分层多功能层层自组装肝素表面修饰技术

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：涂层技术可以在不改变基材的前提下改善材料的表面性质，提高血液相容性，从而减少人工植入装置植入后的不良反应。
目的：观察分层多功能层层自组装肝素涂层的血液相容性及抗凝特性。
方法：利用层层自组装技术组装出有底层和表层两个功能层的多层自组装涂层，表层为多层肝素/Fe ³⁺层层自组装涂层，底层为壳聚糖层，通过共价键固定在钛金属表面，共5层肝素。以组装相同层数的肝素/壳聚糖层层自组装涂层作为多层对照组；单层对照组为肝素和壳聚糖共混溶液的单层涂层；空白对照组为裸钛片。
结果与结论：血液相容性测试结果显示，实验制备的多层自组装涂层溶血率低于多层对照组；甲苯胺蓝法测定结果显示实验制备的多层自组装涂层的肝素总量及4，24，48 h的肝素溶解释放量均明显高于多层对照组和单纯对照组；同时动态凝血实验显示实验制备的多层自组装涂层抗凝性能最好。可见分层多功能层层自组装肝素涂层具有良好的血液相容性和抗凝血性能。

关键词: 生物材料, 材料力学及表面改性, 层层自组装, 肝素, 壳聚糖, 涂层, 血液相容性, 抗凝血性, 移植物, 不良反应

Abstract:

BACKGROUND: Surface coating can improve material surface properties and hemocompatibility without changing the original material, and thus reduce complications resulting from implantable devices.
OBJECTIVE: To observe the hemocompatibility and anticoagulation properties of layer-by-layer self-assembly multifunctional heparin coating.
METHODS: Layer-by-layer self-assembly was used to form the self-assembled multilayer coating with two function layers on the surface and the bottom. Surface coating was heparin/Fe ³⁺ multi-layer self-assembly coating and the bottom coating was chitosan, both of which were fastened to the surface of titanium using a covalent bond. There were five layers of heparin. The heparin/chitosan layer-by-layer self-assembly coating with the same number of layers was considered as the multi-layer control group, and the single layer coating of heparin and chitosan blending solution was considered as the single-layer control group; the bare titanium pieces were regarded as the blank control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Examination of hemocompatibility showed that the hemolysis rate of the self-assembled multilayer coating was lower than that of the multi-layer control group; toluidine blue staining showed that the total amount of heparin and the heparin dissolved and released amount at 4, 24 and 48 hours of the self-assembled multilayer coating were significantly higher than those of multi-layer control group and single- layer control group; dynamic clotting experimental results showed the self-assembled multilayer coating had the best anticoagulation properties. The results indicate that layer-by-layer self-assembly multifunctional heparin coating has the excellent hemocompatibility and coagulation properties.

Key words: biomaterials, material mechanics and surface modification, layer-by-layer self-assembly, heparin, chitosan, coating, hemocompatibility, anticoagulation property, graft, adverse reaction

中图分类号:

:R318

魏嵬，李国荣. 分层多功能层层自组装肝素表面修饰技术[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(16): 2973-2980.

Wei Wei, Li Guo-rong. Layer-by-layer self-assembly multifunctional heparin surface modification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(16): 2973-2980.

图/表（结果） 6

2.1 层层自组装技术组装的肝素涂层的溶血率见图4。 结果显示，所有组涂层的溶血率均小于5%的国家标准。溶血率越低血液相容性越好，实验组溶血率为0.87%，小于裸钛片空白对照组的1.45%，证明实验组涂层血液相容性优于裸钛片。同时，实验组涂层溶血率0.87%也小于多层对照组涂层的1.38%，说明相同层数的涂层，实验组的分层涂层在血液相容性方面优于多层对照组。单层对照组的溶血率最低，且远远小于空白对照组，说明壳聚糖和肝素有明显改善材料血液相容性的作用。

2.2 层层自组装技术组装的肝素涂层的表面肝素总量 肝素总量测定的标准曲线见图5。实验重复3次，测得不同浓度梯度的肝素含量对应的吸光度值的平均值，应用SPSS 17.0软件得到回归方程，计算各组涂层的肝素总含量分别为实验组 7.94 μg/cm²，多层对照组5.51 μg/cm²，单层对照组 1.97 μg/cm²。对于同样层数的涂层，实验组有更多的肝素，是作为自组装的阳离子壳聚糖和Fe ³⁺在组装时导致的不同。壳聚糖分子量较大，分子体积较大，在与肝素组装时会受到空间构象的影响；而Fe ³⁺分子量小，受到空间构象的限制较小。所以，Fe ³⁺和肝素的组装使肝素携带量增大，优于传统的肝素/壳聚糖自组装涂层。

