鸡卵清提取液不同成分对细胞周期与细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.014

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (46): 7451-7455.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.014

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

鸡卵清提取液不同成分对细胞周期与细胞凋亡的影响

阮光萍^1，2，3，姚翔^1，2，3，刘菊芬^1，2，3，王金祥^1，2，3，庞荣清^1，2，3，潘兴华^1，2，3

1解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，云南省昆明市 650032；2干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省昆明市 650032；3云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032

收稿日期:2015-09-14 出版日期:2015-11-12 发布日期:2015-11-12
通讯作者: 潘兴华，博士，主任医师，解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:阮光萍，女，1974年生，云南省昆明市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞基础研究。
基金资助:
国家支撑计划(2014BAI01B01)；云南省科技计划项目(2013CA005)资助的课题

Different components of chicken egg-white extracts affect cell cycle and apoptosis

Ruan Guang-ping^{1, 2, 3}, Yao Xiang^{1, 2, 3}, Liu Ju-fen^{1, 2, 3}, Wang Jin-xiang^{1, 2, 3}, Pang Rong-qing^{1, 2, 3}, Pan Xing-hua^{1, 2, 3}

1The Cell Biological Therapy Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 2Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions (Yunnan Province), Kunming 650032, Yunnan Province, China; 3Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2015-09-14 Online:2015-11-12 Published:2015-11-12
Contact: Pan Xing-hua, M.D., Chief physician, the Cell Biological Therapy Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions (Yunnan Province), Kunming 650032, Yunnan Province, China; Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Ruan Guang-ping, M.D., Associate chief physician, the Cell Biological Therapy Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions (Yunnan Province), Kunming 650032, Yunnan Province, China; Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Support Program of China, No. 2014BAI01B01; Yunnan Provincial Science and Technology Project, No. 2013CA005

摘要/Abstract

摘要：

背景：如果一种提取液与细胞共培养后，能增加细胞周期的S期，减少细胞凋亡百分比，则证明这种提取液有促细胞增殖的作用。

目的：验证鸡卵清提取液不同组分对293T细胞的增殖及细胞生长周期及细胞凋亡的影响。

方法：用超滤管将鸡卵清提取液分离为大于10 ku和小于10 ku和大于3 ku和小于3 ku的成分，用于与细胞共培养，培养3 d后，检测细胞增殖，细胞周期与细胞凋亡情况。

结果与结论：鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用，同时有促进细胞周期S期百分比增加，细胞凋亡百分比减少的作用。结果提示鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用，还有促进细胞周期S期百分比增加，细胞凋亡百分比减小的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 鸡卵清提取液, 不同成分, 细胞周期, 细胞凋亡, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: If an extract can prolong the S phase and reduce the percentage of apoptosis after co-culture with cells, it is proved that the extract is able to promote cell proliferation.
OBJECTIVE: To prove the effects of chicken egg-white extracts with different components on the proliferation, cell cycle and apoptosis of 293T cells.
METHODS: An ultrafiltration unit was used to separate chicken egg-white extracts into different components that were > 10 ku, < 10 ku, > 3 ku and < 3 ku to co-culture with cells for 3 days. Then, cell proliferation, cell cycle and cell apoptosis were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Chicken egg-white extract components of < 10 ku and < 3 ku could promote cell proliferation, increase the percentage of S-phase cells and reduce the percentage of apoptosis. In conclusion, chicken egg-white extract components that are < 10 ku and < 3 ku can promote cell proliferation, as well as increase the percentage of S-phase cells and reduce apoptosis percentage.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chickens, Cell Cycle, Apoptosis, Cell Proliferation

阮光萍，姚翔，刘菊芬，王金祥，庞荣清，潘兴华. 鸡卵清提取液不同成分对细胞周期与细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(46): 7451-7455.

Ruan Guang-ping, Yao Xiang, Liu Ju-fen, Wang Jin-xiang, Pang Rong-qing . Different components of chicken egg-white extracts affect cell cycle and apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(46): 7451-7455.

