富白细胞-血小板血浆凝胶释放的炎性生长因子

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.019

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (16): 2981-2988.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.019

• 细胞外基质材料 extracellular matrix materials • 上一篇下一篇

富白细胞-血小板血浆凝胶释放的炎性生长因子

温天杨¹，王爱红²，许樟荣²

1 北京大学解放军306医院教学医院内分泌科，北京市 100101
2 解放军306医院内分泌科、全军糖尿病诊治中心，北京市 100101

收稿日期:2013-02-04 修回日期:2013-03-26 出版日期:2013-04-16 发布日期:2013-04-16
通讯作者: 许樟荣，硕士，主任医师。解放军306医院内分泌科、全军糖尿病诊治中心，北京市 100101 xzr1021@vip.sina.com
作者简介:温天杨★，女，1986年生，山东省烟台市人，汉族，北京大学医学部在读硕士，主要从事糖尿病及其并发症的防治。 pekingkw@163.com
基金资助:
2010年度军队临床高新技术重大项目(编号：2010gxjs054)。

Inflammatory factor release from leukocyte- and platelet-rich plasma gel

Wen Tian-yang¹, Wang Ai-hong², Xu Zhang-rong²

1 Department of Endocrinology, the 306th Teaching Hospital of PLA, Peking University, Beijing 100101, China
2 Department of Endocrinology, Diabetes Center, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

Received:2013-02-04 Revised:2013-03-26 Online:2013-04-16 Published:2013-04-16
Contact: Xu Zhang-rong, Master, Chief physician, Department of Endocrinology, Diabetes Center, the 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China xzr1021@vip.sina.com
About author:Wen Tian-yang★, Studying for master’s degree, Department of Endocrinology, the 306th Teaching Hospital of PLA, Peking University, Beijing 100101, China pekingkw@163.com
Supported by:
the Military Clinical High and New Technology in 2010, No. 2010gxjs054*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前对富白细胞-血小板血浆凝胶的研究主要集中在生长因子的释放及其促进组织和创面生长的作用机制方面。
目的：通过测定富白细胞-血小板血浆凝胶中释放的白细胞介素1，4，6和血小板源性生长因子BB、转化生长因子β、血管内皮生长因子的水平，观察富白细胞-血小板血浆凝胶超微结构，对其抗菌作用和促进溃疡愈合的作用机制进行进一步探讨。
方法：取健康志愿者空腹静脉血离心、分离得到富白细胞-血小板血浆，再以10∶1 的比例加入激活剂后混匀得富白细胞-血小板血浆凝胶。将凝胶保存在DMEM培养基中，分别于培养1，3，7，14，21 d后收集含有渗出液的培养基进行实验。
结果与结论：酶联免疫吸附法检测结果显示，健康志愿者富白细胞-血小板血浆凝胶中各类白细胞所占比例与全血有所不同，淋巴细胞所占比例最大。白细胞介素1在培养0-1 d达到峰值(P < 0.05)，之后逐渐下降。白细胞介素4各时间段释放量无差异。白细胞介素6的释放量在培养0-1 d，2-3 d和4-7 d保持较高水平，培养8-14 d和15-21 d释放量明显下降(P < 0.05)。血小板源性生长因子BB和转化生长因子β在培养1 d释放量最大(P < 0.05)，之后迅速下降。血管内皮生长因子表现为培养7 d逐渐上升，培养8-21 d缓慢下降。扫描电镜观察可见，凝胶中绝大部分白细胞为淋巴细胞。结果证实，富白细胞-血小板血浆凝胶的促进创面愈合的机制除与血小板源性生长因子BB、转化生长因子β、血管内皮生长因子的释放有关外，可能与富集更多的淋巴细胞及白细胞介素1，4，6的释放有关。

