下颌持续前导作用下髁状突软骨改建的超微结构变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (29): 4634-4639.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.009

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下颌持续前导作用下髁状突软骨改建的超微结构变化

李雪1，王明国2，杨帅1，高洁1，范园园1，宋岩3

1潍坊医学院口腔医学院，山东省潍坊市 261053；
2济南市中心医院口腔科，山东省济南市 250013；
3辽宁医学院，辽宁省锦州市 121001

出版日期:2015-07-09 发布日期:2015-07-09
通讯作者: 王明国，教授，硕士生导师，济南市中心医院口腔科，山东省济南市 250013
作者简介:李雪，女，1990年生，山东省潍坊市人，汉族，潍坊医学院在读硕士，主要从事口腔种植方面的研究。
基金资助:
山东省科技发展项目(2014GSF11804)

Ultrastructural changes of reconstructed mandibular condylar cartilage under continuous mandibular advancement

Li Xue1, Wang Ming-guo2, Yang Shuai1, Gao Jie1, Fan Yuan-yuan1, Song Yan3

1School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China;
2Department of Stomatology, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, Shandong Province, China;
3Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Online:2015-07-09 Published:2015-07-09
Contact: Wang Ming-guo, Professor, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, Shandong Province, China
About author:Li Xue, Studying for master’s degree, School of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Development Program of Shandong Province, China, No. 2014GSF11804

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往的动物实验证明，前导下颌可以导致年轻SD大鼠的颞下颌关节组织发生改建，主要表现为髁状突组织的生长速度加快，下颌骨发生继发性生长。但其髁突软骨细胞的超微结构改建研究仍是研究的关键所在。
目的：观察生长期大鼠在下颌持续前导作用下髁状突软骨生长和改建的组织学和超微结构的变化。
方法：将4周龄SD大鼠随机分为对照组和实验组，实验组24 h佩戴下颌前导矫治器，分别在干预3，7，14，21，30 d麻醉处死动物并取材，光学显微镜和透射电镜观察大鼠髁突软骨的组织学和超微结构的变化。
结果与结论：从干预14 d开始，实验组髁突软骨厚度在观察周期中出现先增加后变薄的现象，髁状突中后部软骨厚度变化显著(P < 0.01)。从干预7 d开始髁突软骨细胞的超微结构发生改建，包括细胞内细胞核固缩，粗面内质网腔隙肿胀，脂滴变小甚至消失，核周微丝变少且不规则，细胞外基质增宽变多以及出现大片空白等。结果证实，在下颌前导作用下，大鼠髁突软骨会随着承受力的时间增厚或变薄，软骨细胞基质合成能力也会显著增强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 下颌前伸, 髁状突, 软骨, 改建, 超微结构, 颞下颌关节, 光学显微镜, 透射电镜, 功能性矫治器, 细胞核

Abstract:

BACKGROUND: Previous animal experiments have demonstrated that mandibular advancement can cause the remodeling of temporomandibular joint tissue of young SD rats. This is mainly characterized by accelerated growth rate of the condyle tissue and secondary growth of mandible. But the ultrastructural remodeling of condylar chondrocytes remains poorly understood.
OBJECTIVE: To observe the histological and ultrastructural variations of reconstructed condylar cartilage of young rats under the effect of continuous mandibular advancement.
METHODS: SD rats aged 4 weeks were randomly divided into control and experimental groups. Rats in the experimental group were subjected to mandibular advancement for 24 hours and sacrificed at 3, 7, 14, 21 and 30 days of intervention. Condylar cartilage samples were harvested and their histological and ultrastructural changes were observed under optical microscope and transmission electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: After 14 days of intervention, the thickness of condylar cartilage in the experimental group increased first and then became thin in the period of observation. The cartilage thickness variations in the postmedian condylar were significant (P < 0.01). After 7 days of intervention, the ultrastructure
of condylar chondrocytes was reconstructed, including intracellular karyopyknosis, rough endoplasmic reticulum compartment swelling, smaller even absent lipid droplets, less and irregular microfilaments around the nucleus, broadened and increased extracellular matrix and the emergence of large gaps. These results demonstrate that under continuous mandibular advancement, the rat condylar cartilage will become thick or thin with the endurance time, and chondrocyte matrix synthesis ability will be significantly enhanced.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Condyle, Cartilage, Ultrastructure

中图分类号:

R318

李雪，王明国，杨帅，高洁，范园园，宋岩. 下颌持续前导作用下髁状突软骨改建的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(29): 4634-4639.

