退变性脊柱侧凸髓核组织中microRNA筛选及靶基因定位

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.46.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：microRNAs(miRNAs)在多种疾病中扮演重要的角色，对退变性脊柱侧凸患者miRNAs表达谱的分析，有助于揭示其发病机制。

目的：比较退变性脊柱侧凸患者与正常对照组椎间盘组织中miRNAs表达谱的差异，并探究其在退变性脊柱侧凸发病机制中的作用。

方法：对获取的48例退变性脊柱侧凸患者(男36例，女12例；58-69岁)术中切除的椎间盘组织髓核组织和36例腰椎骨折患者正常髓核组织依次进行髓核细胞分离、培养、染色鉴定、提取标本总RNA；采用microRNA微阵列基因表达实验和分析技术筛选差异表达的miRNAs并采用实时qPCR技术对其中高表达者进行验证；综合MicroCosm v5、TargetScan 5.1和microRNA.org等3个数据库的靶基因信息，取交集分析预测靶基因，并分析与差异靶基因功能显著相关的生物信号通路；定量PCR方法验证筛选结果。

结果与结论：19条miRNA表达存在差异。经验证后，退变性脊柱侧凸患者的椎间盘组织中miR-98呈显著高表达，倍值变化为6.368；预测靶基因为白细胞介素10，此靶基因位于JAK-STAT信号通路的上游，参与其信号传导。miR-98在退变性脊柱侧凸患者的椎间盘中呈高表达，对应的靶基因为白细胞介素10。提示该靶基因启动JAK-STAT信号通路在退变性脊柱侧凸的发病机制中可能发挥至关重要的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 退变性脊柱侧凸, 椎间盘, microRNA, 信号通路, 发病机制

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNAs (miRNAs) play an important role in many diseases. To analyze the miRNA expression profile in degenerative scoliosis patients is helpful for classifying its pathogenesis.

OBJECTIVE: To compare miRNAs expression profile in the intervertebral disc tissue between degenerative scoliosis patients and healthy controls, and to investigate its role in the pathogenesis of degenerative scoliosis.

METHODS: Degenerative nucleus pulposus tissues from 48 patients with degenerative scoliosis (male 36, female 12; 58-69 years old) and normal nucleus pulposus tissues from 36 patients with lumbar fractures were harvested to isolate, culture and identify nucleus pulposus cells followed by total RNA extract. Differentially expressed miRNAs were screened by microRNA microarray analysis and validated by real-Time qPCR. Target genes of highly expressed microRNAs were predicted by analyzing information from MicroCosm v5, TargetScan 5.1 and microRNA.org databases. Biological signal pathways associated with the target genes were analyzed, and qPCR was used to validate the screening results.

RESULTS AND CONCLUSION: Nineteen differentially expressed miRNAs were identified. The miR-98 was highly expressed in degenerative nucleus pulposus tissue, and the fold change was 6.368. Predicted miR-98 target gene was interleukin-10, which was involved in JAK-STAT signaling pathway and located in upstream of this pathway. In degenerative nucleus pulposus cells of degenerative scoliosis patients, miR-98 was highly expressed, and the corresponding target gene was interleukin-10. These results indicate that JAK-STAT signaling pathway may play an important role in the pathogenesis of degenerative scoliosis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Scoliosis, Intervertebral Disk, Genes, Tissue Engineering

李浩然，崔青，董占引，张建华，李海清，赵玲. 退变性脊柱侧凸髓核组织中microRNA筛选及靶基因定位[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(46): 7396-7400.

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计病例-对照。

1.2 时间及地点 2011年8月至2014年6月在河北省沧州中西医结合医院脊柱外科完成。

1.3 对象退变性脊柱侧凸组椎间盘组织取材于本院脊柱外科退变性脊柱侧凸患者术中切除的椎间盘组织，共48例，男36例，女12例，年龄58-69岁。其中L_3/4椎间盘12例，L_4/5椎间盘17例，L₅/S₁椎间盘19例。退变性脊柱组织组标本中10例用于microRNA芯片筛选研究。

对照组：取材于腰椎爆裂性骨折患者行前路减压髓核切除中切除的正常髓核组织块，共36例，男25例，女11例，年龄16-22岁。其中L_1/2椎间盘12，L_3/4椎间盘8例，L4/5椎间盘16例。对照组中10例用于microRNA芯片筛选实验。