关键词: 生物材料, 细胞外基质材料, 富白细胞-血小板血浆, 凝胶, 白细胞, 炎性因子, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Current studies about leukocyte- and platelet-rich plasma gel mainly focus on growth factor release and the mechanism underlying promoting tissue growth and wound healing.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of leukocyte- and platelet-rich plasma gel by measuring the levels of interleukin-1, interleukin-4, interleukin-6, platelet-derived growth factor-BB, transforming growth factor-β1, and vascular endothelial growth factor released from leukocyte- and platelet-rich plasma gel and observing the ultrastructure of leukocyte- and platelet-rich plasma gel.
METHODS: Blood samples were collected from 12 healthy volunteers. Leukocyte- and platelet-rich plasma was produced by two-step centrifugation, and leukocyte- and platelet-rich plasma gel was obtained by combining the leukocyte- and platelet-rich plasma with thrombin and calcium gluconate (10:1). The leukocyte- and platelet-rich plasma gel was preserved in Dulbecco’s modified Eagle’s medium, and the Dulbecco’s modified Eagle’s medium including exudates of leukocyte- and platelet-rich plasma gel was collected at days 1, 3, 7, 14, 21.
RESULTS AND CONCLUSION: Enzyme linked immunoabsorbent assay showed that the leukocyte formula in the leukocyte- and platelet-rich plasma gel was different from that in the whole blood, and lymphocytes shared the largest proportion. Interleukin-1 level peaked at 0-1 day of culture (P < 0.05), and then gradually decreased. Interleukin-4 level showed no changes at different periods. Interleukin-6 maintained a higher release at 0-1, 2-3, and 4-7 days, but dramatically reduced at 8-14 and 15-21 days of culture (P < 0.05). The release amount of platelet-derived growth factor-BB, transforming growth factor-β1 reached the peak at 1 day of culture (P < 0.05), and then exhibited a raped decline. The release amount of vascular endothelial growth factor gradually increased at 7 days of culture, and then gradually declined at 8-21 days of culture. Under the scanning electron microscope, vast majority of leukocytes in the leukocyte- and platelet-rich plasma gel were confirmed as lymphocytes. Results showed that besides the expression of growth factors such as platelet-derived growth factor-BB, transforming growth factor-β1, and vascular endothelial growth factor, the concentrations and components change of lymphocytes and expression of inflammatory factors such as interleukin-1, interleukin-4, and interleukin-6 might be one of the mechanisms by which leukocyte- and platelet-rich plasma gel can promote wound healing.

Key words: biomaterials, extracellular matrix materials, leukocyte-and platelet-rich plasma, gel, leukocytes, inflammatory factors, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

温天杨，王爱红，许樟荣. 富白细胞-血小板血浆凝胶释放的炎性生长因子[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(16): 2981-2988.

Wen Tian-yang, Wang Ai-hong, Xu Zhang-rong. Inflammatory factor release from leukocyte- and platelet-rich plasma gel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(16): 2981-2988.

图/表（结果） 4

2.1 健康志愿者数量分析 共纳入对象12例，无中途退出者，最终均进入结果分析。

2.2 健康志愿者富白细胞-血小板血浆凝胶中血小板计数结果 12 例志愿者全血样本的血小板计数为(190.00±41.91)×10⁹ L^-1，富白细胞-血小板血浆凝胶的血小板计数为(812.96±334.53)×109/L^-1，两者比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。富白细胞-血小板血浆凝胶血小板浓缩倍数为(4.28±1.51)倍，富白细胞-血小板血浆凝胶血小板回收率为(62.43±19.87)%。

2.3 健康志愿者富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞计数及分类 12 例全血样本的白细胞总数为(5.42±1.43)×10⁹ L^-1，富白细胞血小板血浆凝胶的白细胞总数为(10.48±3.12)×10⁹ L^-1，两者比较差异有显著性意义(P < 0.01)。富白细胞-血小板血浆凝胶白细胞浓缩倍数为(1.93±0.63)倍，富白细胞-血小板血浆凝胶白细胞回收率为(28.92±7.83)%。富白细胞-血小板血浆凝胶中淋巴细胞所占比例最大，达到(61.18±12.87)%，与全血相比，健康志愿者富白细胞-血小板血浆凝胶中的嗜中性粒细胞百分比下降明显(P < 0.01)，淋巴细胞 (P < 0.01)和单核细胞(P < 0.05)的百分比明显上升。见表1。

2.4 健康志愿者富白细胞-血小板血浆凝胶的超微结构 扫描电镜下观察可见，富白细胞-血小板血浆凝胶中除了纤维蛋白形成的粗细不等的网状结构外，细胞成分以红细胞为主，同时散在有单个或多个血小板和白细胞，偶可见白细胞聚集区和血小板聚集区，其中大部分白细胞为淋巴细胞。见图1。