Li Xue, Wang Ming-guo, Yang Shuai, Gao Jie, Fan Yuan-yuan, Song Yan. Ultrastructural changes of reconstructed mandibular condylar cartilage under continuous mandibular advancement [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(29): 4634-4639.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠30只，均进入结果分析，无死亡和感染。
2.2 大鼠一般情况所有实验动物健康，无意外死亡，毛色正常光亮，但不影响下颌前导的效果和固定的稳定性。
2.3 下颌前导作用力下大鼠髁突软骨的组织学变化及软骨厚度变化光学显微镜下观察显示，髁突软骨根据其细胞形态学从浅到深可以分为5个层次，每层之间都是相互延续移行：①纤维层，位于髁突软骨的最表层，它平行于髁突软骨表面的胶原纤维，并且其之间也有纤维细胞分布于其中。②增殖层，位于纤维层下方，细胞在这一层中的排列相对来说比较紧密，并且细胞体积较小，呈梭形、核浆比例比较大、细胞外的基质较少。③成熟层，延续与上层的增殖层细胞，成熟层的细胞体积逐渐增大，呈现于卵圆形状，并且核浆比例比增殖层的大、层内的细胞排列没有规律。④肥大层，在这层中的细胞体积明显比之前的增大，形态也不规则，细胞排列没有明显的规律，细胞之外的软骨基质也比较均匀。⑤钙化软骨层，位于髁突软骨的最深层，也是紧挨骨小梁的部分，它也是髁突软骨细胞逐渐向骨细胞转化的主要区域。
颞下颌关节髁突软骨的前、中、后3个部位的厚度差别比较大，由前向后的厚度是逐渐变厚的。软骨细胞各个层次之间是相互延续的，成熟层细胞和肥大层细胞在从后向前的延续过程中，厚度是显著减少的。而纤维层细胞和增殖层细胞的厚度变化的比较少，基本保持不变。髁突软骨的下方为下颌骨的骨小梁结构，其与髁突软骨表面呈垂直关系排列，并且骨小梁与髁突软骨的钙化软骨层相互移行延续，再往下延伸即为下颌骨质。
实验组动物的髁突软骨取出来后，可见其表面略显粗糙不光滑，与正常软骨组织表面有明显的差别。与干预3 d的软骨厚度相比，从干预14 d开始，直至干预21 d时髁突中部和后部的软骨厚度明显增加(P < 0.01)，见表1，表现为纤维层细胞数量增加，胶原纤维排列紧密；增殖层增厚，细胞密度均一，胞浆可见透明变性；过渡层和肥大层增厚；钙化软骨层可见大量的软骨基质出现。实验组30 d时软骨层厚度明显变薄，各层细胞结构分界不清(图2)。软骨层下方有大量的原始骨小梁形成，并可见大量发育不全的骨髓腔。
2.4 下颌前导作用力下大鼠髁突软骨的超微结构变化干预后3 d，对照组中髁突软骨细胞呈现典型的透明软骨细胞特征(图3)，细胞呈卵圆形，表面有微绒毛突起，细胞浆内较多的粗面内质网，无明显扩张；糖原颗粒含量较少，细胞周围环绕胞周基质，其中含有较多的蛋白多糖颗粒以及细小纤维，与细胞外基质的纤维相连接。
与对照组相比，从干预后3 d开始，实验组髁突软骨细胞的超微结构发生明显改变：髁突软骨细胞体积变大，细胞内细胞核固缩；粗面内质网腔隙肿胀；脂滴变小甚至消失；核周微丝变少，不规则；细胞外基质增宽变多，出现大片空白区。

