胶原蛋白-明胶复合支架材料修复周围神经缺损

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摘要：

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文题释义：
周围神经损伤：从大的角度来说可分为无缺损和有缺损两类，对于无缺损来说能直接断端缝合，如外膜法、束膜法。而对于有缺损周围神经损伤而言处理相对比较复杂，对于小段缺损(2-4 cm)可通过延长损伤神经方法进行修复，而对于大段缺损则主要采用神经移位、自体移植、异体移植等为主。
胶原蛋白-明胶复合支架：文献报道显示，将胶原蛋白-明胶复合支架运用于周围神经损伤修复中效果理想，但该结论尚未得到进一步证实。研究中，采用冷冻干燥法制备胶原蛋白-明胶复合支架材料，制备的材料为圆柱状。在扫描电镜下显示其内部为轴向平行排列，孔径为20-80 μm，与周围神经结构类似。

背景：文献报道显示，胶原蛋白-明胶复合支架可促进周围神经缺损的早期恢复，但该结论尚未得到进一步证实。
目的：观察胶原蛋白-明胶复合支架的细胞相容性及修复周围神经缺损的效果。
方法：将胶原蛋白-明胶复合支架与SD大鼠骨髓间充质干细胞共培养5 d，观察两者复合形态。切除20只SD大鼠左侧30 mm的腓总神经，建立周围神经缺损模型。随机分组，实验组神经缺损处植入复合骨髓间充质干细胞的胶原蛋白-明胶复合支架，对照组植入自体神经，植入后16周，进行桥接体中段形态观察与电生理检测。
结果与结论：①细胞与支架复合形态：骨髓间充质干细胞在支架上生长良好，与支架融合良好；②桥接体中段形态观察：两组有髓神经纤维密度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组有髓神经纤维直径、髓鞘厚度及神经组织百分比显著低于对照组(P < 0.05)；③电生理检测：两组运动神经传导速度、运动神经潜伏期、感觉神经传导速度、感觉神经波幅比较差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组运动神经波幅、感觉神经潜伏期显著低于对照组(P < 0.05)；④结果表明：胶原蛋白-明胶复合支架具有良好的细胞相容性，可用于修复周围为神经缺损。

ORCID: 0000-0001-8859-9596(刘天丹)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 胶原蛋白, 明胶, 周围神经缺损, 冷冻干燥技术, 骨髓间充质干细胞, 感觉神经, 运动神经

Abstract:

BACKGROUND: Collagen-gelatin composite scaffolds have been reported to be able to promote the early recovery of peripheral nerve defects. However, this conclusion has not been further confirmed.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of the collagen-gelatin scaffold and its treatment outcomes in the repair of peripheral nerve defects.
METHODS: The collagen-gelatin scaffold was co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) of Sprague-Dawley rats for 5 days, and then the cell growth was observed. Twenty Sprague-Dawley rats were enrolled, modeled into a left 30-mm peroneal nerve defect and randomized into experimental and control groups. The collagen-gelatin scaffold composited with BMSCs was implanted into the experimental group, and autograft
nerve implanted into the control group. Morphology of the middle bridge was observed, and electrophysiology was conducted at 16 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs grew and adhered well onto the scaffold. The myelinated nerve fiber density did not significantly differ between groups (P > 0.05). The myelinated nerve fiber diameter, myelin sheath thickness and percentage of nerve tissues in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). There were no significant differences in the conduction velocity, latency of motor nerves and the conduction velocity and amplitude of sensory nerves between groups (P > 0.05). The amplitude of motor nerves and the latency of sensory nerves in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). To conclude, the collagen-gelatin scaffold holds a good cytocompatibity and is ideal for the repair of peripheral nerve defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen, Gelatin, Peripheral Nerves, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘天丹，张保朝，郝明亮. 胶原蛋白-明胶复合支架材料修复周围神经缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 286-290.

Liu Tian-dan, Zhang Bao-chao, Hao Ming-liang.

Collagen-gelatin scaffolds for the repair of peripheral nerve defects

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 286-290.

图/表（结果） 6

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引言

周围神经损伤是日常生活中发生较高的创伤性疾病，且随着经济的不断发展，使得工伤、交通事故引起的周围神经损伤发生率呈现上升趋势。从人体解剖学角度来说，由于周围神经结构、功能的特殊性，多数患者损伤后无法在直视下完成神经的对拉吻合，并且损伤的远端神经纤维容易引起瓦勒变性，导致肢体感觉缺失、活动障碍及功能丧失，而神经断裂、神经缺损又是最为严重的损伤类型。目前，临床上对于周围神经缺损尚缺乏理想的修复方法，自体神经移植是周围神经缺损的“金标准”，该方法在临床上取得了理想的治疗效果。但由于修复治疗时存在造成供区受损、来源有限、供受神经不匹配等问题，使其难以在临床上应用^[1-2]。而同种异体神经移植修复时则需要使用免疫抑制剂，并且移植成功率相对较低^[3-4]。