2.5 富白细胞-血小板血浆凝胶生长因子的释放量变化 富白细胞-血小板血浆凝胶的血小板源性生长因子与转化生长因子β1释放量相似，在培养0-1 d释放量最大，与其他时间段相比差异有显著性意义(P < 0.05)，随后迅速下降，维持在较低水平。血管内皮生长因子表现为先逐渐上升，后缓慢下降，在培养4-7 d时达到峰值，但各时间段释放量比较，只有培养15-21 d与其他时间段差异有显著性意义(P < 0.05)。见图2。

2.6 富白细胞-血小板血浆凝胶各时间段炎性因子的释放量 白细胞介素1释放量在0-1 d即达到峰值(P < 0.05)，之后逐渐下降。白细胞介素6的释放量在培养0- 7 d均保持较高水平，培养8-21 d释放量明显下降，与培养0-7 d比较差异有显著性意义(P < 0.05)。白细胞介素1于培养0-1 d达到峰值(P < 0.05)，之后逐渐下降；白细胞介素4各时间段释放量差异无显著性意义；白细胞介素6在培养0-7 d大量释放，随后明显下降(P < 0.05)。见图3。

参考文献

[1]Uggeri J. Dose-dependent effects of platelet gel releasate on activities of human osteoblasts. Periodontol. 2007;78(10): 1985-1991.

[2]Lindeboom JA. Influence of the application of platelet-enriched plasma in oral mucosal wound healing. Clin Oral Implants Res. 2007;18(1):133-139.

[3]Rozman P, Bolta Z. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. 2007;16(4):156-165.

[4]Thor A. Early bone formation in human bone grafts treated with platelet-rich plasma: preliminary histomorphometric results. Oral Maxillofac Surg. 2007;36(12):1164-1171.

[5]Everts PA. Autologous platelet gel and fibrin sealant enhance the efficacy of total knee arthroplasty: improved range of motion, decreased length of stay and a reduced incidence of arthrofibrosis. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2007; 15(7):888-894.

[6]Gardner MJ, Demetrakopoulos D, Klepchick PR, et al. The efficacy of autologous platelet gel in pain control and blood loss in total knee arthroplasty. An analysis of the haemoglobin, narcotic requirement and range of motion. Int Orthop. 2007; 31(3):309-313.

[7]Yuan NB, Long Y, Zhang XX, et al. Sichuan Daxue Xuebao: Yixueban. 2009;40(2):292-294.袁南兵,龙洋,张祥迅,等.自体富血小板凝胶治疗糖尿病难治性皮肤溃疡作用机制的初步探讨[J].四川大学学报:医学版, 2009, 40(2):292-294.

[8]Eppley BL, Woodell JE, Higgins J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plast Reconstr Surg. 2004;114(6): 1502-1508.

[9]Yuan NB, Wang C, Wang Y, et al. Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi. 2008;22(4):468-471.袁南兵,王椿,王艳,等.自体富血小板凝胶的制备及其生长因子分析[J].中国修复重建外科杂志,2008,22(4):468-471.

[10]Bielecki TM, Gazdzik TS, Arendt J, et al. Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances: an in vitro study. J Bone Joint Surg Br. 2007; 89(3):417-420.

[11]Moojen DJ, Everts PA, Schure RM, et al. Antimicrobial activity of platelet-leukocyte gel against Staphylococcus aureus. J Orthop Res. 2008;26(3):404-410.

[12]National People's Congress of the People's Republic of China. Blood Donation Law of the People's Republic of China.1997.

[13]State Council of the People's Republic of China. Administrative Regulations on Medical Institution. 1994-09-01.

[14]Sonnleitner D, Huemer P, Sullivan DY. A simplified technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentrate for intraoral bone grafting techniques: a technical note. Int J Oral Maxillofac Implants. 2000;15(6):879-882.

[15]Weibrich G. Comparison of platelet, leukocyte, and growth factor levels in point-of-care platelet-enriched plasma, prepared using a modified Curasan kit, with preparations received from a local blood bank. Clin Oral Implants Res. 2003;14(3):357-362.

[16]Mazzucco L. Platelet-rich plasma and platelet gel preparation using Plateltex. Vox Sang. 2008;94(3):202-208.

[17]Conaway JE. New trends in analytical technology and methods for pesticide residue analysis. J Assoc Off Anal Chem. 1991;74(5):715-717.

