山东省济宁市人，汉族，2015年天津医科大学毕业，硕士，主要从事骨关节疾病及生物材料的制备研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31470935)

Three-dimensional printed silk fibroin/collagen scaffold and its performance

Sun Kai¹, Li Rui-xin², Fan Meng¹, Li Yi-jin¹, Dong Bao-kang¹, Li Hui³

¹Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China; ²Institute of Medical Equipment, Academy of Military and Medical Sciences, Tianjin 300161, China; ³Department of Orthopaedics, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Received:2016-11-03 Online:2017-01-18 Published:2017-02-27
Contact: Li Hui, Department of Orthopaedics, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China Li Rui-xin, Associate researcher, Institute of Medical Equipment, Academy of Military and Medical Sciences, Tianjin 300161, China
About author:Sun Kai, Master, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31470935

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
3D打印技术：是指在计算机控制下，根据物体的计算机辅助设计(CAD)模型或计算机断层扫描(CT)等数据，通过材料的精确3D堆积，快速制造任意复杂形状3D物体的新型数字化成型技术。3D打印技术的基本制造过程是按照分层制造、逐层叠加的原理。
3D打印技术主要特点和优势：①高分辨率：分辨率高达2 880×1 440，其喷头射出墨滴直径与人体组织器官中细胞分布很相似，这使得利用喷墨打印技术精确的种植细胞和打印生物组织细微结构成为可能；②高速打印：3D打印机打印一张A4纸大小的照片只需大约1 min，可以运用喷墨打印技术快速的打印和组装生物活性组织；③非接触性打印：这使得喷墨打印机不仅能在纸上打印，也可在固体支架材料和液体上打印，而且非接触性打印也减少了打印过程中污染的概率，有利于了后续支架上细胞的培养。

背景：目前，大量研究者致力于寻求可制备出具有优良孔隙、力学性能佳、生物相容性好的三维多孔支架材料方法，其中3D打印技术的快速发展为此提供了较好的技术支持。
目的：采用3D打印技术制备丝素蛋白/胶原蛋白复合支架，并对其进行表征。
方法：采用3D打印技术制备丝素蛋白/胶原蛋白复合支架，设置丝素蛋白与胶原蛋白的质量比分别为 4∶2、4∶4，检测两种复合支架的孔隙率、吸水膨胀率、力学性能及孔径。将第3代大鼠骨髓间充质干细胞接种于两种复合支架上，接种13 d时进行MTT检测，接种14 d时进行苏木精-伊红染色和扫描电镜观察。
结果与结论：①4∶2复合支架组的孔隙率、孔径、吸水膨胀率均大于4∶4复合支架组(P < 0.05)，两组复合支架的弹性模量比较差异无显著性意义；②随着接种时间的延长，两组复合支架上的骨髓间充质干细胞数量逐渐增加，4∶2复合支架组细胞数量始终多于4∶4复合支架组(P < 0.05)；③4∶2复合支架内部细胞较多且分布均匀，4∶4复合支架内部细胞较少且分布不均匀；④结果表明，将丝素蛋白与胶原蛋白以质量比 4∶2混合，采用3D打印技术制备的丝素蛋白/胶原蛋白复合支架具有良好的理化性能和细胞相容性。

ORCID: 0000-0001-5339-4865(李瑞欣)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 丝素蛋白, 3D打印, 胶原蛋白, 质量比, 复合支架, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Searching for a porous three-dimensional (3D) scaffold holding good porosity, mechanical property and biocompatibility has become a hot spot, in which, 3D printing technology also plays apart.
OBJECTIVE: To prepare silk fibroin/collagen scaffolds using 3D printing technology and detect its performance.
METHODS: Silk fibroin/collagen scaffolds were constructed using 3D printing technology, and the silk fibroin/collagen mass ratio was 4:2 (group A) and 4:4 (group B), respectively. The porosity, water absorption expansion rate, mechanical properties and pore size of the composite scaffolds were detected. The passage 3 rat bone marrow mesenchymal stem cells were seeded onto the two scaffolds. The cell proliferation was detected using MTT assay at 13 days of culture, and the cell morphology was observed by hematoxylin-eosin staining and scanning electron microscope at 14 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The porosity, pore size, and water absorption expansion rate of group A were significantly larger than those of group B (P < 0.05), while the elasticity modulus showed no significant difference between groups. Bone marrow mesenchymal stem cells on the two scaffolds increased gradually with time, especially in the group A (P < 0.05). Abundant cells distributed evenly in the group A, while few cells distributed unevenly in the group B. These results suggest that the 3D printed scaffolds composed by silk fibroin/collagen mass ratio of 4:2 holds good physicochemical performance and cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Silk, Collagen, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙凯，李瑞欣，范猛，李轶津，董宝康，李晖. 3D打印丝素蛋白/胶原蛋白支架的制备及性能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 280-285.