2.3 层层自组装技术组装的肝素涂层中肝素的溶解释放量 反复测试不同肝素浓度对应的吸光度值，取平均值绘制标准曲线，应用SPSS 17.0软件得到回归方程，并计算各组样本的肝素释放量。绘制肝素释放量标准曲线见图6。

测试各组不同时间段肝素释放量结果见表1。

肝素释放量除以各自样本的肝素总量，绘制肝素释放百分比，见图7。可以看出，实验组的肝素释放量和释放百分比均大于对照组，说明Fe ³⁺和肝素的组装使得肝素更易释放，且释放量更大。实验组的释放百分比曲线在24 h有一个释放峰值，所以如果控制肝素/Fe3+的表层自组装层数及组装时间，可以间接控制肝素释放量和释放速度，达到根据药物控释的作用。同时可以看到，单层对照组的释放百分百很低，说明使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷化学接枝的方法涂层稳定性较好，不易溶解释放，这也是选择化学接枝方法制作实验组底层的目的，即延长底层的作用时间。

2.4 层层自组装技术组装的肝素涂层的体外动态凝血情况 动态凝血时间是测试每个时间点每种材料的凝血程度，实验测试了各组涂层在10，20，30，40，50 min时的动态凝血情况，见图8。由图可以看出在每个时间点的凝血程度均为：裸钛片空白对照组>单层对照组>多层对照组>实验组。同时，将每个时间点连接成线，可见实验组凝血程度在前 40 min变化较小，曲线下降较缓慢；但是裸钛片空白对照组在前30 min凝血程度急剧变化，曲线急速下滑；多层对照组和单层对照组介于其中。单层对照组由于涂层数量少，肝素含量也少，故抗凝血性能略优于空白对照组，并与空白对照组保持较一致的下降曲线。实验组的肝素含量在各组中最多，同时释放量较大，故抗凝血性能最好。多层对照组肝素含量和释放量介于实验组和单层对照组之间，曲线也居于其中。

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引言

随着科学技术的发展，可植入的人工装置逐渐增多，其中与血液接触的装置如：支架、人工瓣膜、人工血管、心室辅助装置等，都面临着出血、感染、血栓形成等问题；尤其是心室辅助装置，与血液接触面积大，构造复杂，在血液相容性上面临着极大的挑战，长期应用受到很大的制约^[1] 。有学者对植入心室辅助装置后死亡的主要原因进行分析，发现感染占29.5%，多器官衰竭占12.8%，脑栓塞占9%，呼吸系统衰竭占4.5%，出血占3.2%^[2-3] 。可见，心室辅助装置作为移植入人体较大体积的移植物，在植入体内的初期向体内引入了大量异物，扰乱患者移植前就很脆弱的生理稳态，从而极容易引起感染，血液与异物的接触使多种血液成分激活，在移植初期生理储备的耗竭及瀑布式病理过程的逐级放大，都会导致患者死亡^[4-5] 。因此，提高人工装置的血液相容性，降低植入初期的不良反应，使长期应用的并发症减少，为目前研究的重点^[6-7] 。表面修饰技术，即涂层技术在不改变钛合金原有强度和可塑性等特性的基础上，提高钛合金的血液相容性^[8-9] 。层层自组装技术是一种简易、多功能的表面涂层方法，其利用带电基板在带相反电荷中的交替沉积制备聚电解质自组装多层膜^[10] 。层层自组装技术的优势是在保留药物活性的前提下，提高涂层载药量^[11] 。Ye等^[12-13]利用层层自组装技术将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱涂层制作成多层涂层，解决了单层2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱涂层易降解的问题，延长了2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱涂层的使用寿命。同时该技术利用溶质静电吸附的方法，通过限制溶质浓度和浸泡时间等条件，可以达到控制药物释放量的目的。Choi等^[14]将药物加于自组装的涂层中，随着涂层降解逐渐释放药物，从而达到药物控释的作用。肝素作为一种抗凝剂主要通过增强抗凝血酶的活性而发挥作用，利用层层自组装技术可以保留肝素活性，增大其载药量^[15] ，同时加入层层自组装的功能大分子还能发挥抗炎、细胞固定增殖，及促进内皮化等作用。Li等^[16]报道了肝素/连接蛋白的涂层，并认为肝素能够与功能大分子相互作用，促进内皮细胞的定植，增强连接蛋白的作用。
壳聚糖是一种天然多糖类纤维素，主要从贝壳中提取，因其有抗炎、促进细胞增殖等作用而被广泛研究^[17] 。Meng等^[18]使用肝素/壳聚糖做层层自组装涂层，在支架的研究中，证明该涂层能够抗凝，同时促进血管内皮化。与此同时，有实验表明肝素和壳聚糖亦可相互增强对方的作用，拥有两者的涂层效果明显优于单一涂层^[19] 。实验设想利用层层自组装技术，组装出有底层和表层两个功能层的多层自组装涂层：表层为多层肝素/Fe ³⁺层层自组装涂层；底层为壳聚糖层，通过共价键固定在钛金属表面，能够随着肝素的逐渐释放开始发挥抗炎及内皮化的作用；表层和底层亦通过静电吸附作用连接，见图1。同时，实验采用对照研究的方法，比较制作出的新型分层多功能层层自组装肝素涂层与传统自组装肝素涂层的血液相容性，涂层肝素含量和释放量的差异。

