环氧化酶抑制剂对急性不完全脊髓损伤核转录因子κB及CD4+/CD8+的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：塞来昔布治疗急性大鼠脊髓损伤，较目前通用的甲强龙具有不良反应少、价格低廉等优点，但是剂量尚无法准确把握。
目的：探讨不同剂量环氧化酶抑制剂对急性不完全脊髓损伤核转录因子κB及CD4+/CD8+的影响。
方法：采用改良Allen方法建立大鼠T8及T9段脊髓不完全损伤模型。将60只造模成功的大鼠随机等分为4组：单纯损伤组，不使用任何药物；塞来昔布小、中、大剂量组，分别于脊髓损伤30 min后灌胃塞来昔布25，50，100 mg/kg。
结果与结论：塞来昔布治疗后，脊髓损伤大鼠神经功能明显改善，脊髓中核转录因子κB表达水平明显降低，外周血中CD4+和CD8+T细胞数量明显减少，且小剂量的效果更佳。提示不同剂量的塞来昔布均可治疗急性创伤性脊髓损伤，且小剂量(25 mg/kg)的效果更佳。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 脑及脊髓损伤动物模型, 环氧化酶抑制剂, 塞来昔布, 剂量, 核转录因子&kappa, B, T细胞, 运动功能

Abstract:

BACKGROUND: Celecoxib has advantages including fewer adverse reactions and low cost over the commonly used methylprednisolone in the treatment of acute spinal cord injury, but the effective dose cannot be well controlled.
OBJECTIVE: To investigate different doses of cyclooxygenase inhibitors on nuclear factor κB and CD4+/CD8+ expression in rat models of acute incomplete spinal cord injury.
METHODS: Rat models of incomplete spinal cord injury in T8 and T9 segments were established using modified Allen method. Sixty successful modeling rats were randomly and evenly divided into 4 groups: simple injury group and low, medium-and high-dose of celecoxib groups. Rats in simple injury group were not applied any drugs. Rats in low-, medium- and high-dose celecoxib groups were respectively intragastrically administered 25, 50 and 100 mg/kg celecoxib after 30 minutes of spinal cord injury.
RESULTS AND CONCLUSION: After celecoxib treatment, rat neurological function was significantly improved. Nuclear factor κB expression level in spinal cord was significantly decreased. CD4+ and CD8+ T cell numbers in peripheral blood were significantly decreased. Low dose of celecoxib treatment had a better outcome. These results suggest that different doses of celecoxib can treat acute traumatic spinal cord injury, and low-dose
(25 mg/kg) celecoxib treatment can achieve a better outcome.

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中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

2.1 造模成功动物数量及过程所有大鼠在实验过程中无脱落，均进入结果分析。造模流程见图1。

2.2 模型方法的改进实验使用质量为10 g的不锈钢棒从2.5 cm高处垂直落下，打在脊髓表面(致伤能量为25 gcf)，打击后可见大鼠双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛，造成大鼠不完全瘫痪。
2.3 模型更接近临床实践 Allen’s重物打击法是目前与临床脊髓损伤相关性最好的一种实验技术，属于外力客观因素(一般人类脊髓损伤多为损伤造成)，目前尚未发现更好的方法。
2.4 行为学表现
2.4.1 Tarlov评分随着损伤后时间的延长，单纯损伤组大鼠Tarlov评分逐渐增加，脊髓损伤逐渐修复；而塞来昔布小、中、大剂量组大鼠Tarlov评分均高于单纯损伤组(P < 0.05)，尤其小剂量组恢复趋势较好，而中剂量也有增加(P < 0.05)，但效果不如小剂量组，而大剂量组48 h后有下降趋势(表1)。

2.4.2 斜板实验随着损伤后时间的延长，各组大鼠斜板实验评分均有所恢复，可见塞来昔布小剂量组恢复最为稳定，中剂量组72 h变化不明显，而大剂量组在治疗48 h后评分有下降趋势(表2，图2)。

2.5 核转录因子κB的表达水平免疫组化染色显示，核转录因子κB主要存在于神经元胞浆及胞核内。单纯损伤组大鼠脊髓中核转录因子κB表达增加，塞来昔布小、中、大剂量组大鼠脊髓中核转录因子κB表达明显较损伤组降低(P < 0.05)，24 h时塞来昔布大剂量组最为明显，但48和72 h时塞来昔布小剂量组大鼠脊髓中核转录因子κB表达低于塞来昔布中、大剂量组(P < 0.05；图3，表3)。

2.6 CD4+和CD8+T细胞数量造模后24 h，与单纯损伤组相比，塞来昔布小、中、大剂量组大鼠外周血中CD8+T细胞数量明显减少(P < 0.05)；48 h时，与单纯损伤组相比，塞来昔布小、中、大剂量组大鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞数量明显减少(P < 0.05)，且塞来昔布大剂量组大鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞数量低于塞来昔布小、中剂量组(P < 0.05)；72 h时，与单纯损伤组相比，塞来昔布小、中、大剂量组CD4+和CD8+T细胞数量明显减少(P < 0.05)，且塞来昔布中、大剂量组大鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞数量高于塞来昔布小剂量组(P < 0.05；表4)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年在广州中医药大学完成。