Sun Kai, Li Rui-xin, Fan Meng, Li Yi-jin, Dong Bao-kang, Li Hui.

Three-dimensional printed silk fibroin/collagen scaffold and its performance

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 280-285.

图/表（结果） 6

2.1 复合支架外观低温三维打印技术制备的支架见图1，可见两组支架材料大体白色，内部结构规则，4∶2复合支架组孔径大小均一，4∶4复合支架组孔径较小，两组支架压缩后均可恢复原貌。

2.2 复合支架的孔隙率 4∶2、4∶4复合支架组的孔隙率分别为(99.2±1.2)%、(70.6±1.3)%，两组间孔隙率比较差异有显著性意义(P=0.004)。

2.3 复合支架的吸水膨胀率 4∶2、4∶4复合支架组的吸水膨胀率分别为(1 710.7±172.6)%、(683.0±121.8)%，两组间吸水膨胀率比较差异有显著性意义(P=0.046)。

2.4 复合支架的力学性能两组复合支架支架冷冻干燥后质地柔韧，具有延展性和黏弹性。力学性能的测试以弹性模量为检测指标。4∶2、4∶4复合支架组的弹性模量分别为(22.3±2.2)，(30.1±3.2) kPa，两组间弹性模量比较差异无显著性意义(P=0.18)；应力-应变曲线显示，两组支架均具有良好的黏弹性，见图2。

2.5 复合支架的孔径 4∶2、4∶4复合支架组的孔径分别为(183±20)，(110±33) μm，两组间孔径比较差异无显著性意义(P=0.17)。4∶2复合支架组孔径大小较为一致，与软骨细胞大小相符，内部可见各孔隙之间连通性好；4∶4复合支架组孔径较小，见图3。

2.6 复合支架的细胞相容性 MTT检测示结果示，随着培养天数的增加，4∶2复合支架组A值明显高于4∶4复合支架组，说明4∶2复合支架组细胞数明显多于4∶4复合支架组(P=0.001)，见图4。

2.7 苏木精-伊红染色结果培养14 d后，镜下见4∶2复合支架组细胞分布均匀，细胞数量多；4∶4复合支架组细胞数量少且分布不均匀。4∶2复合支架组、4∶4复合支架组支架内部细胞计数分别约为(310±30)，(80±15)个/HP，4∶2复合支架组明显多于4∶4复合支架组(P=0.02)。细胞在培养初期沿着支架材料内部空隙贴壁生长，成梭型，分布较分散，数量较少；随着培养天数的增加，细胞呈集落样生长，可明显看到细胞间连接，见图5。

2.8 扫描电镜观察结果培养14 d后，扫描电镜见4∶2复合支架组内部干细胞在内部生长良好，伸展充分，细胞与支架黏附良好，并分泌大量的细胞外基质，孔径及孔隙均已被覆盖；4∶4复合支架组支架内部细胞数量少，细胞间的连接少，孔隙大量存在，见图6。

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引言

临床上由于创伤、关节软骨损伤的炎症、肿瘤和其他原因，导致软骨损伤极为普遍^[1-3]。利用自体软骨细胞移植治疗软骨缺损，其来源少且会造成二次损伤^[4-6]。使用异体软骨移植不仅有排斥反应，而且此类治疗方法产生的软骨样组织在生物学性能和功能上与正常软骨组织相差甚远且易退变^[5-10]。近年来组织工程的快速发展，使软骨损伤的完全修复成为可能^[11-14]。

目前采用的天然材料主要包括丝素蛋白、胶原蛋白等。丝素蛋白是人类利用最早的天然纤维之一，随着分子生物技术的进步，丝素蛋白在生物材料、医疗等领域运用越来越广泛。丝素蛋白的主要优势在于无毒、价廉、来源充足及具有良好的生物相容性，在生物医学领域有广泛用途^[7]。丝素蛋白在组织工程中的应用日益深入，大量实验发现其强度好、黏弹性稳定^[6]。然而其也存在相关的缺陷，有研究发现在丝素蛋白材料内部长入的细胞较少，甚至有的细胞无法长入^[3，6-7]。胶原蛋白为软骨基质的主要成分，以胶原蛋白为原料的支架有利于细胞黏附并对细胞起支持保护作用。胶原蛋白支架的缺点是降解速度快、机械应力强度不足，目前常与其他材料复合使用^[6-7]。

