微环境中间充质干细胞对多孔磷酸钙人工骨的诱导性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (25): 3665-3672.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.003

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微环境中间充质干细胞对多孔磷酸钙人工骨的诱导性

毛雪清^1，2，厉孟²，李少峰²，刘兴炎²

¹解放军第四军医大学西京骨科医院全军骨科研究所，陕西省西安市 710032；²解放军兰州军区总医院骨科中心，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2016-04-09 出版日期:2016-06-17 发布日期:2016-06-17
通讯作者: 刘兴炎，教授，主任医师，博士生导师，解放军兰州军区总医院全军骨科中心，甘肃省兰州市 730050
作者简介:毛雪清，男，1985年生，甘肃省庆阳市人，汉族，解放军第四军医大学在读硕士，主要从事创伤骨科，骨组织工程材料研究。
基金资助:
军队医院临床高新技术重大专项(2010gxjs013)；全军十二五医药卫生科研基金面上项目(CLZ13J003)；甘肃省自然科学基金面上项目(1208RJZA115)；兰州军区十二五医药卫生科研基金面上项目(CLZ12JB12)

Porous calcium phosphate cement induces osteogenesis of mesenchymal stem cells under microenvironment

Mao Xue-qing^{1, 2}, Li Meng², Li Shao-feng², Liu Xing-yan²

¹General Military Orthopedic Institute, Xijing Hospital of the Fourth Military University of Chinese PLA, Xi’an 710032, Shannxi Province, China; ²Department of Orthopedics Center, General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2016-04-09 Online:2016-06-17 Published:2016-06-17
Contact: Liu Xing-yan, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics Center, General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Mao Xue-qing, Studying for master’s degree, General Military Orthopedic Institute, Xijing Hospital of the Fourth Military University of Chinese PLA, Xi’an 710032, Shannxi Province, China; Department of Orthopedics Center, General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the Clinical High-Tech Major Project of Military Hospitals, No. 2010gxjs013; the 12^th Five-Year Medical and Health Research Foundation of the PLA, No. CLZ13J003; the Natural Science Foundation of Gansu, No.1208RJZA115; the 12^th Five-Year Medical and Health Research Foundation of the Lanzhou Military Region, No. CLZ12JB12

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
多孔磷酸钙人工骨：为双相磷酸钙生物材料，最佳相比即羟基磷灰石/β-磷酸三钙比为60/40，羟基磷灰石在体内稳定性较高，β-磷酸三钙在体内吸收较快，因此通过将两者复合共用，利用两者在体内的不同的降解吸收速率，可达到改善材料的诱导活性的目的，多孔磷酸钙人工骨诱导成骨作用受材料孔隙结构影响，理想的孔径为200-400 μm。
骨诱导性：是材料直接诱导间充质细胞分化为骨原细胞、成骨细胞，进而形成骨组织的性能。具有骨诱导性的材料即使在非骨环境中也具有激发骨生成的能力，通常通过异位植入，即非骨环境植入是否能成骨来判断一种材料是否具有骨诱导性。

摘要
背景：生物材料的骨诱导现象已在多种动物实验中被证实。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对多孔磷酸钙人工骨的骨诱导作用。
方法：体外分离培养1周龄兔骨髓间充质干细胞，分别以PKH-67或PKH-26荧光标记。将48只成年新西兰大白兔随机分为4组，均在两侧臀大肌内置入多孔磷酸钙人工骨，A组在每侧臀大肌靠近股骨侧臀上动脉分支顺行注入1 mL PKH-26标记的骨髓间充质干细胞，在每侧材料周围注入1 mL PKH-67标记的骨髓间充质干细胞；B组在每侧臀上动脉分支注入1 mL PKH-26标记的骨髓间充质干细胞；C组在每侧材料周围注入1 mL PKH-67标记的骨髓间充质干细胞；D组在每侧材料周围注射同体积生理盐水。置入后3，7，12周取材料及其周围组织，行荧光显微镜观察、骨形态发生蛋白2基因量检测和Masson组织学染色。
结果与结论：①荧光显微镜观察：PKH-26标记的骨髓间充质干细胞趋化速度快，荧光分布均匀；PKH-67标记的骨髓间充质干细胞趋化速度慢，荧光逐步分布均匀；②Masson组织学染色观察：4组出现新生类骨质并逐步增多，A组、B组、C组不同时间点的新生类骨质面积大于D组；③骨形态发生蛋白2基因量检测：A组、B组、C组不同时间点的基因量多于D组(P < 0.05)，A组、不同时间点的基因量多于B组、C组(P < 0.05)；④结果表明：多孔磷酸钙人工骨可诱导微环境中骨髓间充质干细胞向材料趋化并增殖分化为成骨细胞，进而形成新生骨；周围毛细血管及体液中的间充质干细胞均是成骨源细胞来源，但毛细血管来源间充质干细胞在其中起主要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0001-5262-5166(刘兴炎)

