应用不同物理加强条件的Ⅰ型胶原支架的大白鼠动物模型与组织学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

交联加强反应：不经任何交联加强的胶原在体内极易被胶原酶降解吸收。对于自体胶原以外的胶原物质不经交联其在机体内的组织反应较强。为了提高其抗降解能力、减少异物/免疫反应，提高物质的某些理化性能，需采用物理或化学方法对其进行交联加强。去除或替代肽链结构中某些离子或基团，使肽链中蛋白分子间形成暂时或永久性的联结，使其胶原纤维中蛋白分子在体内抗胶原酶降解性能以及对α-平滑肌收缩蛋白的抗收缩能力得到改善与提高。

胶原：是哺乳动物体内含量最多的蛋白质(占体内蛋白质总量的25%-30%)，它是细胞外间质的主要成分，是形成细胞生长外环境的重要物质。而Ⅰ型胶原是体内诸多胶原种类中的一种，是绝大多数组织细胞生存所需要的物质，占体内胶原总量的90%，如皮肤，骨，肌腱，周围神经，脑膜，血管等。

背景：为改善胶原支架的降解性能，作者对胶原支架的高温脱水物理交联方法进行了改进，将交联时间由24 h增加到48 h，将交联温度由105 ℃提高到115 ℃。

目的：验证改进高温脱水物理交联方法制备胶原支架的抗降解能力，获取支架在体内对受损组织修复与再生的最佳功效。

方法：将高纯度保持三螺旋结构的动物源性Ⅰ型胶原制成膜状支架，分别采取3种不同条件的高温脱水进行交联加强(105 ℃/24 h、105 ℃/48 h、115 ℃/24 h)，将1 cm×1 cm的材料置入大白鼠背部皮下组织，在置入后第3，14，42天处死，取出标本进行组织学检查与分析。

结果与结论：实验表明，3组内置物在机体内均未发现严重的异物及特异性免疫机能性反应，采用105 ℃/ 48 h加强条件处理的胶原支架，置入后14 d在体内的存留及保持孔隙开放程度均较其他两组好(P < 0.05)，间接表明将交联加强时间从常规24 h延至48 h可以增强胶原支架在体内的抗降解性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-1551-8550(许和平)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 胶原, 支架, 高温脱水, 交联, 降解, 组织再生

Abstract:

BACKGROUND: In previous studies, the dehydrothermal cross-linking method was modified by the authors to improve the degradation property of collagen scaffolds. The cross-linking time was increased from 24 to 48 hours, and the cross-linking temperature increased from 105 to 115 ℃. OBJECTIVE: To verify the anti-degradation ability of collagen scaffolds prepared using the modified dehydrothermal cross-linking method and to obtain the optimal efficacy of the scaffolds on damaged tissue repair and regeneration.
METHODS: Highly-purified type I collagen scaffolds with native triple helix structure were prepared and subjected to three different dehydrothermal cross-linking conditions: 105 ℃ for 24 hours, 105 ℃ for 48 hours and 115 ℃ for 24 hours. Material samples, 1 cm×1 cm, were implanted subcutaneously into the rat dorsum. The specimens were harvested at 3 days, 14 days and 42 postoperative days followed by fixation and histological analysis using hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: No untoward foreign body and immunological reactions were observed in any groups. In the group of 105 ℃ for 48 hours, the scaffold retention and degree of pore openness were better than the other two groups at 14 days after scaffold implantation (P < 0.05). These findings indirectly suggest that the anti-degradation ability of collagen scaffolds can be strengthened under certain dehydrothermal cross-linking conditions: the cross-linking time is increased from 24 to 48 hours.