[18]Wei D, Huang ZH, Zhao YP, et al. Anhui Nongye Kexue. 2009,37(6):2357-2358.魏东,黄智鸿,赵月平,等.浅析ELISA的基本原理与注意事项[J].安徽农业科学,2009,37(6):2357-2358.

[19]Ehrenfest D M D, Del Corso M, Diss A, et al. Three-dimensional architecture and cell composition of a Choukroun's platelet-rich fibrin clot and membrane. J Periodontol. 2010;81(4):546-555.

[20]Ma J, Li F, Ren DJ, et al. Zhongguo Kangfu Lilun yu Shijian. 2011;17(3):223-225.马健,李放,任大江,等.富含血小板血浆凝胶的超微结构[J].中国康复理论与实践,2011,17(3):223-225.

[21]He L, Lin Y, Hu X, et al. A comparative study of platelet-rich fibrin (PRF) and platelet-rich plasma (PRP) on the effect of proliferation and differentiation of rat osteoblasts in vitro. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009;108(5): 707-713.

[22]Lee TH, Seng S, Li H, et al. Integrin regulation by vascular endothelial growth factor in human brain microvascular endothelial cells: role of alpha6beta1 integrin in angiogenesis. J Biol Chem. 2006;281(52):40450-40460.

[23]Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 2001;280(6):C1358-1366.

[24]Tiong A, Freedman SB. Gene therapy for cardiovascular disease: the potential of VEGF. Curr Opin Mol Ther. 2004; 6(2):151-159.

[25]Zou ZZ, Li JC. Beijing: People's Medical Publishing House. 2008. 邹仲之,李继承.组织学与胚胎学[M].北京:人民卫生出版社, 2008.

[26]Dohan ED, Bielecki T, Jimbo R, et al. Do the fibrin architecture and leukocyte content influence the growth factor release of platelet concentrates? An evidence-based answer comparing a pure platelet-rich plasma (P-PRP) gel and a leukocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Curr Pharm Biotechnol. 2012; 13(7): 1145-1152.

[27]Dohan DM, Choukroun J, Diss A, et al. Platelet-rich fibrin (PRF): a second-generation platelet concentrate. Part III: leucocyte activation: a new feature for platelet concentrates? Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006; 101(3):e51-55.

[28]Yang YZ, Liu HC, Liu GJ, et al. Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi. 2010;24(5):571-576.杨阎峙,刘衡川,刘关键,等.健康志愿者自体富血小板凝胶体外抑菌作用研究[J].中国修复重建外科杂志,2010,24(5):571-576.

[29]Pan LH. Yixue Zongshu. 2005;11(9):775-777.潘灵辉.细胞因子平衡在炎症反应中作用的研究进展[J].医学综述,2005,11(9):775-777.

[30]Park WY, Goodman RB, Steinberg KP, et al. Cytokine balance in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 2001;164(10 Pt 1): 1896-1903.