1.3.1 纳入标准退变性脊柱组织组根据临床症状和体征、X射线片、CT、MRI表现诊断为退变性脊柱侧凸患者。对照组患者腰椎间盘无影像学退变改变，年龄低于25岁。

1.3.2 排除标准 ①患者既往体健，排除肿瘤、感染、类风湿关节炎和干燥综合征等自身免疫性疾病。②近期进行

退变性脊柱侧凸髓核组织中microRNA筛选及靶基因定位实验的试剂及设备：
试剂及设备	来源
荧光显微镜	Nikon公司，日本
倒置相差显微镜	Olympus，日本
HWC-52型恒温水浴箱	上海天平仪器厂
CO₂培养箱	Hera-cell公司，德国
恒温摇床	Heidolph公司，德国
青霉素或链霉素、高糖DMEM培养基	Gibco公司，美国
体积分数为10%的胎牛血清、EDTA、Ⅱ型胶原酶、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶	Sigma公司，美国
Trizol试剂	Invitrogen公司，美国
实时定量PCR检测仪	ABI7900，美国
microRNA芯片	Exiqon，丹麦
microRNA qPCR引物	GeneCopoeia公司，美国

免疫抑制剂治疗的患者。

1.4 实验方法

1.4.1 髓核细胞的分离、培养和鉴定将髓核组织用含有青霉素和无青霉素的D-Hanks液各冲洗3遍；用剪刀剪碎髓核组织，37 ℃下用0.25%的胰蛋白酶和质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶联合消化50 min，每5 min轻轻摇动1次，收集消化液，1 000 r/min离心5 min，去除上清液。用DMEM/F12培养液吹匀细胞，再次离心，重复3次。用计数板进行细胞计数，按1×10⁶接种于底面积为25 cm²培养瓶中，加入5 mL含青霉素100 U/mL、体积分数为10%的胎牛血清的DMEM/F12培养液。37 ℃、体积分数为5%的CO₂的培养箱中培养。每两三天换液1次，90%融合后用0.25%的胰酶消化并按1︰2比例传代。当第1代细胞爬片至70%-80%融合时，将细胞爬片取出，行瑞氏染色、甲苯胺蓝染色、番红“O”染色以及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，光镜下观察细胞。

1.4.2 髓核组织中总RNA分离采用TRIzol (Invitrogen)和RNeasy mini kit (QIAGEN)试剂按产品说明书操作完成。RNA完整性以8%的变性琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.3 数据校正和差异探针筛选首先需要对应用microRNA微阵列芯片方法得到的筛选结果进行原始数据预处理和归一化，以消除实验随机误差对数据分析带来的影响；使用稳定多阵列分析(robust multi-array analysis，RMA)归一化方法得到校正后的信号值。

1.4.4 聚类(Hierarchical cluster)分析应用Gene Cluster 3.0和TreeView软件(斯坦福大学，美国)对表达基因做系统聚类分析，以全面、直观地展示样品之间的关系及差异情况。计算两个样品间校正后的信号值的比值，即实验组荧光强度/对照组荧光强度；以2为阈值进行差异microRNA的筛选，倍数变化比值> 2为上调microRNA，倍数变化比值< 0.5为下调microRNA。

1.4.5 差异表达的miRNAs的qRT-PCR验证对芯片筛选出来的表达有差异的miRNAs扩大样本量进一步验证其可靠性。以U6 snRNA作为内参，数据采用2^-^ΔΔ^CT法进行分析(CT值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)，实验重复3次。

1.4.6 靶基因预测分析对筛选出的上调和下调microRNA分别进行靶基因预测。综合MicroCosm v5、TargetScan 5.1和microRNA.org三个数据库的靶基因信息，取交集作为最终的预测结果，以增加可靠性。

1.4.7 靶基因定位(gene ontology，GO)分析对差异靶基因进行GO分析，统计每个GO term中所包括的差异靶基因个数，并应用计算机软件统计方法计算出每个GO term中靶基因富集度的显著性，并以此判断靶基因中具有显著性意义的GO term。

1.4.8 靶基因信号传导通路分析对差异靶基因进行信号传导通路显著性分析。分析每个信号传导通路中所包含的靶基因个数，用超几何分布的计算机软件统计方法得出反映靶基因分布的显著性富集度，进而找出与靶基因功能显著相关的信号通路。

1.5 主要观察指标 ①髓核细胞鉴定结果。②差异性表达的microRNA芯片及验证结果。③靶基因预测结果。④靶基因GO及信号传导通路分析结果。

1.6 统计学分析数据分析采用SPSS 17.0(SPSS Inc，Chicago，IL)及GraphPad Prism 5(Graph Pad Software，Inc，La Jolla，California，USA)软件进行，非参数Mann- Whitney检验法或one-way ANOVA进行组间比较。

讨论

MircoRNAs(miRNAs) 是存在于生物体内长18-25 nt的一类短序列、非编码、具调控功能的单链小分子RNA，参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育、细胞增殖、分化与凋亡、物质代谢及免疫炎症等^[12-15]。现已明确，miRNAs是通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’-UTR)互补结合，在翻译水平上特异性抑制基因表达，调控高达30%的蛋白表达^[16]。