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图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 24只动物无感染、死亡发生，均进入结果分析。

2.2 大体观察所有动物皮肤与皮下组织中没有严重粘连、出血、组织变性、坏死及恶性增生等现象，见图1。

置入后3 d：经3种不同条件高温脱水交联加强的Ⅰ型胶原支架，100%存留于皮下组织且均有所改变，其中包括内置物的形态、大小及其周边的组织变化，胶原支架保持完好，界限清晰且被软组织完全包裹，其中105 ℃/24 h组胶原支架呈现收缩变形；105 ℃/48 h组和115 ℃/24 h组胶原支架显示少许收缩变形，支架周围有较为明显的炎性反应，可见周围毛细血管增生，局部组织略显增厚。

置入后14 d：胶原支架形态变化明显，均有不同程度降解，约80%的支架存于皮下组织，其边界较为模糊。所有残留胶原支架均有较大程度的形态改变，收缩明显，形态多呈圆形或椭圆形，其中105 ℃/24 h组胶原支架呈现收缩变形或被降解吸收；105 ℃/48 h组残留支架较多，保持良好且形态完整；115 ℃/24 h组胶原支架明显收缩变形，降解吸收显著，105 ℃/48 h组与115 ℃/24 h组胶原支架周围有较明显的毛细血管增生。

置入后42 d：胶原支架被完全降解吸收，没有发现存留于皮下组织或能被肉眼鉴别在软组织中存在的痕迹。3组胶原支架内置部位及周围无明显炎性反应，少许周围毛细血管增生，有些部位皮下组织有少许增厚。

2.3 显微镜组织学观察

置入后3 d：①105 ℃/24 h组：支架边缘清晰，周围有少许或中等程度组织反应，胶原孔隙边缘收缩较中心严重，支架边缘细胞浸润明显且多由两端向外周边浸润；10倍显微镜下观察显示，材料边缘有少许组织反应，细胞生长活跃，细胞由支架边缘向中间移行，支架中心有少许或多无移行细胞，支架边缘的孔隙因α-平滑肌收缩蛋白作用而收缩；20倍显微镜下观察显示，支架内部孔隙保持明显的开放状态，但边缘孔隙收缩明显，同时可见支架边缘新生血管的存在；高倍镜下观察细胞多由淋巴细胞及巨噬细胞浸润，见图2。②105 ℃/48 h组：低倍镜下观察可以发现支架边缘清晰，周围有少许或中等程度组织反应，支架边缘孔隙收缩程度较中心明显，但均呈开放状态。整体支架孔隙开放，特别是中心孔隙保持开放程度较105 ℃/24 h组更为明显，边缘细胞同样是由两端向外周中心浸润，支架的皮下组织反应相对于105 ℃/24 h组为多。显微镜下显示支架经延时交联

后，细胞组织学反应表现与105 ℃/24 h组近似。未分化的细胞及组织反应细胞从端侧向支架内部中间移行，镜下可见在支架中部孔隙内有移行停滞的细胞附着于胶原孔隙壁上；高倍镜下观察基底部位细胞反应较强，可见淋巴细胞和巨噬细胞及特有的未分化细胞，时伴有新生血管，见图3。③115 ℃/24 h组：低倍镜下观察残留支架边缘清晰，外周孔隙收缩显著，支架体积缩小，材料周围有较为明显的组织反应，支架孔隙边缘收缩较中心更为严重，细胞多由两端边缘向边周浸润明显，支架在皮下的组织反应较其他两组都严重，残留的支架中心可见少许细胞存在；10倍显微镜下观察显示支架边缘孔隙密集收缩，外周细胞浸润成组织炎性反应，新生外周炎性反应中伴有血管增生，同时活跃的细胞在胶原外周浸润形成致密的细胞层；40倍显微镜下观察胶原支架外周聚集较多的淋巴细胞和巨噬细胞，见图4。

综上所见，3组内置胶原支架以不同形态与大小100%存留于皮下组织。保持较低温度的交联加强时间有所不同，但在组织形态学方面显现无巨大差异，细胞组织反应较轻；而115 ℃/24 h组局部炎性反应较重。3组新生组织中伴有少许新生血管，支架均显示开放孔隙，其中115 ℃/24 h组支架整体收缩明显，孔隙收缩明显；而105 ℃/48 h组支架内部保持孔隙开放性较其他组更佳。3组支架中部均可见少许细胞移行浸润，以105 ℃/ 48 h组细胞附着最佳，115 ℃/24 h组支架基底部的细胞反应较严重，各组支架与皮肤无明显粘连和瘢痕形成。