大量研究者致力于寻求可制备出具有优良孔隙、力学性能佳、生物相容性好的三维多孔支架材料方法^[15-17]。目前常用的组织工程支架构建方法主要有：①粒子析出法：是利用粒径分布的水溶性粒子，如NaCl盐粒、明胶微球等作致孔剂，可制得一定孔径分布和孔隙率的组织工程多孔支架；②气体发泡法：是采用超临界气体技术制备多孔支架的方法；③烧结法：是将可降解聚合物颗粒加入模具中，加热至玻璃化温度以上，保持一定时间后冷却、脱模后制得烧结颗粒支架；④冷冻干燥法：是利用深度冷冻的溶剂真空升华的原理而制备多孔支架的一种方法。随着近年来3D打印技术的快速发展，采用3D打印技术制备生物支架成为了可能^[7]。3D打印技术是指在计算机控制下，根据物体的计算机辅助设计(CAD)模型或计算机断层扫描(CT)等数据，通过材料的精确3D堆积，快速制造任意复杂形状3D物体的新型数字化成型技术。3D打印技术的基本制造过程是按照分层制造、逐层叠加的原理^[4，18-19]。采用3D打印技术通过对孔隙结构的控制，制备出形气孔率可调范围大、形状复杂、孔隙率较高、力学性能好的材料。实验在相关研究基础上^[3]，采用丝素蛋白与胶原蛋白为打印基质，利用三维打印技术调配质量比例，对不同质量比的丝素/胶原复合支架进行分析，探索相关打印条件，探讨3D打印软骨组织工程支架的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计样本观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2014年7月至2015年6月在军事医学科学院卫生装备研究所完成。

1.3 材料

实验动物：2月龄Wistar大鼠，雌雄不拘，体质量120 g，由军事医学科学院卫生环境医学研究所二级动物房提供。

主要试剂及仪器：桑蚕丝、新鲜牛肌腱(北京索莱宝生物科技有限公司，中国)；MTT(噻唑蓝，上海贝博生物公司中国)；UV-1206型紫外分光光度计(日本岛津公司)；S3000N扫描电镜(Hitachi公司，日本)、Instron5865力学试验机(Instron公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 丝素蛋白的制备 ①脱胶：将适量桑蚕丝置于0.5%无水碳酸钠溶液中90 ℃煮3次，30 min/次。60 ℃烘箱内烘干，溶解于CaCl₂•CH₃CH₂OH•H₂O(摩尔比1∶2∶8)的三元溶液2 h，自然冷却后以8 000 r/min离心10 min，取上清液；②透析：将蚕丝溶液冷却置入截流分子量为3 500 u的透析袋中，流动自来水透析48 h，去离子水透析24 h，每2 h换水1次；③浓缩：透析后的丝素蛋白液体置入40%聚乙二醇20 000溶液中浓缩12 h，4 ℃冰箱保存。

1.4.2 胶原蛋白的制备取新鲜牛肌腱，剥净外膜，清除脂肪，粉碎，使用0.05 mol/L Tris 缓冲液浸泡24 h，收集沉淀，加入含胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清；加入 3.5 mol/L NaCl溶液，收集盐析沉淀物，4 ℃去离子水透析5 d^[3]。

1.4.3 3D打印技术制备复合支架

打印基质：实验在相关研究基础上^[3]，以丝素蛋白和胶原蛋白作为打印基质(具体基质溶液制备方法参考前期研究^[1-3])进行打印。

打印方法：将丝素蛋白与胶原蛋白质量比分别设为 4∶2、4∶4 ，将两种溶液充分混合，使用计算机辅助软件(CAD)SolidWorks设计模型，输出文件为STL格式，将文件导入三维打印控制软件中，设置打印参数：下沉速率 10 mm/s，打印厚度0.3 mm，平台温度-20 ℃，喷射速率0.09 mm/min，孔隙厚度0.36 mm。将两种不同质量比的溶液装入低温打印机料筒中，低温条件下，打印成型。冷冻干燥，⁶⁰Co灭菌后备用^[3]。