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引言

调查显示，安氏Ⅱ类错颌畸形是亚洲人群中最常见的错颌畸形之一^[1]。这一类错颌畸形主要是通过下颌前导型功能性矫治器进行治疗，固定性功能矫治器包括：Herbst，Forsus，Jasper-jumper等；活动性功能矫治器包括了激动器、生物调节期和Twin-block等^[2-3]。这种矫治器确实可以在短的时间内达到正畸的目的，但矫治的效果能否长期保持，髁突及其软骨能否改建以及如何改建及其机制，目前仍不明确。
颞下颌关节作为整个下颌骨的生长发育中心，一些学者讨论了显微结构和大体形态上的变化与下颌骨的功能变化之间的相互关系，提出了在人的一生中，下颌骨髁状突的关节面是可以因为其功能变化而发生改建的^[4]。下颌位置的变化与机械负荷的变化对髁状突软骨的适应性生长改建的影响成为了许多研究的热点问题。已有研究证实了对颞下颌关节压力的减小会促进髁状突的生长发育，相反，负荷的增加会抑制其生长^[5]。
已有实验通过给大鼠佩戴下颌前伸矫治器，会使咬合关系发生改变，继而影响了髁状突的生长，以及髁状突之下骨小梁的结构以及软骨的骨化过程^[6]。Isacsson等^[7]通过矫治器使恒河猴下颌前伸，发现了其髁状突后部以及后上部的软骨细胞明显增生。沈刚等^[8]也证明了，在下颌前伸作用下，大鼠髁突软骨是可以发生改建的。在颞下颌关节髁状突的生长过程中，软骨细胞基因表达的过程是分为两个阶段的，即成熟和矿化^[9]。下颌骨通过髁突软骨的骨化得以延伸，这个过程包括软骨基质中软骨细胞的分化、凋亡、降解，伴随血管侵入和松质骨形成，这是一个相对平衡稳定的过程，任何不稳定因素都会影响髁突软骨的正常发育^[10]。部分学者认为，下颌前导后不能直接引起髁突软骨细胞生长，而是通过颌面部肌肉的活动来改变肌肉作用力的大小和方向，以此来促进软硬组织的改建^[11-12]，但不能明显刺激下颌骨的生长^[13]，也有学者认为下颌前导矫治器可以帮助下颌提前达到其最大的生长量，但不会增加它总的生长量^[14]。而另一些学者的实验却表明下颌前导会引起髁突软骨以及颞下颌关节的改建，尤其会导致软骨内成骨^[15]。颞下颌关节的功能的改变与髁突软骨的局部受力情况的变化是密切相关的。之前的实验研究证实，下颌前伸可以引起SD大鼠颞下颌关节各个组织的生长改建，主要体现在了髁状突各组织的生长速度的加快，继而引起的下颌骨的生长。
实验旨在通过建立功能性下颌前导模型，观察髁突软骨的生长改建及其组织学和超微结构的变化，从而解释颞下颌关节和下颌骨的改建与颌骨生物力学的关系，为临床上功能性咬合前导矫治器的使用提供更好的实验依据和理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2014年3月至2015年2月在济南市中心医院实验室完成。
材料：
实验动物：同源性4周龄雄性SD大鼠，体质量100-150 g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2009-0017。饲养条件：室内自然光照，温度22-26 ℃，自然通风。

建立功能性下颌前导模型实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	厂商或来源
格鲁玛齿科酸蚀剂	Heraeus Kulzer Dental
齿科粘接剂，光固化复合树脂	可乐丽菲露
苏木精、伊红染液	上海楷阳生物技术有限公司
LECIA 2500E型切片机	Lecia
DPX-9082B电热恒温培养箱	上海富玛实验设备有限公司
HH-4恒温水浴锅	江苏省金坛市新航仪器厂
光学显微镜	Nikon
显微成像系统	Olympus
透射电子显微镜Bench-top TEM	Delong Instruments