置入后14 d：①105 ℃/24 h组：通常以大白鼠背部检测Ⅰ型胶原+氨基葡糖胶原支架的生物相容性试验，术后14 d观察其内置物均已降解吸收^[9-10]。但采用单一的Ⅰ型胶原为材料的支架，置入后14 d均有不同程度的残留。低倍显微镜下观察显示胶原支架均已呈现不同程度的降解吸收，大量细胞浸润并保持于支架孔隙或基质内；高倍显微镜下观察显示有序的纤维组织形成，成纤维细胞排列有序，其间仍有较多的淋巴细胞及巨噬细胞存在，同时伴有更多的未分化细胞浸润，组织中的新生血管形成，表明组织再生过程的进行；偏光显微镜透明光带进一步显示新生胶原组织的形成，见图5。②105 ℃/48 h组：4倍显微镜下观察发现，胶原支架保存完好，清晰可见；其边缘较105 ℃/24 h组更为清晰，且支架中心孔隙仍保持良好的开放状态。支架周围有中等程度组织反应，支架边缘细胞呈包裹性浸润，大量细胞在残留胶原支架中移行分化。20倍显微镜下观察胶原支架孔隙中有大量活跃细胞，但中心开放孔隙中细胞数量仍较边缘及近边缘支架中的细胞数量为少。40倍显微镜下观察显示在孔隙中的细胞多以淋巴细胞、未分化细胞为主。在新生血管周围新生的胶原组织开始形成并成束状排列，组成粗大胶原纤维。采用偏光显微镜观察视野内较多的透亮的胶原纤维组织呈现，胶原组织形成量较105 ℃/24 h组多，见图6。③115 ℃/24 h组：此组胶原支架在体内的生物学反应较其他两组明显，且胶原支架多数已降解吸收，在显微镜下观察支架的胶原纤维基本降解，支架收缩严重且趋于降解吸收，其现象间接表明提高温度的高温脱水交联加强中远期效果较差、降解快、抗收缩能力弱。显微镜下观察显示支架整体收缩严重，密度增大，开放孔隙基本闭缩，边缘有较多新生组织或类瘢痕形成，胶原支架的胶原纤维仅少量存在，大量细胞浸润；镜下可观察残留胶原支架，胶原纤维及丰富的细胞浸润，丰富的血管增生，横向和纵向交叉分布，见图7。

3组胶原支架在皮下组织中有较大的差异，支架仍存在于皮下组织中，但均发生支架收缩残留或被降解吸收，其中以115 ℃/24 h组最为显著。在可发现残留胶原支架的标本中，以105 ℃/48 h组支架存留率及中心孔隙开放率最为理想，支架内部仍明显保存开放孔隙结构，而且细胞在其内部生长活跃。对于其他两组支架的外周孔隙也基本闭合，支架周边纤维组织形成明显。在组织反应方面，3组支架外周细胞生长活跃，残留支架的孔隙内有较多细胞生存，支架外周已被新形成的组织替代，内有新生血管形成。115 ℃/24 h组中整体细胞组织反应较重，瘢痕组织在支架端侧明显且多伴有新生血管形成，细胞则多以淋巴细胞、未分化细胞为主，仍可见巨噬细胞，新生组织细胞以成纤维细胞为主，新纤维呈束伴有新生毛细血管。在115 ℃/24 h组和105 ℃/24 h组中支架整体形态多有消失，边缘及中心开放性孔隙基本消失明显。消失的支架多被大量的有活性的未分化细胞浸润，在新生组织外周出现有序的正常组织，成纤维细胞有序排列，再生的新胶原成束出现。偏光镜观察有胶原特有的断节影像出现，新生胶原组织形成(图4D)。