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 多孔磷酸钙人工骨, 荧光染色, 骨髓间充质干细胞, 兔, 甘肃省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The osteoinduction by biomaterials has been proven in various animal experiments.

OBJECTIVE: To investigate the osteoinduction of porous calcium phosphate cement on bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from rabbits aged 1 week in vitro and labeled by PKH-67 or PKH-26, respectively. Forty-eight adult New Zealand white rabbits were randomized into four groups and porous calcium phosphate cement was implanted into both sides of gluteus maximus in each rabbit. Then, 1 mL PKH-26-labeled bone barrow mesenchymal stem cells (1×10¹⁰/L) were injected into the superior gluteal artery branch at each side of gluteus maximus near the femur, and 1 mL PKH-67-labeled bone barrow mesenchymal stem cells (1×10¹⁰/L) injected into tissues around the cement (group A); 1 mL PKH-26-labeled bone barrow mesenchymal stem cells (1×10¹⁰/L) were injected into the each side of superior gluteal artery branch (group B); 1 mL PKH-67-labeled bone barrow mesenchymal stem cells (1×10¹⁰/L) were injected into tissues around the cement (group C); the same amount of normal saline was injected into tissues around the cement (group D). At 3, 7 and 12 weeks after implantation, the cement and its surrounding tissues were extracted and detected by fluorescence microscope and Massion staining. Expression of bone morphogenetic protein 2 was analyzed by RT-PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: Under fluorescence microscope, PKH-26-labeled bone barrow mesenchymal stem cells attached fast and distributed homogeneously; however, PKH-67-labeled bone barrow mesenchymal stem cells attached slowly and exhibited a gradually homogeneous distribution. Massion staining showed that ectopic new bone formation appeared to have an upward trend in all groups, and the area of new bones in groups A, B and C were larger than that of group D at different time points after implantation. There was a significantly higher expression of bone morphogenetic protein 2 in groups A, B and C compared with the group D at different time points after implantation (P < 0.05), and the expression was the highest in the group A (P < 0.05). In conclusion, the porous calcium phosphate cement can induce bone barrow mesenchymal stem cells chemotaxis and osteogenetic differentiation. Besides, osteoblasts are differentiated from both the surrounding capillaries and body fluid, and capillary-derived mesenchymal stem cells occupy the important position.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

毛雪清，厉孟，李少峰，刘兴炎. 微环境中间充质干细胞对多孔磷酸钙人工骨的诱导性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(25): 3665-3672.

Mao Xue-qing, Li Meng, Li Shao-feng, Liu Xing-yan. Porous calcium phosphate cement induces osteogenesis of mesenchymal stem cells under microenvironment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(25): 3665-3672.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞分离培养及体外标记传至3代骨髓间充质干细胞培养3 d，倒置相差显微镜下观察细胞呈贴壁梭形生长，CD90阳性表达，阳性率为96.37%，CD45阴性表达；PKH-26及PKH-67荧光染料标记后荧光显微镜观察^[15]，在551 nm及490 nm激发光作用下，标记骨髓间充质干细胞(箭头表示)刚接种时呈球形，细胞膜完整，分别发出红光及绿色荧光，荧光在细胞表面均匀分布；培养24 h后观察，标记细胞贴壁伸展，轮廓清晰可见，呈梭形，见图1。