实验方法：
分组及矫治装置的制备：将30只大鼠随机分成5个实验组(n=3)和5个对照组(n=3)，于安装矫治器后的3，7，14，21，30 d时分别麻醉处死3只实验组和3只对照组动物。所有动物在同一环境下，定时供给软食，自由饮水。适应性喂养5 d后，使用体积分数2.5%的戊巴比妥钠按照1 mL/kg的比例经腹腔注射，以此来全麻所有的生长期和成年期实验组大鼠。牵拉下颌使口张开以保证良好视角，用小毛刷清洗大鼠上颌牙齿，用无油气体干燥。酸蚀剂涂布于大鼠上颌牙齿的唇面，舌面和近远中面，40 s后冲洗干燥，使各个牙面呈现白垩色。小棉棒蘸取适量黏接剂涂布于大鼠上颌唇面，舌面和近远中面，光照20 s，重复1次涂布并光照黏接剂，使黏接剂涂布更加均匀完善。充填器取出适量光固化树脂置于舌侧面，保证厚度不大于2 mm，光照40 s，继续堆置直到使下颌产生向前3.5 mm，向下3 mm的前伸位移，并且斜面导板与上颌平面呈20°-25°角，保持装置完整，即使有轻微磨损也不失去前伸效果(图1)。对于大鼠的下颌前伸矫治器的配戴适应情况进行严密的监控，一旦发现了有损坏和脱落，以便于及时修理和安装，从而不至于影响下颌持续性前伸的矫治效果。

取材及标本的准备：每组动物按相应时间点于体积分数2.5%戊巴比妥钠过量麻醉下，沿髁突矢状面取材髁突软骨部分，置于40 g/L的多聚甲醛固定液中进行组织固定，放置于4 ℃的恒温冰箱中，由于后期的硬组织切片分析。并用流水缓慢冲洗24 h。然后进行标本的常规脱水、透明、过滤以及包埋，对包埋好的标本进行切片和苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察组织学变化。
组织学标本的制备、观察以及软骨厚度的测量：标本经固定后，0.5 mol/L的LEDTA脱钙，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，标本连续切片，苏木精-伊红染色，Olympus CX31光学显微镜观察，并应用Pixera PVC100C系统采图，电子测量尺分别对关节盘前带最厚、中带最薄、后带最厚处对应的髁状突软骨的厚度(μm)进行测量。
透射电镜标本的制备及观察：将取下来的标本于体积分数2.5%的戊二醛在4 ℃的环境中固定2 h，然后用缓冲液多次清洗，再用体积分数1%的锇酸与4 ℃的环境中固定 2 h。固定好的透射电镜标本切取1 mm半薄切片后进行苏木精-伊红染色进行超微定位，然后制成超薄切片，JEM- 100CX透射电镜观察髁突软骨细胞的超微结构。
主要观察指标：①光学显微镜下观察各组软骨各层的组织结构。②电子测量尺对各组髁突软骨厚度进行测量。③透射电镜观察各组软骨细胞超微结构。
统计学分析：应用SPSS 11.5软件进行数据分析，数值均符合正态分布，计量资料用x±s表示，两组间数据差异的比较采用t 检验法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