置入后42 d：3组胶原支架基本完全降解吸收，无残留，镜下显示局部呈现均匀的结缔组织，局部组织无明显过度增生现象，均可发现新生胶原组织，毛细血管增生，在其周围的新生胶原纤维肥大、成束。105 ℃/48 h组和115 ℃/24 h组组织中仍可见一定数量的淋巴细胞。显微镜偏光检查可以佐证新生组织是具有结构的胶原组织，再生的新胶原组织呈束状，见图8。

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引言

组织工程学与再生医学是21世纪高速发展的一种新型学科，其利用良好的生物材料、不同种类的细胞及组织生长因子，在机体器官或组织病变受损部位进行修复、再生，这种高科技理念、技术与方法可以应用于医学的各个领域，是21世纪医学科学的重大发展。

在组织工程与再生医学领域中，同时运用两至三种材料进行临床使用并取得药品检验机构的认可批准，到目前为止不多。组织工程学与再生医学3大因素中生物材料的选择与使用有着特殊的要求，单独运用适当的生物材料修复机体损伤组织也可以起到明显的效果。Ⅰ型胶原是人体内有着重要生理功能的细胞外间质，对组织器官的结构组成起着至关重要的作用。由牛跟腱中提取的高纯度保持三螺旋结构的Ⅰ型胶原是一种天然生物组织材料，有着良好的组织相容性，经加工制作的胶原支架，在神经外科、骨科中已被广泛使用。天然的未经交联加强的Ⅰ型胶原支架在体内极易被特异性胶原酶分解代谢，而不能很好地发挥细胞外间质的支架作用，使受损部位细胞和某些未分化前质细胞不能充分利用支架所提供的空间与时间得以移行、分化、再生与重塑，导致受损组织与器官得不到良好的修复与再生^[1]。

采用某些物理化学方法去除或替代肽链结构中某些离子或基团，在肽链中蛋白分子间形成永久或暂时性的交联，使其胶原纤维中蛋白分子在体内抗胶原酶降解性能及对α-平滑肌收缩蛋白的抗收缩能力得到改善与提高，延长支架在体内的存留和保持孔隙开放状态^[2]，从而使体内受损部位的健康组织细胞及未分化前质细胞有充足的时间在支架内修复再生，进而生成正常的组织细胞而再分泌自身细胞外间质，促进新生细胞的分化与生长，最终形成具有正常功能的组织与器官^[3-6]。

高温脱水交联加强是一种有效的物理加强方法，肽链中蛋白分子中水分子游离基(H⁺)的转换形成肽键间的交联结合，结果显示：经高温脱水处理后的胶原螺旋结构盘绕转变温度增强，在保持三螺旋结构的情况下提高了胶原的热稳定性，同时增强了胶原支架的抗降解能力^[7-8]。

Ⅰ型胶原产品的常规高温脱水加强条件通常为105 ℃/ 24 h。在以往的研究中，将Ⅰ型胶原加定量的硫酸软骨素制成胶原支架，经常规高温脱水交联加强后置入大白鼠皮下组织，支架降解时间为7-10 d^[9-10]。作者设计了采用单一成分的高纯度保持三螺旋结构的Ⅰ型胶原支架并对其进行延时(从24 h延长至48 h)和升温(从105 ℃提升为115 ℃)交联加强实验，以观察其在体内抗降解性能的变化。通过不同条件下交联加强的胶原支架动物皮下置入生物相容性实验，观察改变加强条件后支架在机体内的变化，以期达到提高支架在体内抗胶原酶降解及抗α-平滑肌收缩蛋白的能力，达到更加完善的组织再生及抗粘连效果。

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材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点于2011年10月17日至11月28日在北京大学医学部实验动物科学部进行。

1.3 材料实验采用由牛跟腱中提取的高纯度保持三螺旋结构的非溶性Ⅰ型胶原，经冷冻干燥技术制成材料浓度为0.5%、厚度5 mm、孔隙在100-250 µm的三维膜状胶原支架，材料制成后采用3种不同条件高温脱水方法对支架进行交联加强(105 ℃/24 h、105 ℃/48 h、115 ℃/24 h)，其后将交联后的支架制成10 mm×10 mm×5 mm的样品，应用环氧乙烷气体进行灭菌^[11]。