材料方法

设计：多样本对照观察实验。
时间和地点：于2011年10月至2012年10月在阜外医院国家心血管重点实验室完成。
材料：
应用层层自组装技术组装肝素涂层所用主要试剂：
Main reagents:

溶液配制：
γ-氨丙基三乙氧基硅烷无水乙醇溶液：体积分数2% γ-氨丙基三乙氧基硅烷溶于无水乙醇。
壳聚糖溶液：5 g/L壳聚糖溶于体积分数1%乙酸水溶液。
肝素溶液：1 g/L的肝素PBS溶液。
Fe 3⁺溶液：新配8.5 g/L FeCl3•6H^₂O。
0.005%甲苯胺蓝溶液：0.005%甲苯胺蓝，0.01 mol/L HCl，体积分数0.2% NaCl。
0.04%甲苯胺蓝溶液：0.04%甲苯胺蓝，0.01 mol/L HCl，体积分数0.2% NaCl。
4/1混合液：体积比4∶1的无水乙醇和0.1 mol/L的NaOH的混合液。
实验方法：
钛表面肝素层层自组装多层涂层的制备：见图2。

钛片的预处理：根据文献[20]方法处理钛片，将钛片制作为1 cm×1 cm大小，机械抛光，依次浸入丙酮、乙醇、去离子水中超声清洗5 min，重复2次，50 ℃烘干备用。浸入5 mol/L NaOH溶液中80 ℃保温24 h，去离子水彻底清洗后烘干，形成钛片表面羟基基团。
钛片表面活性氨基的形成：加入2 mL γ-氨丙基三乙氧基硅烷无水乙醇溶液，室温10 h后，将钛片浸入无水乙醇中超声清洗5 min，烘干，形成可供接枝的活性氨基^[21] 。
钛片表面涂层的制备：实验组为制作的新型分层多功能层层自组装肝素涂层；将处理的钛片浸入壳聚糖溶液中10 min后，依次浸入肝素溶液和Fe3+溶液每次 10 min，重复4组，最后再浸入肝素溶液10 min，以肝素作为涂层最表层。多层对照组为组装相同层数的肝素/壳聚糖层层自组装涂层；将钛片依次浸入壳聚糖溶液和肝素溶液每次10 min，重复5组。单层对照组为肝素和壳聚糖共混溶液的单层涂层；将钛片浸入肝素和壳聚糖1∶1共混溶液30 min。空白对照组为裸钛片。上述各组钛片去离子水清洗2遍后烘干，见图3。

涂层的血液相容性测试：将待测样品加入10 mL生理盐水37 ℃保温24 h后，加入抗凝血0.1 mL，37 ℃保温60 min，1 000 r/min离心5 min，540 nm处测吸光度值(A)。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用蒸馏水，其余步骤相同。

溶血率(%)=(A_x- A_阴性)/(A_阴性-A_阳性)×100%

公式中X指样品，Ax是指测得的样品吸光度值。
材料表面肝素总量的测定：使用甲苯胺蓝法测定肝素，其在一定范围内，吸光度与浓度呈线性关系，即符合郎伯-比耳定律^[22] 。该方法利用材料表面的肝素会和甲苯胺蓝结合形成不溶于水的络合物，但溶于有机溶剂，通过溶解洗脱并测量肝素/甲苯胺蓝络合物的吸光度值，从而测定肝素的含量。待测样品加入2 mL 0.04%甲苯胺蓝溶液中，温和振荡4 h后去离子水清洗2遍，加入4/1混合液充分溶解材料表面络合物，测混合液于530 nm处吸光度值。
将肝素配制成不同浓度的溶液，取已知浓度的肝素溶液加入同体积0.04%甲苯胺蓝溶液，温和振荡4 h后形成不溶于水的肝素/甲苯胺蓝沉淀，3 500 r/min离心 10 min，清洗沉淀2遍后，加入4/1混合液溶解沉淀，测530 nm处吸光度值。绘制不同肝素浓度对应的吸光度值，制作肝素总量标准曲线。
涂层中肝素的溶解释放量测定：将待测材料浸入PBS中，静置4，24，48 h，取出钛片，浸出液加入质量浓度0.005%甲苯胺蓝溶液37 ℃水浴2 h，加入正己烷充分振荡，读取水层630 nm处吸光度值。
将肝素配置成不同浓度的溶液，取已知浓度的肝素溶液加入同体积0.005%甲苯胺蓝溶液，37 ℃水浴2 h，加入正己烷充分振荡，读取水层630 nm处吸光度值，制作肝素释放量标准曲线。
体外动态凝血实验：取新鲜未抗凝全血50 μL加于待测材料表面，静置10，20，30，40，50 min后，加入12 mL蒸馏水终止凝血反应，未凝血红细胞溶血后释放血红蛋白，5 min后取出材料，检测浸出液540 nm处吸光度值，各组样本各时间点重复2次，取平均值。
主要观察指标：各组涂层材料的血液相容性、肝素的溶解释放量及体外动态凝血情况。
统计学分析：测试结果均用平均数表示，应用SPSS 17.0软件得到回归方程，计算各组涂层的肝素总含量和肝素释放量。