颞下颌关节是下颌骨重要的生长中心，年轻动物通过髁突软骨的骨化使下颌骨在多因素调解下相对稳定地延伸。在实验中选用了4周龄大鼠正处于生长发育高峰，这与临床Ⅱ类矫治最佳时机相吻合，这个时期髁突软骨基质的合成非常敏感，同时也能明显的表现在组织学超微结构上^[16]。有实验研究发现，成年期大鼠佩戴这种功能性矫治器后，髁突软骨组织的胶原合成会增加，新骨形成量也会增加，这表明了髁状突软骨会发生改建^[17]，但是其改建的程度不如生长期大鼠，表明髁状突的适应性改建与年龄存在一定的关系。
髁突软骨覆盖于髁状突关节的表面，它与关节盘直接相接触，软骨的改建情况可以直接反应外界作用力对髁突的影响。光学显微镜下的髁突软骨呈现出了层域化，附着在它表面的比较小而且密集的增殖层细胞是具有多向分化能力的，高核质的比例反映了此区域的增殖层细胞具有较高的有丝分裂的潜力[18]，同时它也是是髁状突软骨的生长和改建中心，并且在髁突软骨的生长和改建中起到了很重要的作用^[19]，此层增殖层细胞对外界的各种作用力比较敏感，当受到生理范围之内的应力时，可以使髁突软骨保持活跃的状态，促进其生长改建；当受到超出生理范围的应力时会引起关节软骨吸收变薄，甚至会发生病理性的改变^[20]。当外界的刺激作用在髁突软骨上时，增殖层细胞会分化成为最终成熟的软骨细胞。研究证实增殖层之下即为成熟层细胞，与其他骺端软骨不同的是，此层成熟层细胞的排列是不整齐的^[21-22]，它会不断的向细胞外分泌细胞基质，并在这个过程逐渐分化成为肥大层的软骨细胞，此层细胞的基质中含有较高密度的胶原纤维，并与其下方的骨样基质延续，在邻接处发生活跃的成骨活动，软骨细胞也会发生钙化，并转化成为骨组织。这个反应最终会导致髁状突前部的膨胀性生长，这也是髁状突形态的成因^[23]。与此同时，软骨陷窝的深度会增加，伴随着软骨细胞产生退变且呈现出固缩状^[24]。因此，髁突组织才会不断的生长，并且在成年之后依然会保持一定的生长改建能力。
实验中对照组髁突软骨的5个细胞层次清晰，相互移行。而实验组中，髁突各层的变化与以往的有关髁突生长发育的研究基本一致^[25]。关于髁状突软骨细胞的对数生长期以及平台期会有一些不同的实验结果，但是潜伏期一般都是3 d^[26]。毛勇等^[27]研究发现，在异常的负荷作用下，髁状突软骨细胞中蛋白多糖的合成减少，并且其构成会发生变化，从而使髁状突纤维软骨的黏弹性降低。杨红梅等^[28]通过流式细胞术检测了在不同时间段、不同的压力对体外培养的髁突软骨细胞的增殖活性有影响。也有学者研究，在功能性下颌前伸后，髁突软骨细胞中妆花生长因子β1的表达增加，提示了机械刺激会促进骨的生长发育^[29]。随着佩戴矫治器的时间推移，软骨厚度依次增厚，中后部较明显，尤其是肥大层和钙化层，直至21 d时达到最厚，提示下颌前导可能促进了髁突软骨内骨化和下颌的生长，这与赵志河等的研究结果类似^[21]。从髁状突前、中、后部的软骨厚度变化来说，下颌前伸增加了后部的新骨形成，而同时前部的新骨形成受到了抑制[31]。另外软骨下大量的原始骨小梁形成，可见大量发育不全的骨髓腔，表明了髁突软骨处于生长阶段的末期，进入了软骨内成骨阶段，这也验证了以往的研究结果^[31-32]。
谷志远等^[33]研究表明增殖层细胞是具有前软骨干细胞的特征的，而这一层的细胞中PCNA是强阳性表达，也是整个关节中表达最强的部位，说明了这层细胞有比较明显的增殖活性^[34]。实验结果显示，髁突软骨的改建不仅体现在增殖层厚度的增加，透射电镜下的改变也十分显著。透射电镜结果中显示，在实验观察周期中，细胞体积会随着矫治时间的延长逐渐增大，胞质丰富，细胞核先是增大而后发生固缩，细胞电子密度增高，有大量的粗面内质网腔隙肿胀，这些反映了髁突软骨细胞增殖分裂活跃且生长旺盛。这与大部分学者通过实验研究结果是一致的，即经过一定时间下颌前导后，髁突和下颌骨会出现明显的生长改建^[35]。
本次实验结果与以往研究基本一致，但仍有部分因素存在一定的差异。已有研究证实了不同作用方式和作用时间下差异性调节了髁突软骨细胞的改建^[36]。李松等也已研究证实了在不同静压力作用下，髁突软骨细胞的增殖与凋亡是会受到影响的^[37]，但这种非显线性关系仍需要进一步实验来表明。研究证明，人类骨负荷的生理应变力小于 2 000微应变[38]，但是只有承受大于2 500微应变时，才能有效刺激骨的形成^[39]。
总之，实验已证实在下颌前导的作用力下，生长期大鼠的髁突软骨会发生明显的形态组织学改建，即髁突软骨软骨厚度以及细胞增殖能力的变化。至于髁突软骨细胞是在怎样的机制下改建的，以及不同的压应力和承受作用力时间是如何影响软骨细胞的增殖与凋亡的，仍有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

下颌持续前导作用下髁状突软骨改建的超微结构变化

Ultrastructural changes of reconstructed mandibular condylar cartilage under continuous mandibular advancement

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