图/表（结果） 4

2.1 SDS-PAGE结果电泳结果表明(图1)，鸡卵清提取液有3条主带，90 ku、40 ku和12 ku，大于10 ku和大于3 ku组分的浓度大于鸡卵清提取液，小于10 ku和小于3 ku的组分不含蛋白条带。大于10 ku和大于3 ku组分同样也是3条主要蛋白条带，分别是90 ku、40 ku和12 ku。

2.2 细胞周期检测结果细胞周期检测结果表明，小于 10 ku和小于3 ku都有促进细胞周期中S期的百分比增加的作用，对比培养基，差异有显著性意义(P < 0.01)，证明鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促进细胞增殖的作用，小于10 ku和小于3 ku的两组成分差异无显著性意义，说明鸡卵清提取液中这两组成分对促进细胞增殖的作用是相同的(图2)。

2.3 细胞凋亡检测结果细胞凋亡检测结果表明，小于 10 ku和小于3 ku都减少凋亡细胞的百分比，作用强于普通培养基(P < 0.01)，证明鸡卵清提取液中小于10 ku和小于 3 ku的成分有促进细胞活性和增殖的作用，小于10 ku和小于3 ku的两组成分差异无显著性意义，进一步说明鸡卵清提取液中这2种成分都有减少凋亡细胞百分比的作用，2种成分作用相同(图3)。

2.4 细胞增殖活性检测结果 293T用不同成分，25%的终浓度共培养3 d，结果表明小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用(图4 )，在25%的终浓度时，胎牛血清的终浓度为7.5%，而培养基胎牛血清的终浓度为10%，在胎牛血清终浓度低于培养基时，小于10 ku和小于3 ku的成分仍然有促细胞增殖的作用，说明小于10 ku和小于3 ku的成分可以做为培养基的添加剂，在终浓度为25%时，促细胞增殖作用大于通常用的培养基(P < 0.05)，这将在细胞生物学有广泛的应用。鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的两种成分可以作为细胞培养基的添加剂，减少昂贵的胎牛血清的用量，在添加了这两种成分的培养基中，胎牛血清终浓度仅需7.5%，就能发挥较好地促细胞增殖作用，比普通的完全培养基(胎牛血清终浓度10%)促细胞增殖作用还要好(P < 0.05)，为新型细胞培养基的发展打下了较好的实验基础。

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引言

证明一种卵细胞提取液含有促细胞增殖作用的成分，将在细胞生物学领域有广泛的应用[1-2]。作者前期研究表明，鸡卵清提取液能促进细胞增殖与活性，后来发现鸡卵清提取液中小于3 ku的成分有促进293T细胞增殖的作用[3]。后来作者深入研究，用截留量为100，50，30，10，3 ku的超滤管将鸡卵清提取液分为大于100 ku，小于100 ku，大于50 ku，小于50 ku，大于30 ku，小于30 ku，大于10 ku，小于10 ku，大于3 ku，小于3 ku的成分，用于细胞增殖活性检测，结果表明小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用，在终浓度为25%与293T细胞共培养3 d后，促进细胞增殖的作用大于普通的培养基，当小于10 ku和小于3 ku的成分在终浓度为25%时，胎牛血清的终浓度为7.5%，而这时培养基胎牛血清的终浓度为10%，但这时小于10 ku和小于3 ku的成分促细胞增殖作用大于培养基，说明小于10 ku和小于3 ku的成分可以作为细胞培养基的添加剂，促进细胞增殖，同时减少价格昂贵的胎牛血清的用量，较好地促进细胞增殖。
由于细胞周期和细胞增殖、凋亡属于不同的信号通路调控，目前研究发现，调控细胞周期的核心因子就是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(CKI)，它们间相互调节，通过相互间形成蛋白复合物，作用于细胞周期的不同时相，参与并决定细胞周期的生命进程。由于细胞周期的调控是一个精细的平衡过程，往往通过多种调控因子参与及其调控机制影响肿瘤的发生及发展。
众多研究表明，如果一种物质有抑制细胞增殖的作用，则这种物质与细胞共培养后会明显抑制细胞从G1期到S期的过渡[4-6]，使处于S期的细胞数量明显减少，从而抑制细胞的增殖，增加细胞凋亡的百分比。反之，如果一种物质与细胞共培养后，能使细胞周期S期的百分比明显增加，减少细胞凋亡的百分比，则证明这种物质有促进细胞增殖的作用。
细胞的增殖是产生新细胞，代替衰老、死亡和损伤细胞的过程。细胞的增殖即是细胞分裂的过程，分为DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2/M期)。在肿瘤增殖的过程中，如果阻断细胞生长的任一周期，则细胞增殖的过程将被阻滞，肿瘤的生长将被抑制。本研究主要探讨鸡卵清提取液不同组分对293T细胞的增殖及细胞生长周期及细胞凋亡的影响。细胞周期有严格的调控机制，任何一个环节的失调都可能导致细胞周期的失控[7]。针对细胞周期调控网络中的各种关键分子来控制肿瘤细胞增殖已成为肿瘤基因治疗新的思路和方法[8]。
作者在研究中发现，鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分能促进细胞周期S期的百分比增加，减少细胞凋亡的百分比，因此证明了鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促进293T细胞存活与增殖的作用，这将在细胞生物学领域有广泛的应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2015年1至7月在解放军昆明总医院临床实验科完成。