实验动物：健康成年雄性SD大鼠24只，体质量150-250 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供。将24只大鼠随机分为3组，分别为105 ℃/24 h组、105 ℃/48 h组、115 ℃/24 h组，每组8只。

1.4 实验方法取3组SD大鼠，以50 mg/kg异戊巴比妥钠行腹膜内麻醉，所有手术均在无菌外科技术下进行。以鼠背中线横切口上下5 cm的左上、左下、右上和右下，将4块10 mm×10 mm×5 mm的胶原支架样品分别置入，其后常规闭合伤口，每组对应置入交联加强条件的胶原支架样品。术后按实验动物管理条例进行饲养。

1.5 主要观察指标置入后3 d(n=3)、14 d(n=3)、42 d(n=2)处死动物，同时对手术内置部位的皮肤进行大体观察，并将包括4个标本在内的整个背部皮肤切除，将标本置于体积分数10%甲醛溶液中固定24 h，其后再描述内置样品位置、大小及炎症情况。以残存材料或局部炎性反应为中心周边1 cm范围切除标本。经脱水、石蜡包埋后制成6 μm切片，经苏木精-伊红染色，对标本进行组织学分析，观察与评价植入物的降解程度、孔隙变化、组织细胞反应、瘢痕及新生组织形成。

1.6 统计学分析应用Statview 5.0.1统计学软件，统计学方法为Fisher’s PLSD法。

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讨论

未经任何交联加强的Ⅰ型胶原支架，在体内因固有胶原酶的作用在很短的时间内被降解吸收。降解时间与支架本身的浓度及质量有关。在组织工程与再生医学领域内，使用任何可降解吸收的材料，除应具有良好的生物相容性外，还必须考虑材料在体内的存留时间及对细胞的亲和效果，以保证作为细胞外间质支架作用的材料，可以有充分时间允许受损部位的健康细胞及未分化细胞利用支架进行组织修复与再生^[1,12]。同时还应该考虑如何降低材料本身对机体的反应、减少产生异物及免疫反应的诱因。

对胶原材料进行交联加强可增加材料抗自身胶原酶降解能力，提高其在机体受损部位存留时间，同时降低其对机体产生的生物学反应。采用高温脱水交联方法对Ⅰ型胶原分子间进行脱水，可以促使胶原肽链间形成较为稳定的结合，促成分子间的交联^{[8, 13]}。实验证明高温脱水交联功效可靠，但和其他如甲醛、戊二醛等化学交联剂相比，处理后的胶原支架抗胶原性能还相差较多。由于高温脱水交联加强采用的是物理方法，所以没有化学交联剂的副作用，如细胞毒性反应，因此它对引发机体组织学的反应也是最低的，故这种交联方法是最安全的，但高温脱水常规交联条件(105 ℃/24 h)的效果相对较低，而影响交联效果的因素只有交联温度与时间，因此延长交联时间或提高温度是改变交联效果的两个手段。实验表明在一定温度临界和限定的时间，胶原肽链分子间的氢离子转化成稳定趋势，不会因持续提升温度和延长交联时间而增加材料的抗降解性能。

采用美国麻省理工学院Yannas教授的高温脱水交联加强条件是在105 ℃，真空条件下持续24 h进行真空脱水交联加强。在临床实践中，使用Ⅰ型胶原人工硬脑膜材料时发现，常规处理的胶原硬脑膜支架在体内经1个月左右的时间基本降解吸收，有时不能真正达到同步修复硬脑膜缺损，造成脑脊液渗漏^[1]。为此作者设计了延长交联时间的方法，借以改善胶原材料支架在体内的存留时间及支架内部孔隙开放，使得胶原支架得以在临床上取得更好的效果。