讨论

层层自组装技术不受基材形状的影响，能够适用于多种人工植入装置的表面修饰，即使是心室辅助装置这种表面复杂的机械结构。心室辅助装置作为一种植入装置需要长期抗凝，而该装置的植入通常需要开胸手术从而造成较大的手术创伤，由此产生了术后出血和抗凝的矛盾^[23] 。使用肝素作为涂层的主要成分，涂覆在心室辅助装置表面可以减少凝血风险，以局部抗凝从而减少全身抗凝剂的使用，同时减少出血风险^[24-25] 。

新型分层多功能层层自组装肝素涂层的表层为肝素/Fe ³⁺自组装层，肝素含量高于传统涂层。其原理是利用Fe ³⁺这种小阳离子的空间效应，使其与肝素的涂层较壳聚糖这种大分子能够聚合更多的肝素，同时Fe ³⁺极易溶解，使肝素连续释放，较少中断，因此体现出较好的抗凝性能^[26] 。实验中使用5层层层自组装的肝素作为抗凝成分，检测肝素的释放，显示在24 h时有肝素释放的峰值，并且有较为稳定的释放百分比，因此可以通过控制肝素层数和浸泡时间等条件，达到调控肝素释放的目的。而底层的壳聚糖在表层的肝素不断释放的同时暴露出来，并逐渐发挥其抗炎和内皮化的作用，并且在理论上逐渐释放出来的肝素和底层的壳聚糖可以相互作用，增强抗凝和抗炎的效果^[27] ，但是如何通过控制肝素的释放来配合底层壳聚糖作用的发挥，目前仍然存在监测上的局限性。

实验设计出的新型分层涂层是利用作用时间范围不同的两种涂层成分：肝素和壳聚糖，形成两个功能层，在不同时间段发挥作用。借助各自的作用特点：肝素抗凝性能强，作用时效短；壳聚糖有较长时间的抗炎和内皮化作用^[28] 。使用层层自组装技术，将两个功能层组装在一起，形成新型涂层，实验也证明该新型涂层各层的特点更明确。目前层层自组装技术大多是利用有特殊功能的大分子蛋白，如连接蛋白、胶原等^[29] ，从而增加涂层的功能。实验直接利用不同功能的材料制作出不同功能的层，组装形成多功能涂层。但是由此也产生了一个问题，单层涂层的功能检测较为容易，但是多层涂层的作用，特别是不同功能层之间的相互作用，目前缺乏能够长期稳定监测的方法，所以只能根据单层涂层的功能来选择不同的功能层，这也是实验的局限之处。

从实验结果可以看出，新型分层多功能层层自组装肝素涂层的肝素含量为7.94 μg/cm²，大于对照组的 5.51 μg/cm²和1.97 μg/cm²，与传统涂层比较，增加了肝素含量。Chuang等^[30]报道材料表面肝素含量超过 2.6 μg/cm²时可以明显抑制血小板黏附，新型涂层的肝素含量明显高于此标准。同时实验组的肝素释放量和动态凝血时间也均优于对照组，说明表层的肝素层可以在短期内较明显提高抗凝性能，提高钛表面血液相容性。表层的肝素层的释放有一个24 h的峰值，这对体内植入后的初期抗凝，以及对底层的长期抗凝涂层短期内抗凝不足的特点，在作用时间上有一定弥补作用。实验中肝素/Fe ³⁺涂层为5层肝素，如果改变肝素的组装层数量，可以在一定范围内控制肝素的释放，使其在双层涂层最佳的相互作用区间，以达到短期抗凝和长期抗凝兼顾的目的。