1.3 材料

鸡卵清提取液制备：取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄。卵清按1∶1加裂解液，充分搅匀，存放于4 ℃。冻融3次后离心，取上清，4 ℃保存。

裂解液配方：50 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl₂， 100 mmol/L HEPES(pH 8.2)，1 mmol/L二硫苏糖醇(DTT，dithiothreitol)，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF，phenylmethanesulfonyl fluoride)和2 mg/L抑肽酶(aprotinin)。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。提取液留取50 μL用Bradford方法测蛋白浓度。标记蛋白浓度和制备时间，分装保存于4 ℃。

1.4 实验方法

1.4.1 鸡卵清提取液各成分分离鸡卵清提取液用超滤管(截留量为10 ku和3 ku)分离不同组分，处理量为15 mL，用超滤管装15 mL鸡卵清提取液，离心4 000 r/min、30 min，离心后，滤膜下面滤过的是小于10 ku和小于3 ku的成分，滤膜上面获得大于10 ku和大于3 ku的组分。

1.4.2 SDS-PAGE电泳鸡卵清提取液和大于10 ku和大于3 ku的组分稀释20倍，小于10 ku和小于3 ku的组分不稀释，各取50 μL加50 μL 2×上样缓冲液，沸水浴5 min，上样5 μL电泳，下胶12%的浓度，上胶5%的浓度，80 V电压跑上胶，120 V电压跑下胶，染色3 h，脱色过夜后，拍照观察。配胶试剂和染色液、脱色液购自碧云天生物技术公司。

1.4.3 鸡卵清提取液各成分与细胞共培养用12孔细胞培养板，每孔加2×10⁵个293T细胞，加300 μL培养基，再依次加300 μL培养基，鸡卵清提取液，大于10 ku和小于 10 ku的成分，大于3 ku和小于3 ku的成分，使提取液的终浓度为50%，培养3 d后检测细胞周期和细胞凋亡。

1.4.4 细胞增殖活性检测将293T细胞浓度调为1×10⁸ L^-1，96孔板4周加100 μLPBS防蒸发，中间每孔50 μL细胞，每孔5×10³个细胞，加入提取液50 μL，则提取液的终浓度为50%，每种提取液做10个复孔，在37 ℃培养箱中培养3 d后，用Promega检测细胞增殖活性的试剂盒(CellTiter 96 Aqueous OneSolution Cell Proliferation Assay)每孔加 20 μL，37 ℃放3 h，在490 nm波长处比色。

1.4.5 细胞周期检测细胞周期检测试剂盒购自Beckman Coulter公司，将细胞收集，离心，弃上清，悬于100 μL PBS中，加200 μL固定液，混匀，室温避光15 min，加1 mL染液，混匀，室温避光15 min，上流式机子检测细胞周期中G₁，G₂和S期的百分比。