引言

富白细胞-血小板血浆(leucocyte- and platelet-rich plasma，L-PRP)凝胶是采集自身外周静脉血，经离心、分离后得到富白细胞-血小板血浆，再将其按一定比例与凝血酶-钙剂混合后得到的凝胶状物质，它在口腔、骨科以及皮肤难愈性溃疡的治疗等领域应用广泛，能够促进包括成纤维细胞、成骨细胞等在内的多种细胞的增殖和分化^[1] ，促进软组织的修复^[2-3] ，使组织重建的时间显著缩短^[4] ，并且能够减少重建带来的肿胀和疼痛^[5-6] ，进而缩短愈合时间。冉兴无等^[7]的研究用富白细胞-血小板血浆凝胶治疗8例糖尿病合并难愈性皮肤溃疡患者的研究表明，溃疡面积在治疗后第3天明显缩小，7例患者在治疗12周之内溃疡愈合，仅1例患者髋部压疮治疗无效。 Epplev等[8]研究发现富白细胞-血小板血浆凝胶中转化生长因子β1、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、表皮细胞生长因子浓度均明显升高，但胰岛素样生长因子1浓度与全血比较无明显差异，转化生长因子β1浓度与血小板数量成正相关。袁南兵等^[9]的研究发现富白细胞-血小板血浆凝胶中生长因子浓度高于全血，血小板数量与血小板源性生长因子、转化生长因子β1浓度成正相关。富白细胞-血小板血浆凝胶释放的生长因子种类很多，其中血小板衍生因子是最先分泌和发挥作用的生长因子，可趋化并激活巨噬细胞和中性粒细胞，诱导纤维组织母细胞等的迁移、增殖和分化，促进血管和神经生成。转化生长因子β能刺激纤维母细胞的增殖和分化，促进细胞外基质合成和血管生成，通过趋化中性粒细胞和单核细胞参与炎症过程。血管内皮生长因子具有广泛的促细胞增殖和组织再生的生物学活性，可扩张血管，并有加速血管生成的效应。白细胞是富白细胞-血小板血浆凝胶的重要成分之一，白细胞及其释放的炎性因子在凝胶的治疗过程中发挥的作用不容忽视，但国内外对白细胞的研究主要集中在体外的抗菌作用。Bielecki等^[10]通过纸片扩散法首次在体外研究中探讨了富白细胞-血小板血浆凝胶的抑菌作用，结果显示富白细胞-血小板血浆凝胶对甲氧西林敏感或对耐药的金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌表现出抗菌活性，对肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌无效。Moojen等^[11]研究也表明富白细胞-血小板血浆凝胶对金黄色葡萄球菌有抗菌活性，但未对其余病原菌做相应验证。对富白细胞-血小板血浆凝胶中的白细胞和炎性因子的释放情况以及富白细胞-血小板血浆凝胶的抗菌机制研究较少。

鉴于此，实验通过对健康志愿者富白细胞-血小板血浆凝胶中各白细胞成分与全血白细胞成分进行比较，测定富白细胞-血小板血浆凝胶中释放的炎性因子和生长因子的量以及对炎性因子释放量随时间的变化情况进行分析，观察富白细胞-血小板血浆凝胶的结构，以期进一步证明凝胶中白细胞组成成分的变化情况，从白细胞和炎性因子释放的角度对富白细胞-血小板血浆凝胶的作用机制进行进一步探讨。

材料方法

设计：自身对照，临床观察性研究。
时间及地点：实验于2011年9月至2012年9月在北京大学解放军306医院教学医院中心实验室完成。
对象：健康志愿者12人，男女各6名，年龄24-29岁，平均年龄26.1岁。
纳入标准：①年龄20-30岁，性别不限。②符合《中华人民共和国献血法》^[12]的要求，4×109 L-1<白细胞数<10×10⁹L^-1，血小板数>100×10⁹L^-1。③取血前1周内禁烟酒，不服用任何影响血小板和凝血系统功能的药物。
排除标准：①年龄<20岁或>30岁。②不符合《中华人民共和国献血法》的要求，白细胞数<4×10⁹ L^-1或白细胞数>10×109 L-1，血小板数<100×10⁹L^-1。③患有心脏病、结核、肝炎、肾脏疾病、糖尿病及恶性肿瘤等。④需要长期或近期内服用影响血小板和凝血系统功能的药物而近1周内不能停用。⑤哺乳期、孕期的妇女。⑥依从性差或拒绝签署知情同意书。
根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[13] ，在实验前将实验方案和风险告知对方，并签署知情同意书。
富白细胞-血小板血浆凝胶中释放的炎性因子检测相关试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
富白细胞-血小板血浆凝胶制备：用一次性采血针和含有体积分数3.2%枸橼酸钠的真空采血管采集志愿者空腹肘部静脉血，每人取6 mL。取1 mL做全血血小板和白细胞计数及白细胞分类分析，剩余5 mL静脉血先以160×g离心20 min，离心后分为3层，即上清液、浅黄色中间层以及红细胞层，取上清、中间层及红细胞上层 0.5 cm，转移至塑料试管中。再以400×g离心15 min，弃除3/4的上清，将剩余1/4充分混匀后即为富白细胞-血小板血浆。以10∶1的比例加入激活剂后混匀，得富白细胞-血小板血浆凝胶^[14-16] 。
富白细胞-血小板血浆凝胶中血小板和白细胞计数及分类检测：将制备富白细胞-血小板血浆剩余的液体保留，检测其中血小板和白细胞的数量及白细胞分类，并计算富白细胞-血小板血浆凝胶中血小板和白细胞的浓缩倍数和回收率。