随着医疗技术的不断发展，以天然细胞外基质为原料制备神经修复支架成为研究的新方向^[5-6]。由于周围神经损伤后，远端神经发生瓦勒变性，近端轴突发出的轴芽在间充质干细胞间隙向前滑行，长到远端Bungner带中，并向靶器官生长形成突触接触，引起许旺细胞增殖，使得轴突髓鞘化，完成神经再生过程^[7]。目前，构建支架的材料类型相对较多，如：聚合物、聚乙烯醇、脱乙酰壳多糖等。文献报道显示，胶原蛋白-明胶支架材料属于是一种天然高聚合材料，具有良好生物相容性，能根据周围神经缺损的范围随意塑性^[8]，但该结论尚未得到进一步证实，并且对于胶原蛋白-明胶支架的制备方法也缺乏统一的标准，更多的学者致力于设计和制备大孔的、生物可降解的、适合神经组织工程的多聚物支架材料^[9]。

实验探讨胶原蛋白-明胶复合支架材料制备方法及其在周围神经缺损中的应用效果。

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材料方法

1.1 设计细胞观察实验，动物体内观察实验。

1.2 时间及地点实验于2013年12月至2015年12月郑州大学第一附属医动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：6-8周龄SD大鼠22只，体质量200-250 g，雌雄随机，由郑州大学第一附属医动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为许可证号:合格证号为SCXK(豫)2007-0010，两组SD大鼠均行等条件喂养，且动物处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》规则^[10]。其中2只用于制备骨髓间充质干细胞；另20只采用随机对照方法分为对照组和实验组，每组10只。

主要仪器和试剂：Ⅰ型胶原蛋白、明胶(美国Sigma-aldrich 公司)；透射电镜(日本JEM-2000EX 型)；Keypoint 4C 型肌电图仪(丹麦Dantec公司)；XL-30ESEM扫描电镜(荷兰PHILIPS公司)；戊巴比妥钠(上海化学试剂公司)；常规手术器械(上海医疗器械厂)；专业动物实验台(中科院上海细胞所)。

1.4 实验方法

1.4.1 胶原蛋白-明胶复合支架的制备称取150 mgⅠ型胶原蛋白及75 mg明胶，将其溶于醋酸中，4 ℃下 18 000 r/min离心90 min，负压抽真空后4 ℃冰箱下过夜，制作成凝胶状悬浊液，将悬浊液注入内径为3 mm、长 10 cm的硅胶管中，顺轴采用微型调速仪以2×10^-5 m/s速度浸入冷凝剂中，放置在-40 ℃调节下冻干48 h，获得胶原蛋白-明胶复合支架材料，密封、消毒后备用^[1¹^-1²^]。将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40 ℃条件中冻干48 h，即可制得干燥成形的胶原蛋白-明胶复合支架材料。材料用戊二醛交联，⁶⁰Co消毒密封备用。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离与培养采用断颈方法处死SD大鼠，充分暴露骨髓腔，采用PBS冲洗二三次后，加入0.84%NH₄Cl溶液离心10 min，去除上层清液，加入DMEM培养液制作成单细胞悬液，将其接种在培养箱中，每周换液3次，待细胞融合85%时进行传代培养^[13-14]。利用传代方法收集细胞，加入0.25%胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，加入500 μL磁珠分选洗涤，2 000 r/min离心 10 min，每10⁷个细胞中加入100 μL Buffer悬浮细胞，加入鼠FcR阻断剂，4 ℃下混合均匀反应10 min，加入磁珠抗体，4 ℃下混合15 min，加入适当流式分选Buffer悬浮混匀后，流式细胞仪完成干细胞的鉴定。

1.4.3 骨髓间充质干细胞与支架复合将第5代骨髓间充质干细胞胰酶消化后，制作成单细胞悬液，以1×10⁹ L^-1的浓度注入胶原蛋白-明胶复合支架内，培养5 d，隔天换液^[15]。观察骨髓间充质干细胞与胶原蛋白-明胶复合支架的复合形态。

1.4.4 SD大鼠周围神经缺损模型的制作及分组处理入选SD大鼠均禁食12 h，术前肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，在SD大鼠左膝外侧皮肤纵行切口10 cm处，距离外侧踝1 cm处切开髂胫束，充分暴露腓总神经，切取长为30 mm的神经，神经断端回缩后形成1 cm的周围神经缺损，采用7-0显微缝线缝合导管与远近神经缺损端，建立SD大鼠周围神经缺损模型(图1)^[16]。对照组以自体移植神经方法进行修复，实验组采用复合骨髓间充质干细胞的胶原蛋白-明胶复合支架进行修复，两组创面缝合后采用油纱、无菌纱布双层敷料覆盖创面、包扎，根据SD大鼠情况给予抗生素预防感染，待SD大鼠清醒后，送回笼中饲养^[17-18]。