1.3 材料清洁级纯种SD大鼠，鼠龄4-6个月，雌雄各半，体质量250-300 g，由广州中医药大学实验中心提供，动物许可证号SCXK(粤)2011-0015。实验过程中对动物的处置经过学校伦理学委员会批准，符合医学伦理学标准。

1.4 方法

1.4.1 造模方法大鼠称质量后戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉，卧位固定，术野10%硫化钠脱毛，以T₈_-₉棘突为中心背侧正中纵行切口，手术咬除T₈及T₉的棘突和双侧椎板，显露1.5-2.0 cm长的硬膜囊，参照改良的Allen’s重物打击法^[7]，用质量为10 g的不锈钢棒从2.5 cm高处垂直落下，打在脊髓表面(致伤能量为25 gcf)，打击后可见大鼠双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛，造成大鼠不完全瘫痪。致伤后迅速移去打击棒，生理盐水冲洗伤口后，覆以明胶海绵(南京金陵制药厂)局部止血(可防止脊髓组织与周围组织粘连从而为细胞移植或取脊髓组织时造成困难)，逐层缝合肌肉、皮肤，碘伏消毒后放入笼中，必要时补液；每日膀胱按摩2次至其排尿反射恢复为止。

1.4.2 造模成功的检测标准大鼠尾巴痉挛性摆动数下后成瘫痪状态；双后肢及躯干回缩扑动，之后双后肢表现为迟缓性瘫痪，硬脊膜下明显可见出血后瘀紫色，麻醉苏醒后双后肢呈完全瘫痪状态^[8]。

1.4.3 实验分组及干预将60只造模成功的大鼠随机等分为4组：单纯损伤组，不使用任何药物；塞来昔布小、中、大剂量组，分别于脊髓损伤30 min后灌胃塞来昔布(辉瑞公司)25，50，100 mg/kg^[7^，^9]。

1.4.4 脊髓神经功能评价于造模后24，48，72 h，每组取3只大鼠进行功能评价。

斜板实验：采用改良Rivlin法^[10]，将大鼠俯卧于一块 40 cm×80 cm 的平整木板上，头侧逐渐抬高，动物向下滑行时，木板与地面的夹角为斜板角度，以大鼠抓握能力决定角度的大小，并反映其神经功能恢复情况。

Tarlov评分^[8]：0级，后肢无活动，不能负重；1级，后肢可见活动，不能负重；2级，后肢活动频繁或有力，不能负重；3级，后肢可支持体重，能走一两步；4级，可行走仅有轻度障碍；5级，行走正常。

1.4.5 取材于造模后24，48，72 h，每组取12只大鼠，在戊巴比妥麻醉下，从脊髓组织取出用40 g/L的多聚甲醛固定液固定8 h，然后石蜡包埋。

1.4.6 免疫组化测定脊髓核转录因子κB表达石蜡切片厚5 μm，脱水，过氧化氢封闭。免疫组化检测脊髓背角核转录因子κB的表达，切片中分别加入1∶400倍稀释的兔抗大鼠核转录因子κB抗体(上海酶联生物科技有限公司)， 4 ℃孵育过夜，次日采用HRP-DAB底物显色试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)检测其表达，采用BX41光学显微镜(日本Olympus公司)计算400倍视野下核转录因子κB阳性细胞的数量。

1.4.7 流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺T细胞采用人类调节性T细胞染色试剂盒(ebioscience公司)进行检测。每个时间点随机抽取1只大鼠的外周血，分离淋巴细胞，悬液细胞浓度为1×10⁹ L^-1。再分别加入FITC抗大鼠CD4抗体(20 μL) PE抗大鼠CD8抗体(30 μL)，混合均匀后，加入2 mL PBS洗涤细胞，除上清，流式细胞仪(美国BD公司)检测CD4和CD8阳性细胞数量。