血小板浓缩倍数=(富白细胞-血小板血浆中血小板浓度/全血中
血小板浓度)×100%。
白细胞浓缩倍数=(富白细胞-血小板血浆中白细胞浓度/全血中白
细胞浓度)×100%。
血小板回收率=(富白细胞-血小板血浆中血小板总数/全血中
血小板总数)×100%。
白细胞回收率=(富白细胞-血小板血浆中白细胞总数/全血中白
细胞总数)×100%。
富白细胞-血小板血浆凝胶释放的生长因子检测：将制备好的凝胶转移至含有4 mL无菌DMEM培养基的试管中放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中保存。分别于培养1，3，7，14，21 d后收集含有凝胶渗出液的DMEM培养基，保存于-80 ℃ 冰箱中。
采用酶联免疫吸附实验检测培养0-1 d，2-3 d， 4-7 d，8-14 d，15-21 d共5个时间段的血小板源性生长因子、转化生长因子β1、血管内皮生长因子的浓度。酶联免疫吸附实验检测步骤：取酶标板，按标准品次序分别加入100 μL标准品溶液于空白微孔中；空白微孔中加入100 μL的样品，空白对照加入100 μL的蒸馏水；在各孔中加入50 μL 酶标记溶液(不含空白对照孔)；将酶标板用封口胶密封，37 ℃孵育反应1 h；充分清洗酶标板5次；用吸水纸彻底拍干；各孔加入显色剂各50 μL；20-25 ℃下避光反应10 min；各孔加入 50 μL终止液。30 min内在波长450 nm的酶标仪上读取各孔的吸光度值；使用logit-log数据处理模式，由电脑自动计算得出结果^[17-18] 。
富白细胞-血小板血浆凝胶释放的炎性因子检测：将制备好的凝胶转移至含有4 mL无菌DMEM培养基的试管中放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中保存。分别于培养1，3，7，14，21 d后收集含有凝胶渗出液的DMEM培养基，保存于-80 ℃ 冰箱中。采用酶联免疫吸附实验检测培养0-1 d，2-3 d，4-7 d，8-14 d，15-21 d共5个时间段的白细胞介素1，4，6的浓度。
富白细胞-血小板血浆凝胶结构观察：从参加因子测定的志愿者中随机选择1名志愿者，女，年龄25岁。用一次性采血针和含有3.2%枸橼酸钠的真空采血管采集空腹肘部静脉血，全血量5.4 mL，制备富白细胞-血小板血浆凝胶，得到富白细胞-血小板血浆凝胶体积0.8 mL。将制备好的富白细胞-血小板血浆凝胶迅速放入体积分数3%戊二醛(pH 7.2)固定，在4 ℃冰箱中保存24 h；随后将富白细胞-血小板血浆凝胶转移至0.18 mol/L蔗糖冲洗液中，在4 ℃冰箱中固定24 h；再将富白细胞-血小板血浆凝胶转移至体积分数1%锇酸中，在4 ℃冰箱中固定24 h；续之以梯度乙醇脱水；乙酸异戊酯置换20 min；CO2临界点干燥；随机选取0.5 cm×0.5 cm大小的标本 1块，喷金后用JSM 5600 LV(JEOL，日本电子公司)扫描电镜观察^[19-21] 。
主要观察指标：健康志愿者全血和富白细胞-血小板血浆凝胶中血小板、白细胞计数、浓缩倍数和回收率；富白细胞-血小板血浆凝胶5个时间段释放的白细胞介素1，4，6、血小板源性生长因子、转化生长因子β1、血管内皮生长因子的浓度；电镜下富白细胞-血小板血浆凝胶的超微结构。
统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，计数资料用率表示。采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。将不符合正态分布的计量资料经对数转换后使之基本符合正态分布，两样本均数的比较用两样本t 检验，多个样本均数的比较用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血小板凝胶技术在口腔、骨科等领域中已有广泛研究，其中富白细胞-血小板血浆凝胶应用时间最久，也最为广泛，但其机制尚不完全清楚。既往研究主要集中在生长因子的作用上，实验对富白细胞-血小板血浆凝胶中3种生长因子的释放情况进行了测定，结果显示，血小板源性生长因子和转化生长因子β1的释放情况与文献报道相似^[21] ，在凝胶制备完成的早期大量释放，其后迅速下降。血小板源性生长因子是最先分泌的生长因子．可趋化并激活巨噬细胞及中性粒细胞，诱导纤维组织母细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等的迁移、增殖和分化，促进血管和神经生成。转化生长因子β1能刺激纤维母细胞的增殖和分化，促进细胞外基质合成和血管生成，通过趋化中性粒细胞和单核细胞参与炎症过程^{[2-3, 5]} 。本次实验结果显示，血管内皮生长因子的释放与血小板源性生长因子和转化生长因子β1略有不同，其释放量呈先上升，后下降的趋势。血管内皮生长因子是体内广泛存在的一种血管内皮生长因子，具有广泛促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，在血管内皮细胞增殖、分化和迁徙过程中起重要的调控作用^[22-23] 。Tiong等^[24]研究指出，即使是低水平的血管内皮生长因子也足以启动新生血管的形成，血管内皮生长因子多种不同的亚型可以整合在一起引导和推进血管再生过程。富白细胞-血小板血浆凝胶中血管内皮生长因子的释放情况与其作用相一致，有利于创面的愈合。