流式细胞仪检测细胞PKH-26及PKH-67染色阳性率分别为93.65%及91.37%，见图2。

2.2 标记细胞体内示踪观察结果荧光显微镜观察结果见图3。

A组：在551 nm和490 nm激发光作用下，置入后3周，材料区分别可见发出红色及绿色明亮荧光的标记细胞(箭头表示)，红色荧光细胞分布较均匀，绿色荧光细胞材料边缘分布密度大；置入后7周，材料中红色荧光细胞范围变化不大，绿色荧光细胞分布均匀，荧光强度略有减弱；置入后12周，材料中红色和绿色荧光细胞分布已趋均匀，绿色荧光细胞数量少，较红色差异显著，总体数量较7周时少，荧光强度也较弱。

B组：置入后3，7，12周，551 nm激发光作用下材料区红色荧光标记细胞亮度变化不大，分布趋于均匀。

C组：490 nm激发光作用下材料区绿色荧光标记细胞亮度逐渐减弱，置入后3周荧光标记细胞分散于材料内部周边，置入后7周荧光标记细胞已分布均匀。

D组：各时间节点无荧光显示，

2.3 RT-PCR检测结果与D组相比，A组、B组、C组骨形态发生蛋白2基因表达量3周时分别增加了4.2倍(P < 0.05)、3.4倍(P < 0.05)和2.1倍(P < 0.05)；7周时分别增加了3.7倍(P < 0.05)、3.0倍(P < 0.05)和1.9倍 (P < 0.05)；12周时分别增加了3.3倍(P < 0.05)、2.5倍(P < 0.05)和1.7倍(P < 0.05)，同时期A组骨形态发生蛋白2基因表达量也显著高于B组(P < 0.05)，见图4。

2.4 各组MASSON染色观察结果置入后3周，各组未发现新生骨；置入后7周，镜下发现有众多克隆单核细胞散在分布区域，这些区域在Masson中染成蓝色，说明有新生类骨质存在；置入后12周，各组新生类骨质面积扩大，见图5(以A组与D组为例)。A组、B组、C组不同时间点的新生骨面积大于D组。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组动物观察性实验。

1.2 时间及地点于2014年9月至2015年7月在解放军兰州军区总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级1周龄新西兰兔2只，雌雄不拘，体质量约50 g；成年新西兰兔48只，雌雄不拘，体质量1.5-2.0 kg，由兰州生物制品研究所提供，许可证号：(甘) SYXK 2013-002。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

多孔磷酸钙人工骨：原料购买于四川大学国家生物材料研究中心。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养乳兔颈椎脱臼处死，无菌条件下取出兔双肱骨、胫骨及股骨，移入超净工作台，剪开骨干，5 mL注射器吸取培养基将髓腔内容物反复冲出并移入离心管，1 000 r/min离心5 min。倒掉上清，用含体积分数10%胎牛血清的LDMEM重悬细胞，吹打混匀计数，以细胞浓度1×10⁵ L^-1植入25 cm²培养瓶。运用贴壁细胞分离法培养^[10-14]，24-48 h后首次换液，以后每隔48 h换液，细胞融合至80%-90%后用0.25%胰酶消化(约3 min)传代，按1∶2下传，第3代实验备用。选取1皿第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，每个待测管加入200 μL细胞悬液，在避光条件下分别向各待测管中加入CD45(PE标记1∶50)、CD90 (FITC标记 1∶50)，室温孵育 20 min后，PBS清洗3次，行流式细胞仪检测。

1.4.2 PKH-26与PKH-67荧光标记骨髓间充质干细胞取生长状态良好的3代骨髓间充质干细胞，0.25%浓度胰蛋白酶消化培养皿中的贴壁细胞，制成单细胞悬液。取1×10⁷个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，无血清L-DMEM培养基洗涤细胞1次，加0.5 mL稀释剂C对细胞进行重悬，制备成浓度为2×10¹⁰ L^-1的细胞悬液，加入装4×10^-6 mol/L PKH-26染料的PC离心管中，染液 0.5 mL，共1 mL，加入后迅速混合均匀，使其充分染色。离心管无菌条件下轻摇5 min后,加1 mL FBS终止染色，再静止1 min。加2 mL完全L-DMEM培养基对样品进行稀释，共4 mL液体离心10 min；弃上清，转移离心管细胞至另一无菌空离心管，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基对细胞进行3次洗涤；后重悬细胞，使其细胞浓度为1×10⁸ L^-1，分别接种于培养皿、放置盖玻片的培养板内，荧光显微镜下观察刚标记的细胞悬液和 24 h后细胞的荧光标记效果；细胞标记后即刻PBS洗涤1次，流式细胞仪检测细胞标记率。PKH-67染料标记及标记率检测方法同上。