1.5 主要观察指标动物脊髓损伤程度，脊髓中核转录因子κB表达水平以及外周血中CD4⁺、CD8⁺T细胞的数量。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，对非正态分布参数采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脊髓损伤一直是医学界研究的重点，国内脊髓损伤的发生呈逐年上升趋势，如何最大程度地减轻脊髓伤残程度，恢复其功能是医学界研究的热点。脊髓损伤后，在损伤水平以下脊髓的运动、感觉、反射及括约肌和植物神经功能受到不同程度的损害^[11]。然而，在一定的情况下，不完全脊髓损伤的患者可以部分恢复他们的基本运动能力。目前，动物脊髓损伤模型最常用的是横断或半横断法及重物压迫法，但这些方法临床相关性差，重复性低，动物死亡率高。Allen’s重物打击法至1911年Allen创造以来，经过多次修正及改进，在脊髓损伤研究领域已广泛使用，大量研究表明该方法是目前与临床脊髓损伤相关性最好的一种实验技术，属于外力客观因素(一般人类脊髓损伤多为损伤造成)，目前尚未发现更好的方法。但打击法也有弊端，其受人为因素及环境因素影响较大，且小鼠数量较少，无神经电生理作为客观指标，制备模型误差也较大^[12-13]。为避免人为性误差及降低动物死亡率，实验严格按照Allen’s进行操作，标准造模方案并未进行创新。但过程中积极给予止血及清理，避免感染或其他并发症。
急性脊髓损伤可导致严重的运动、感觉和括约肌功能障碍。由炎症因子引起的炎症反应在继发性损伤的发生、发展过程中起关键作用^[14-15]。通过恰当的抗炎干预维持机体致炎/抗炎平衡,将成为脊髓损伤药物治疗的一条重要策略。近年来发现核转录因子信号转导途径在脊髓损伤后炎症细胞、神经元和内皮细胞中的活化，活化的核转录因子κB主要通过调控靶基因转录生成的产物来参与继发损伤的过程^[16]。核转录因子κB在急性脊髓损伤后早期表达即可升高，同时，核转录因子κB又具有神经保护作用。因此，如何有效抑制核转录因子κB的损伤作用，充分发挥其对脊髓的保护作用具有重要意义^[17]。霍岩等^[18]使用重组人促红细胞生成素治疗Nystrom’s压迫法制作脊髓压迫损伤模型大鼠，证实其可能通过下调核转录因子κB的表达参与脊髓继发性损伤的修复。急性脊髓损伤过后，虽然核转录因子κB介导的继发性损伤的部分机制已基本明确^[19-20]，但相关药物诱导剂作用机制仍不是很清楚。
由脊髓损伤引发的免疫炎症反应作为继发性损伤的重要机制，始终是人们研究和关注的热点。脊髓损伤早期神经元和神经胶质细胞分泌产生的细胞因子可能是造成损伤后继发免疫损伤的重要因素，使组织损伤及神经元的死亡加剧，影响脊髓损伤后神经元的修复和功能的改善^[21]。在所有的炎症递质中环氧化酶家族又有着非常重要的地位，选择性环氧化酶2抑制剂是一个潜在的神经元保护因子，在神经系统发生继发性损伤过程中，具有抑制神经元凋亡的作用的可能^[22]。环氧化酶抑制剂多为解热镇痛抗炎药，通过抑制环氧化酶减少前列腺素的合成，从而起到抗炎作用；所有选择性环氧化酶2抑制剂(塞来昔布、艾托昔布、伐地昔布和帕瑞昔布)，已确定环氧化酶2抑制剂会有胃肠道危险和心血管危险，很多实验研究认为小剂量就表现出了很好的抗炎作用，且未见大剂量的临床应用安全性，因此大部分实验依然选用最低有效剂量环氧化酶2抑制剂，疗程尽可能缩短^[23]。本实验显示，小剂量塞来昔布不仅保持了很好的抗炎镇痛作用，而且具有良好的胃肠道耐受性，与使用传统非类固醇类抗炎药比较所导致的消化道不良反应的发生率低^[24]。文章选择小剂量塞来昔布拟减轻炎症反应能降低脊髓损伤的程度和范围，减少神经细胞的坏死，提高神经功能的恢复。
近年来，一些研究表明，自身免疫性T细胞可以保护受损神经元，因此，利用免疫干预，清除损伤局部的坏死组织，挽救残余神经元，作为一种潜在的有前景的治疗手段^[25-26]。但T细胞介导的免疫反应发挥神经保护效应的机制目前还不完全清楚，T细胞在脊髓损伤后作用机制比较复杂，有研究认为T细胞能够被招募到神经营养因子缺乏的损伤部位或T细胞还可能通过其靶细胞小胶质细胞来发挥神经保护作用^[27-28]，脊髓损伤后，启动了机体的天然免疫，血液循环中的T细胞逐渐浸润到损伤的脊髓周围，参与组织局部小胶质细胞的相互作用，引发适应性免疫。骆二红等^[29]用流式细胞术检测显示，脊髓损伤前后SD大鼠外周血T淋巴细胞亚群1，7和14 dCD3+CD8+T细胞比例均无明显变化，而脊髓损伤后第3，5天上述细胞数量增加。脊髓损伤后1，3，5及7 d的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞比例以及CD3+ CD4+/CD3+CD8+比值均明显低于脊髓损伤前。在脊髓损伤后14 d，上述各T细胞亚群的比例均恢复到损伤前水平。提示脊髓损伤后的早期阶段，可能存在T细胞功能的异常。朱海涛等^[30]发现在不完全脊髓损伤后小鼠CD3、CD68和神经生长因子阳性细胞表达均上调，认为早期T细胞对脊髓损伤可能有损伤作用，而后期可能有促进修复作用。本实验结果显示脊髓损伤后大鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞数量上升，而塞来昔布的应用有效地阻止这2种细胞的激活和增殖。张帆等^[31]也证实选择性环氧化酶2抑制剂塞来昔布对大鼠脊髓损伤具有保护作用，与本实验结论一致。
综上，环氧化酶2抑制剂塞来昔布可抑制急性脊髓损伤后的继发性损害，减轻核转录因子κB介导的炎性反应以及抑制CD4+T和CD8+T细胞增殖，对脊髓不完全损伤起到保护作用。

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