退变性脊柱侧凸患者椎间盘的退变在其发病机制中起至关重要的作用^[7]。当外源和内源的炎性因子通过细胞膜受体激活细胞内的细胞信号传导通路，改变了细胞核内的基因表达，椎间盘中的重要功能成分，即椎间盘细胞外基质减少，Ⅱ型胶原减少，Ⅰ型胶原增多，蛋白多糖表达显著降低，降解酶类的表达上调，进而引起椎间盘功能丢失及退变性脊柱侧凸的发生与发展^[7]。因此，只有明确介导细胞内基因表达变化的信号传导通道，基因治疗才能有的放矢。

MicroRNA芯片技术是近几年发展起来的一种新的高通量筛选技术，多用于检测患者与正常人microRNA的差异表达水平，已经在多种疾病中得到广发应用。基因芯片是一种高通量的筛选技术，能在特定的时空条件下同时筛选出成千上万条基因的表达情况，极大的提高了研究效率；它在疾病研究方面的应用，对寻找与疾病发病机制、诊断标记以及治疗靶点相关的基因有非常重要的价值。

本研究首次采用miRNA芯片技术对microRNA在退变性脊柱侧凸发病中的可能作用进行研究，在退变性脊柱侧凸患者椎间盘髓核细胞中筛选出19 个差异表达miRNAs，其中16个表达上调，分别是：hsa-miRNA-301a、hsa-miRNA-18a、hsa-miRNA-431、hsa-miRNA-376c、hsa-miRNA-202-3p、hsa-miRNA-98、hsa-miRNA-340-5p、hsa-miRNA-374a、hsa-miRNA-27b、hsa-miRNA-181c、hsa-miRNA-329、hsa-miRNA-15b、hsa-miRNA-34a、hsa-miRNA-410、hsa-miRNA-148b、hsa-miRNA-146a；3个表达下调，分别是：hsa-miRNA-342-5p、hsa-miRNA- 205、hsa-miRNA-335。随后，运用实时定量PCR验证芯片结果，显示miR-98表达量显著升高(倍值变化最大)，与芯片结果一致，提示芯片实验结果可靠、可信。本研究结果表明：microRNA参与了退变性脊柱侧凸的发病过程，并有可能在退变性脊柱侧凸的发病机制中起到较为重要的作用。这些差异表达microRNAs可能作为该病将来的治疗靶点，为该病的治疗及新药的开发提供理论依据。

值得关注的是，作者运用生物学软件(MicroCosm v5、TargetScan 5.1和microRNA.org)预测miR-98的靶基因为白细胞介素10，而白细胞介素10正好位于JAK-STAT信号通路的上游，推测该信号通路在退变性脊柱侧凸的发生、发展中可能起着重要作用。白细胞介素10是介导机体抗炎反应的重要细胞因子，其在退变的椎间盘中表达升高^[17]。Lin等^[18]发现白细胞介素10启动子单核苷酸多态性位点 -1082A/G、-592A/C及其mRNA的水平与腰椎间盘退变密切相关。在组织纤维修复的过程中白细胞介素10下调Ⅰ型胶原，上调MMPs(1，8)的表达^[19]。此外，重要的是白细胞介素10通过JAK-STAT信号通路抑制基质金属蛋白酶9的表达^[20]，从而在椎间盘退变中发挥着重要的作用。

microRNA的表达异常很有可能是退变性脊柱侧凸发生、发展以及演化的重要分子事件，特别是在该病的早期阶段，可能起着更为重要的作用。有意义的差异表达 microRNA可能是退变性脊柱侧凸潜在的诊断标记、治疗靶点或重要的致病因素，为进一步研究系统退变性脊柱侧凸的分子机制提供重要参考。对筛选出来差异表达 microRNA进行更大的样本的验证，不同的器官中的差异表达分析、组织来源分析以及对其功能研究将是作者下一步要开展的工作。

本研究首次证实退变性脊柱侧凸患者椎间盘组织中microRNA表达谱存在异常，进一步证实遗传因素在椎间盘退变中扮演着至关重要的作用，寻找异常表达的microRNA所调控的靶基因，为以后寻找退变性脊柱侧凸的治疗提供新的思路。

综上所述，miR-98在退变性脊柱侧凸患者的椎间盘组织中呈高表达，其对应的靶基因白细胞介素10；该靶基因位于JAK-STAT信号传导通路的上游。因此，miR-98可能通过调控靶基因白细胞介素10启动AK-STAT信号传导通路在退变性脊柱侧凸的发生育发展中起着至关重要的作用。本研究的研究结果，可能为临床上寻找退变性脊柱侧凸治疗靶点提供思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程