1.4.3 动物体内实验将48只新西兰大白兔随机分为4组，每组12只，耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉。兔两侧臀部被毛、常规消毒铺洞巾，暴露皮肤，分离皮下组织，分别切开臀大肌，内部置入规格为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的多孔磷酸钙生物材料，A组在每侧臀大肌靠近股骨侧臀上动脉分支顺行注入1 mL PKH-26标记的骨髓间充质干细胞(1×10¹⁰ L^-1)，在每侧材料周围(距骨材料边缘5 mm，分4个点位)注入1 mL PKH-67标记的骨髓间充质干细胞(1×10¹⁰ L^-1)；B组在每侧臀上动脉分支注入1 mL PKH-26标记的骨髓间充质干细胞(1×10¹⁰ L^-1)；C组在每侧材料周围(距骨材料边缘5 mm，分4个点位)注入1 mL PKH-67标记的骨髓间充质干细胞(1×10¹⁰ L^-1)；D组在每侧材料周围注射同体积生理盐水。实验操作后，记录顺序并予标记。分层缝合皮下组织，碘伏消毒。置入后实验动物肌注青霉素160×10⁴ U预防感染。术后实验兔由兰州总医院动物科饲养。术后饲养笼内垫料保持干燥，给予充足水食，术后观察。在置入后3，7，12周，随机每组选择3只兔，空气栓塞法处死，分批取含材料周围1 cm组织的标本。

1.5 主要观察指标

不脱钙塑料包埋及标记细胞体内示踪观察：用体积分数95%乙醇保存标本。Technovit9100树脂包埋试剂盒按步骤、分时间段对组织进行包埋，LEICA-SP1600硬组织切片机切片，调整切片厚度为25 µm，切片后胶水封固，1 200-2 000目砂纸反复打磨，然后在荧光显微镜下观察荧光现象。

骨形态发生蛋白2基因表达量测定：将剔除软组织的新鲜标本于液氮中冷冻，RT-PCR分析骨形态发生蛋白2基因表达量。Trizol一步法提取材料总RNA，可同时分离材料中DNA、RNA和蛋白质，RNA的完整性运用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测。总RNA反转录为cDNA，其中反转录PCR扩增体系及反应条件均参照说明书设定。经等比稀释后对PCR反应制备标准曲线，经内参校正，每组分别求得目的基因的相对表达量。RT-PCR数据分析采用??Ct法，数据的结果采用2^-^??Ct表示，所用引物由日本的TakaPa公司根据Genbank所发布的序列设计并合成。

组织学分析：取含材料周围1 cm组织标本，置于 40 g/L多聚甲醛固定液，脱钙后石蜡包埋，切片进行Masson染色，光学显微镜镜下观察。

1.6 统计学分析采用统计软件SPSS 19.0进行单因素方差分析(ANOVA)，数据以x(_)±s表示，组间两两比较用LSD检验法。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

实验发现标记后的骨髓间充质干细胞，可通过材料周围毛细血管和体液局部两个途径进入人工骨内部，术后取材进行Masson染色发现多孔磷酸钙人工骨表现出优异的异位骨诱导。异位骨修复节段性骨缺陷作为一种新疗法已受到极大关注，但异位骨形成的机制还没有确切发现^[16]，特别是干细胞的来源和骨材料诱导性问题。有人推测，在体内生物材料可能吸附从体液微环境内生的生长因子，从而有助于招募相关多能干细胞归巢，以形成新骨^[17]。Zhang等^[18]报道多孔磷酸钙人工骨的表面孔径，是重要的成骨因素之一，可诱导间充质干细胞的成骨分化，最终使之异位成骨。实验结果表明，将多孔磷酸钙人工骨置入非骨部位，其干细胞来源通道为材料周围毛细血管和局部体液，以血管来源途径为主。实验也证实了多孔磷酸钙人工骨具有自体骨诱导性，与文献报道一致^[19]。