除了血小板和生长因子，富白细胞-血小板血浆凝中另一重要的组成成分是白细胞及其释放的炎性因子，由全血制备成的富白细胞-血小板血浆凝在白细胞在数量和成分上都发生了变化。实验显示，富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞计数提高了2倍，这与文献报道相似^{[9, 11]} 。各类白细胞所占比例与全血中的不同，全血中以中性粒细胞为主，而富白细胞-血小板血浆凝胶中以淋巴细胞为主。实验同时对富白细胞-血小板血浆凝胶的超微结构做了观察，结果显示，富白细胞-血小板血浆凝胶中发现的白细胞几乎均为淋巴细胞，尤其是小淋巴细胞多见。其原因可能是，血液中的淋巴细胞大部分为直径6-8 μm的小淋巴细胞，小部分为直径9-12 μm的中淋巴细胞，不存在直径13-20 μm的大淋巴细胞。红细胞直径为7-8 μm，与小淋巴细胞相似，血小板是从骨髓巨核细胞脱落下来的胞质小块，直径为2-4 μm^[25] 。因此经过第一次离心后，绝大部分体积较小的血小板和小淋巴细胞以及少量的其他类型白细胞位于红细胞层之上的中间层，而大部分体积较大的其他类型的白细胞位于试管底部，取上清、中间层和少量上层红细胞时，底部的白细胞被弃掉，因此造成富白细胞-血小板血浆凝胶中各类白细胞比例的变化，这一变化对富白细胞-血小板血浆凝胶释放的炎性因子的种类和数量有直接的影响。同时不同类型的白细胞也能够影响生长因子的释放，特别是转化生长因子β1的释放，此外白细胞也能够产生大量的血管内皮生长因子，对促进血管再生有重要的作用^[26-27] 。