本实验显示置入后14 d，105 ℃/48 h组皮下残留的胶原支架及其内部仍保存开放孔隙结构最佳。支架残留于皮下组织中的比例为：105 ℃/24 h组为43%，105 ℃/48 h组最高，为82%；115 ℃/24 h最低，为14%。在统计学方面延时交联(105 ℃/48 h)组和升温交联(115 ℃/24 h)组之间在胶原支架残留量上有明显差距(P < 0.05)，表明105 ℃/48 h组支架的抗胶原酶降解能力较强(图9A)。同时在研究中发现，材料形态与孔隙保持开放程度有较为明显的差异，115 ℃/24 h组和105 ℃/24 h组中胶原支架整体形态消失，边缘及中心开放性孔隙基本消失，而且有不同程度的收缩，其中115 ℃/24 h最为严重；105 ℃/48 h组显示支架孔隙保持开放，尤其是支架中心部位孔隙保持开放尤为明显，同时伴有细胞生存。3组胶原支架中心保持开放性孔隙的比例分别为14%、73%和0，表明105 ℃/48 h组抗降解及抗α-平滑肌收缩蛋白的收缩能力较其他各组为强(P < 0.05，图9B)。

在组织反应方面，3组中残留胶原周围均发现包绕支架的新生组织或类瘢痕组织形成。105 ℃/24 h组显示机体对材料的组织学反应较弱，在胶原支架外周正常细胞生长活跃；在105 ℃/48 h组和115 ℃/24 h组中发现细胞组织反应较常规组为重，尤其升温组显示尤为突出。类瘢痕组织在胶原支架端侧明显且多伴有新生血管形成。细胞形态多以淋巴细胞、未分化细胞为主，也发现少量的巨噬细胞。细胞反应也在这个时期最为突出，其后42 d时细胞数量及种类趋于正常。胶原支架内多被大量有活性的未分化细胞浸润，新生组织外周出现有序的正常组织，成纤维细胞有序排列，再生的新胶原成束显现，显微镜偏光镜观察有胶原特有的反光影像出现。

结论：以Ⅰ型胶原为基质的生物材料支架在组织工程学与再生医学方面应用广泛。Ⅰ型胶原支架具有良好的生物相容性，是一种具有良好功效的天然生物材料。由于胶原纤维本身力学性能较弱，低浓度的支架材料且未经交联加强时，在机体内极易被自体胶原酶降解吸收，在体内没有足够的时间保持其三维立体结构，不能使之发挥最大限度的支架作用^[1]。 105 ℃、24 h连续真空脱水是常规高温脱水交联加强的条件^[1-3]。决定高温脱水交联加强效果的因素是连续加温时间与真空温度的设定，作者在这里将加强时间设定由24 h延长至48 h，交联温度由原来105 ℃提升为115 ℃。通过实验显示在上述两大因素中，采用105 ℃加温时间的延长对增加Ⅰ型胶原的抗降解能力高于单纯提高温度因素。3组内置物在机体内均未发现特异性免疫和严重的异物反应，显示了Ⅰ型胶原材料良好的组织相容性及高温脱水交联加强方法的安全、有效性。通过大白鼠背部皮下组织的生物相容性实验初步判断，采用延长交联加强时间 (105 ℃/48 h)高温脱水交联加强的Ⅰ型胶原支架较常规处理胶原支架(105 ℃/24 h)及提高交联加强温度同时保留常规交联时间(115 ℃/24 h)高温脱水具有更佳的抗胶原酶的降解吸收及抗α-平滑肌收缩蛋白的收缩能力。在42 d的长期观察中，所有的动物皮下组织均可见到再生的正常胶原组织，所有实验标本均没有发现免疫反应及严重的异物过敏反应。综上所述，采用105 ℃/48 h交联加强处理的胶原支架不引起感染和伤口不愈合现象，在体内残留及保持其孔隙开放较105 ℃/24 h、115 ℃/24 h两组为佳。动物标本观察、显微镜组织学分析及统计学处理都表明，延长高温脱水时间而保持常规较低温度的这种交联加强方法，可以使胶原支架具有更好抗胶原酶降解及抗α-平滑肌收缩蛋白的能力，并达到更加完善的组织再生及抗粘连效果，是一种更为有效、安全的物理性加强方法。

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