1.4.6 细胞凋亡检测细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，将细胞收集，离心，弃上清，悬于100 μL 1×缓冲液中，加5 μL 7-AAD和5 μL PE-Annexin V，混匀，室温避光15 min，悬于400 μL 1×缓冲液中，上流式机检测凋亡细胞的百分比。

1.5 主要观察指标 ①SDS-PAGE结果。②细胞周期检测结果。③细胞凋亡检测结果。④细胞增殖活性检测结果。

讨论

鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分与细胞共培养后，细胞周期的S期百分比明显增加，说明小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用，细胞周期主要分G₁，G₂和S期，G₂与S期的百分比增加都代表细胞增殖活性增加^[9-10]。鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分与细胞共培养后，细胞的S期百分比明显增加，说明这两种成分都有促细胞增殖的作用，小于3 ku成分的作用与以前的研究报道一致^[3]，新发现小于10 ku的成分也能促细胞增殖，统计结果表明与小于3 ku的成分的作用无统计学差异。进一步说明小于10 ku和小于3 ku的成分都是鸡卵清提取液中有促细胞增殖作用的物质，至于小于10 ku和小于 3 ku的成分是相同的物质还是不同的物质，现在还不清楚，但它们都属于鸡卵清提取液中的小分子物质，都没有明显的蛋白条带。都能促进细胞周期的S期百分比明显增加，使细胞凋亡的百分比明显减少，有使细胞活性增加的作用，这个作用将在细胞生物学研究中有广泛的应用^[1^，^11]。

鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分与细胞共培养后，细胞凋亡的百分比与培养基相比明显减少，证明细胞程序性死亡减少，细胞增殖活性增加^[2^，^12-19]。作者用BD的细胞凋亡检测试剂盒，当PE-Annexin Ⅴ单阳性时代表早期凋亡的百分比，当PE-Annexin Ⅴ和7-AAD双阳性时代表晚期凋亡细胞和死细胞的百分比，实验发现用鸡卵清提取液和各组分共培养后，晚期凋亡细胞和死细胞的百分比比用培养基共培养减少了，说明细胞的活性增加，细胞程序性死亡减少，鸡卵清提取液有促进细胞存活的作用。

实验用截留量为100，50，30，10，3 ku的超滤管将鸡卵清提取液分为大于100 ku，小于100 ku，大于50 ku，小于50 ku，大于30 ku，小于30 ku，大于10 ku，小于10 ku，大于3 ku，小于3 ku的成分，用于细胞增殖活性检测，结果表明小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞增殖的作用，由于其他分子质量的成分没有促细胞增殖的作用，在这篇文章中作者集中报道了小于10 ku和小于3 ku的成分的作用，之前作者研究表明小于3 ku的成分促进293T细胞增殖，在后面的研究中发现小于10 ku的成分也促进293T细胞增殖，与小于 3 ku的成分相比没有统计学意义，但小于10 ku和小于3 ku的成分与培养基相比，在终浓度为25%与293T细胞共培养3 d后，促进细胞增殖的作用大于普通的培养基，当小于10 ku和小于3 ku的成分在终浓度为25%时，胎牛血清的终浓度为7.5%，而这时培养基胎牛血清的终浓度为10%，但这时小于10 ku和小于3 ku的成分促细胞增殖作用大于培养基，说明小于10 ku和小于3 ku的成分可以作为细胞培养基的添加剂，促进细胞增殖，同时减少价格昂贵的胎牛血清的用量，较好地促进细胞增殖^[9-11^，^20-30]。

本研究表明，鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分有促细胞活性与增殖的作用，当在培养基中添加小于10 ku和小于3 ku的成分为25%时，促细胞增殖的作用大于通常用的10%胎牛血清的培养基，而添加了25%的小于10 ku和小于3 ku的成分时，胎牛血清只需用7.5%的终浓度，而鸡卵清提取液中小于10 ku和小于3 ku的成分可以大量获取，成本便宜，这样可以减少价格昂贵的胎牛血清的用量，更好地促进细胞活性与增殖。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

鸡卵清提取液不同成分对细胞周期与细胞凋亡的影响

Different components of chicken egg-white extracts affect cell cycle and apoptosis

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