1.4.4 骨髓间充质干细胞的分离培养取2月龄健康Wistar大鼠，脱颈处死，浸泡于体积分数75%乙醇中10 min，无菌条件下剥离双下肢软组织、筋膜，暴露出长骨即股骨和胫骨，分离剥除骨干附着肌肉，彻底剥离干净，浸泡骨干于PBS中。修整去除干骺端，无菌注射器吸取完全培养液，插入骨髓腔，冲洗至冲洗液澄清，骨干泛白，1 000 r/min离心5 min。按照大鼠骨髓间充质干细胞分离液使用说明书设置混合液：分离液为2∶1。移液管吸取细胞混悬液，距离 Percoll工作液面上2 cm处沿管壁缓慢加入细胞悬液，2 000 r/min离心20 min。收集中间云雾层(约2 mm厚度)，完全培养液吹打洗涤2次(勿用力吹打，以免造成干细胞破裂)，1 000 r/min离心5 min。完全培养液吹打细胞，注入培养瓶，置于CO₂培养箱中(条件为37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO₂)。48 h后第1次换液，以后每3 d换液1次，细胞铺满培养瓶底70%-80%时，可进行1∶2 比例传代，周期为5-7 d。以流式细胞仪鉴定干细胞。

1.4.5 复合支架性能检测

孔隙率测定：采用改良液体位移法测定支架材料孔隙率^[1，3]。取体积为V₁的无水乙醇至量筒，将干燥支架样本浸入其中5 min，真空抽气至乙醇中无气泡，记录此时乙醇体积为V₂；取出支架，记录此时体积为V₃。计算支架孔隙率：(V₁-V₃)/(V₂-V₃)×100%。每组测定3个样本，取均值^[3]。

吸水膨胀率测定：每组取3个干燥支架样本，浸于pH=7.4的0.01 mol/L PBS 中24 h，至平衡。吸干表面水分称重质量记为m₀，干燥箱内干燥12 h后称质量记为 m₁，按以下公式计算吸水膨胀率：(m₀－m₁)/m₁×100%，取均值^[1-3]。

力学性能检测：支架动态力学性能是用于表示支架在湿态下循环载荷下的力学行为^[1，3]。利用 Instron5865材料试验机对支架进行力学性能测定。37 ℃下将支架浸入到 pH=7.4的PBS中24 h直至平衡，测定两组样品压缩应变的弹性模量。采用0.5 Hz 锯齿波形，预载荷为0.1 N，增量为50%，速度为100%/min，循环3次；每组样品测量3块支架，绘制应力-应变曲线，所得数据计算平均值和标准差，得出支架的弹性模量参数^[1，3]。

孔径测定：每组取3个样本，扫描电镜下观察空白支架的内部结构、孔隙联通性及孔径大小，测量孔径大小取均值。

MTT法检测细胞相容性：具体操作方法同前期相关研究^[1，3]：将待测复合支架分别加入完全培养液，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内静置24 h。在两组复合支架上分别接种100 μL第3代骨髓间充质干细胞(2×10¹⁰ L^-1)，持续培养2周，于1，3，5，7，9，11，13 d采用MTT法检测细胞增殖：将复合物移入24孔板，滴加MTT溶液2 mL，继续培养箱中培养4 h；吸干培养液和MTT的混合液，加入DMSO 2 mL，吸管吹打充分溶解后，可观察其颜色，10 min后96孔板内每孔加入100 μL待检测；酶标仪在波长为520 nm测量A值。将各测试孔的A值减去调零孔A值，各重复孔的A值取平均数，所得数据用Origin进行分析，并绘制生长曲线。

苏木精-伊红染色和扫描电镜观察^[¹^，^3]：将100 μL第3代骨髓间充质干细胞以2×10¹⁰ L^-1的细胞浓度分别接种于两种复合支架上，持续培养14 d，取出样本。取出后用PBS冲洗3次，用体积分数10%甲醛PBS溶液固定细胞/支架复合物，石蜡包埋，以5 μm的厚度连续切片，进行苏木精-伊红染色。组织学染色观察材料中的细胞形态；取出后用PBS冲洗3次，将支架放入含4%戊二醛的PBS中，37 ℃孵育1.0-2.0 h，然后放入4 ℃固定过夜，2%锇酸固定2 h，然后系列乙醇脱水，样品喷金后在扫描电镜上观察细胞在支架材料上的黏附及伸展状态。苏木精-伊红染色主要观察细胞数量、形态、生长及增殖方式、状态、细胞间是否有连接；扫描电镜主要观察细胞伸展状态、孔隙、孔径是否已填满及细胞分泌基质。

1.5 主要观察指标复合支架的理化性能和细胞相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0及Origin 7.5统计软件进行统计学分析。符合正态性及方差齐性的数据，两组间比较差异性采用独立样本t 检验；数据不正态或者方差不齐的，组间比较采用秩转换的非参数检验(Kruskal-Wallis H)。检验水准α=0.05。以P < 0.05作为判断差别显著性的标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

3.1 3D打印所带来的创新性与优势组织工程支架的制备需有较好的致孔作用，目前常用的有物理和化学交联法、相分离法、快速成型技术、低温干燥法等^[8，20-34]。