抗菌作用是富白细胞-血小板血浆凝胶中的白细胞及其释放的炎性因子的主要作用之一，因此之前国内外报道的文献多针对其体外的抗菌作用开展研究^{[10-11, 28]} ，但富白细胞-血小板血浆凝胶的抗菌机制尚不明确，也少有关于对富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞释放炎性因子的量以及炎性因子释放量随时间的变化情况进行分析的报道，由于富白细胞-血小板血浆凝胶是采血后在体外制备完成，且白细胞是在人为添加激活剂后被动激活，其炎性因子的释放规律和数量与人体内的白细胞被激活后释放的炎性因子并不相同。实验结果提示，富白细胞-血小板血浆凝胶释放的各种炎性因子有不同的释放特点。富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞介素4的释放量一直处于稳定的状态，测定的5个时间段释放量均无显著差异，这可能与它的调节作用有关。白细胞介素4在人体内是重要的炎性反应调节因子，主要由活化的T细胞产生，在体内其作用主要取决于内环境，在炎症的早期，白细胞介素4可以促进活化的B细胞增殖分化而促进炎症反应的进程，但其最主要的作用是在炎症反应的后期抑制白细胞介素1，6等多种促炎因子的表达，促进纤维蛋白的生成从而推进愈合进程^[27]。富白细胞-血小板血浆凝胶随着时间的推移释放的白细胞介素4基本保持稳定，说明其作用与体内相似，以调节为主。白细胞介素1，6都是重要的促炎因子，白细胞介素1主要由单核细胞、中性粒细胞和内皮细胞产生，在体内能诱发抗原递呈细胞表面免疫分子的表达，为T淋巴细胞的活化提供第二信号，促进B细胞的增生、分化，介导免疫球蛋白的分泌，增强细胞免疫和体液免疫介导的组织损伤过程，一般在炎性反应的急性早期释放较多，其释放持续的时间和数量根据炎性反应的持续时间和严重程度而定，在炎性反应的后期被抑制^[29-30] 。富白细胞-血小板血浆凝胶释放的白细胞介素1在培养0-1 d就达到峰值，之后逐渐递减，7 d后维持在较低水平，虽然此变化符合体内炎性反应中白细胞介素1的变化规律，但其释放水平的下降主要与富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞介素1来源细胞逐渐减少有关，因此与体内的白细胞介素1变化并不完全相同，这提示如果对慢性难愈性创面应用富白细胞-血小板血浆凝胶时，可能需要多次的凝胶治疗。白细胞介素6主要由单核细胞、淋巴细胞和内皮细胞产生，参与T细胞、B细胞的增殖分化和急性期蛋白产生，参与构成信号放大传导通路，在炎症连锁反应的发生、发展、重建和消退中起到重要的作用^[27] 。在体内白细胞介素6的变化规律与白细胞介素1相似，但在富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞介素6的释放与白细胞介素1略有不同，富白细胞-血小板血浆凝胶中释放的白细胞介素6水平明显高于白细胞介素1，且在培养0-7 d一直保持较高水平，其可能的原因是富白细胞-血小板血浆凝胶中保留的全血中绝大部分的淋巴细胞，这些淋巴细胞在富白细胞-血小板血浆凝胶制备完成的早期可分泌大量的白细胞介素6。

实验的不足之处为纳入样本例数较少且个体差异性较大，大部分结果仅表现出一种变化趋势，没有统计学差异。其次，实验均采用健康志愿者血样本进行检测分析，因为糖尿病可以引起体内多种代谢紊乱，这些代谢紊乱对富白细胞-血小板血浆凝胶中白细胞和血小板的功能是否有影响需要进一步地分析。

因此，富白细胞-血小板血浆凝胶的促进创面愈合的机制除与血小板源性生长因子BB、转化生长因子β、血管内皮生长因子的释放有关外，可能与富集更多的淋巴细胞及白细胞介素1，4，6的释放有关。

富白细胞-血小板血浆凝胶释放的炎性生长因子

Inflammatory factor release from leukocyte- and platelet-rich plasma gel

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张咪, 吴赛璇, 董明, 陆颖, 牛卫东. 根尖周炎模型小鼠白细胞介素24的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 679-684.
[2]	杨洋, 姚羽, 沈孝天, 刘佳佳, 薛建华. 退变腰椎间盘中白细胞介素21的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 690-694.
[3]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[4]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[5]	李鑫平, 崔秋菊, 曾曙光, 冉高英, 张兆强, 刘显文, 方炜, 徐帅妹. β-磷酸三钙/壳聚糖水凝胶改性对牙髓干细胞生长与矿化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3493-3499.
[6]	刘利永, 周雷. 组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3527-3533.
[7]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[8]	甘丽莉, 熊娜, 刘燕飞. 水凝胶药物支架修复皮肤创面：临床应用可能性的挑战[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3578-3583.
[9]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[10]	刘方, 单争明, 汤雨蕾, 伍晓敏, 田卫群. 臭氧缓释水凝胶止血及促伤口愈合作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3445-3449.
[11]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[12]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[13]	张剑慧, 马贺然, 谭毅, 王芝辉. 人脂肪间充质干细胞无支架三维凝胶修复猪膝关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2969-2975.
[14]	陈谱, 阮安民, 周俊, 张晓哲, 马玉峰, 宗晨钟, 王庆普. 通络止痛凝胶干预膝关节骨性关节炎模型兔的软骨炎症及退变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2670-2675.
[15]	陈思宇, 李燕楠, 颉丽英, 刘司麒, 范玉蓉, 房昌星, 张鑫, 权家宇, 左琳. 负载碱性成纤维细胞生长因子温敏性壳聚糖-胶原复合水凝胶可减缓小鼠心肌梗死后心室的重构[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2472-2478.