1.5 主要观察指标观察胶原蛋白-明胶复合支架材料构建及扫描电镜下外观形态；观察骨髓间充质干细胞的分离、培养及形态；观察骨髓间充质干细胞与胶原蛋白-明胶复合支架的复合形态；观察两组SD大鼠术后状态；观察两组神经植入后16周桥接体中段形态(在扫描电镜下完成相应的测量)；观察两组神经植入后16周电生理检测结果^[19]。

1.6 统计学分析采集数据采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学处理，计量资料行t 检验，采用x(_)±s表示，P < 0.05提示差异有显著性意义。

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讨论

周围神经损伤从大的角度来说可分为无缺损和有缺损两类，对于无缺损来说能直接断端缝合，如外膜法、束膜法^[20]。而对于有缺损周围神经损伤而言处理相对比较复杂，对于小段缺损(2-4 cm)可通过延长损伤神经方法进行修复，而对于大段缺损则主要采用神经移位、自体移植、异体移植等为主^[21]。自体移植虽然能取得理想的修复效果，但需要从机体上截取功能次要的神经，容易导致机体对供区功能产生障碍，并且自体移植神经数量相对有限^[22-23]。而同种异体神经移植则存在较高的免疫排斥风险。组织工程是近年来发展起来的一门技术，组织工程人工神经应该具备以下特点：具备特定的三维支架结构、具有合适的种子细胞等^[24-25]。

随着组织工程技术的不断发展，构建种子细胞和具备良好生物相容性的支架材料复合体-人工神经修复周围神经缺损成为研究的重点。人工神经研究的关键在于选择合适的支架材料，更好的复合种子细胞、神经营养因子，更好地促进神经再生。文献报道显示，将胶原蛋白-明胶复合支架运用于周围神经损伤修复中效果理想，但该结论尚未得到进一步证实。

研究中，采用冷冻干燥法制备胶原蛋白-明胶复合支架材料，制备的材料为圆柱状。在扫描电镜下显示其内部为轴向平行排列，孔径为20-80 μm，与周围神经结构类似^[26]。胶原蛋白属于细胞外基质的重要组成部分，不仅可识别细胞，对细胞也具备趋化性作用^[27]。同时，胶原还是天然聚合物之一，在机体内主要以胶原纤维的形式存在^[28]。原胶原分子时胶原蛋白的基本组成单位，胶原纤维能与细胞基质外的其他成分结构相互复合，属于能引导组织再生的生物支架材料。胶原具有良好的生物相容性，能进一步促进细胞黏附、增殖，促进创面的愈合，并且胶原还能参与组织的愈合，在周围神经损伤中能促进神经导管，改善周围神经的再生。研究中，两组大鼠伤口均Ι期愈合，置入后2周未见明显的全身炎症反应。明胶也是临床上使用较多的生物材料，该材料是相对于胶原蛋白更容易从溶液中提取，价格更加廉价。与胶原蛋白结构相比，明胶也是一种具有良好生物相容性、可塑性及生物黏附性较好的生物材料，该类材料的机械性能、化学性能均能够通过适度的交联得到进一步的改善，将其运用于周围神经缺损中能促进机体神经的恢复，提高修复效果。研究中，两组有髓神经纤维密度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组有髓神经纤维直径、髓鞘厚度及神经组织百分比显著低于对照组(P < 0.05)。由此看出，胶原蛋白-明胶复合支架能促进周围神经缺损部位修复，降低髓神经纤维、髓鞘厚度，促进缺损部位的功能恢复。

以Ⅰ型胶原和明胶作为原材料，通过冷冻干燥技术能够制备胶原蛋白-明胶复合支架。研究中，骨髓间充质干细胞注入胶原蛋白-明胶复合支架培养5 d后，细胞在支架上生长良好，细胞与支架融合良好。胶原蛋白-明胶复合支架外表为致密结构，能阻断机体内的纤维结缔组织长入，其结构上属于高度仿生天然神经，不仅对细胞具有趋化作用，还能促进细胞黏附、增殖、不会产生免疫原性，且胶原蛋白-明胶复合支架材料具备良好的生物相容性，将其运用与周围神经缺损中能改善周围神经再生，具有良好的运用前景。研究中，两组大鼠运动神经传导速度、潜伏期及感觉神经传导速度、波幅比较差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组运动神经波幅、感觉神经潜伏期显著低于对照组(P < 0.05)。

综上所述，胶原蛋白-明胶支架材料修复周围神经损伤修复中效果理想，具有较高的安全性，具有较高的临床应用价值。

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