骨髓间充质干细胞来源于发育期中胚层，存在于骨髓组织中，是一种多分化潜能的祖细胞，是骨组织工程种子细胞来源之一^[20-24]。目前，细胞标记的方法有荧光标记技术如PKH-26及PKH-67细胞膜标记^[25]、DAPI标记、绿色荧光蛋白标记法^[26]、BrdU标记以及Y染色体标记^[27]。BrdU标记细胞后无法直接观察染色效果，需要通过免疫组织化学才能鉴定染色细胞，过程复杂^[28]。此外，BrdU和DAPI均为细胞核标记试剂，且随着细胞的增殖、分裂，实验细胞标记的强度逐渐减弱。绿色荧光蛋白标记法要求高，染色成本高，多使用于少样本染色。PKH-26和PKH-67染料通过脂肪链与细胞膜不可逆结合，在细胞分裂时它几乎等分分布于子代细胞中^[29-30]。实验选择PKH-26和PKH-67染料标记骨髓间充质干细胞，可实时观察标记细胞趋化情况^[31]，短期体内荧光不减弱，不丢失，可作为短期细胞体内示踪剂^[32]。实验发现，相比较PKH-67染料，PKH-26染色剂12周仍有荧光显示，半衰期长，荧光更稳定。

此次实验中，术后观察4组荧光标记骨髓间充质干细胞，红色荧光3周内在材料中分布均匀，之后稳定亮度表达，绿色荧光3周时荧光分布不均，材料内部分布少，说明B组在3周内骨髓间充质干细胞趋化人工骨速度比局部注射组快；7周两组均匀分布于材料内部，绿色荧光亮度及数量都不及红色荧光表达，说明B组数量上较C组多，在趋化过程中损耗较少，利用率更高，也有可能是PKH-67染料半衰期较短(12 d)，绿色荧光消失所致^[33]。实验发现，多孔磷酸钙人工骨异位成骨过程中诱导骨髓间充质干细胞从邻近毛细血管和材料局部趋化于材料内部并逐步分化成骨，周围毛细血管来源的骨髓间充质干细胞在速度和利用率上高于材料局部体液的来源途径。

骨形态发生蛋白2能使骨骼外组织中的间充质干细胞经过迁移、有丝分裂，分化成为骨母细胞和骨细胞^[34]。其中骨形态发生蛋白2参与了新生骨形成的整个过程，随着新生骨量增加，骨形态发生蛋白2蛋白量也随之增加^[35-37]。实验发现A、B、C三个实验组和对照组在不同时间段骨形态发生蛋白2基因表达量都有统计学意义(P < 0.05)，A组、B组与C组之间在不同时间段差异也有统计学意义(P < 0.05)，证明实验组效果优于对照组，实验组中血管与局部联合组及血管组优于单一局部组，说明材料异位成骨形成过程中，周围毛细血管及体液中的骨髓间充质干细胞均为成骨源细胞来源，但实验中毛细血管来源的骨髓间充质干细胞和局部来源相比有显著差异，周围毛细血管中的骨髓间充质干细胞在人工骨异位成骨中起决定性作用。实验还发现多孔磷酸钙人工骨如对照组虽然可以自体诱导异位成骨，但骨诱导时间较慢，新生骨量少，多孔磷酸钙人工骨叠加外源性骨髓间充质干细胞可显著增强骨诱导能力。

综上所述，作者此次实验证实多孔磷酸钙人工骨因其特殊孔径结构，诱导微环境中间充质干细胞向人工骨材料趋化并增殖分化为成骨细胞，进而形成新生骨，周围毛细血管及体液中的骨髓间充质干细胞均是成骨细胞来源，毛细血管来源的骨髓间充质干细胞起主要作用，此为下一步构建具有良好骨诱导性的生物人工骨提供了理论基础及发展方向。然而，多孔磷酸钙人工骨异位成骨是由多因素参与的复杂生物过程，多孔磷酸钙人工骨骨诱导机制还有待进一步研究和观察。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

微环境中间充质干细胞对多孔磷酸钙人工骨的诱导性

Porous calcium phosphate cement induces osteogenesis of mesenchymal stem cells under microenvironment

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