研究采用3D打印技术，3D打印技术技术是在基底表面铺上薄层原料然后通过计算机CAD模型控制喷头按照指定路径将液态原料喷在设定区域，底层黏结后上下移动操作台，并在黏结层表面铺上新的，通过逐层黏结，获得三维原型材料^[2]。3D打印技术操作简便、产品具有高孔隙率。与传统的冷冻干燥法、化学交联方法相比，三维打印成形技术在支架材料的制备过程中，尤其是制备结构复杂、可控支架材内部微结构材料中具有更大的优势；其设计制造一体化，成型过程高度柔性化和快速化。通过三维打印技术，通过定向堆积形成多样化的功能结构和模型，获得可塑形态、结构复杂的功能材料。现阶段研究的主要方向为微滴喷射技术。数字微滴喷射是指在数字信号的激发下，采用物理手段，使工作腔内的流体材料的一部分在短时间内脱离母体，成为一个微滴或一段连续的射流，以一定的响应率和速度从喷嘴喷出，并以一定的形态喷射到指定位置，按照一定的序列堆积，形成三维实体试件。研究采用的3D打印技术主要特点和优势主要有：①高分辨率：分辨率高达2 880×1 440，其喷头射出墨滴直径与人体组织器官中细胞分布很相似，这使得利用喷墨打印技术精确的种植细胞和打印生物组织细微结构成为可能^[4]；②高速打印：3D打印机打印一张A4纸大小的照片只需大约1 min^[4]，可以运用喷墨打印技术快速的打印和组装生物活性组织；③非接触性打印：这使得喷墨打印机不仅能在纸上打印，也可在固体支架材料和液体上打印，而且非接触性打印也减少了打印过程中污染的概率，有利于了后续支架上细胞的培养^[7-8]。此外，打印出成型的支架后，快速的冷冻技术也是制备支架的关键要素。否则在打印制备过程中，底层的支架自动解体，塑性失败。研究采用的低温成型技术较好的解决了这一问题。将打印成型的支架置入-20 ℃中，在保存最先打印出的底部结构的同时，对上层的结构也有较好的塑性作用。

3.2 3D打印支架性能对比分析研究从3D打印支架的理化性能和生物相容性等方面分别做了进一步的探索和分析。在前期的冷冻干燥制备支架的相关研究中^[1，3]，通过调节丝素蛋白和胶原蛋白比例获得理想的细胞载体已获得了初步较好的效果。研究在进一步预实验的基础上，增加了4∶4融合比例，进一步对比分析。研究中4∶2复合支架组在制备溶液过程中，浓度比例适宜，未对打印喷头造成干扰，没有堵塞打印喷头，打印出的孔径、孔隙率、吸水膨胀率最大，有利于营养物质渗入、吸收培养液、早期黏附细胞，利于细胞良好生长；4∶4复合支架组细胞生长欠佳的主要原因是在制备和探索融合比例中过程中，基质浓度较大，堵塞了喷头，造成打印中断；甚至由于融合欠佳，堵塞了部分打印筒，导致打印出的三维材料结构差^[15-18]。研究应力-应变曲线显示两组支架均具有良好的黏弹性，符合关节软骨弹性模量值(4-35 kPa)^[1，3，19]。MTT检测显示，4∶2复合支架组支架更有利于细胞的早期黏附和增殖；4∶2复合支架组细胞的增殖明显比4∶4复合支架组活跃，这主要是由于4∶2复合支架组支架良好的理化性质决定的；同时苏木精-伊红染色结果表明，4∶2复合支架组支架内部结构更有利于细胞长入支架内部，支架内部可观察到细胞数量明显多于4∶4复合支架组，扫描电镜发现4∶2复合支架组支架孔径大小较为一致，各孔隙间相通性好，细胞铺满孔径和孔隙间，而4∶4复合支架组内仍遗留的大量了孔隙和孔径，细胞之间连接少，表明只有比例适当，打印出的支架材料才能更好地促进细胞的生长。

综上所述，研究通过采用3D打印技术，充分利用3D打印技术的技术和平台优势，以丝素、胶原两种材料为打印基质，探索适宜的融合比例，探讨3D打印软骨组织工程支架的可行性，表明以丝素蛋白与胶原蛋白质量比为4∶2时，支架的的理化性能和生物相容性性能最佳，为进一步的在体实验提供了更加可靠的数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D打印丝素蛋白/胶原蛋白支架的制备及性能

Three-dimensional printed silk fibroin/collagen scaffold and its performance

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