亚低温条件下脊髓损伤模型大鼠神经再生微环境及运动功能的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床研究证明全身亚低温能显著降低重型颅脑损伤患者的致残率和死亡率。近年来，有关亚低温治疗脊髓损伤的研究也相继开展。
目的：观察脊髓损伤后亚低温对神经再生微环境的影响，探索其对脊髓损伤后神经再生和功能恢复的可能作用机制。
方法：67只大鼠中随机取20只作为假手术组，其余大鼠采用改良Allen打击法于T9节段建立脊髓损伤模型，剔除剔除模型失败3只及模型制作后死亡4只大鼠后，随机等分为脊髓损伤组和亚低温组，各20只。假手术组和脊髓损伤组大鼠置于常温操作台上，使其肛温保持在(37.0±0.5) ℃，维持72 h。亚低温组大鼠置于冰毯机上，使其肛温保持在(34.0±0.5) ℃，维持72 h，室温下自然复温。
结果与结论：与脊髓损伤组相比，亚低温组大鼠损伤脊髓组织中凋亡指数降低，水通道蛋白4/9 mRNA和蛋白表达水平下降，体感诱发电位潜伏期和波幅恢复，运动功能评分在增加。说明亚低温治疗通过减少神经细胞凋亡和降低水通道蛋白4/9 mRNA和蛋白的表达水平，对脊髓损伤起到保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 亚低温, 脊髓损伤, 运动功能, 水通道蛋白4, 水通道蛋白9, 电生理

Abstract:

BACKGROUND: Clinical studies have demonstrated that systemic mild hypothermia could significantly reduce the disability and mortality rate of patients with severe traumatic brain injury. In recent years, the researches about the treatment of spinal cord injury by mild hypothermia have been successively carried out.
OBJECTIVE: To investigate the effects of mild hypothermia on nerve regeneration microenvironment after spinal cord injury and explore the possible underlying mechanism of nerve regeneration and functional recovery after spinal cord injury in rats.
METHODS: Twenty out of sixty-seven rats were randomly selected as the sham group, and other rats were used to establish spinal cord injury models in T9 segment using modified Allen's method. Three rats were excluded for failure in spinal cord injury induction and four rats for death during modeling. The rest 40 rats were randomly and evenly divided into the spinal cord injury and mild hypothermia groups (n=20 rats/group). The rats in the sham and spinal cord injury groups were placed in the operating table with normal temperature, making their rectal temperature at 37.0±0.5 ℃ for 72 hours. The rats in the mild hypothermia group were placed on ice blanket machine, making their rectal temperature at 34.0±0.5 ℃ for 72 hours, then the temperature was naturally rewarmed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with spinal cord injury group, the apoptosis index and the level of aquaporin 4/9 mRNA and protein expression in spinal cord injury tissue were all decreased, somatosensory evoked potential latency and amplitude were recovered, and the motor functional scores were increased in the mild hypothermia group. These results indicate that mild hypothermia play its protective effect on spinal cord injury through attenuating apoptosis of neural cells and decreasing aquaporin 4/9 mRNA and protein expression levels.

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Key words: Spinal Cord Injury, Hypothermia, Apoptosis, Evoked Potentials, Somatosensory

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 7

2.1 造模成功动物数量及过程 67只大鼠中随机取20只作为假手术组，其余大鼠建立脊髓损伤模型，剔除剔除模型失败3只及模型制作后死亡4只大鼠后，随机等分为脊髓损伤组和亚低温组，各20只。3组共60只大鼠均进入结果分析。实验流程见图1。

2.2 模型的改进改良Allen打击法操作技术简单、重复性好，易于掌握，便于推广且实用，且便于切口的暴露，减少由移动造成的误差和脊髓受打击后反弹引起的“二次打击损伤”。

2.3 模型更接近临床实践 Allen打击模型的优点是鉴于临床上脊髓损伤的外力多来自脊髓前方，如椎体骨折、脱位、脊髓前动脉常受损伤。因脊髓损伤集中于前方，更接近于临床上的脊髓损伤，且稳定性更好。

2.4 运动功能变化结果造模前所有大鼠的BBB评分和斜板试验差异均无显著性意义(P > 0.05)。亚低温治疗后，亚低温组大鼠上述评分较脊髓损伤组增加(造模后2-4周 P < 0.05)，但仍低于假手术组(造模后2-4周P < 0.05；表1)。

2.5 细胞凋亡情况 TUNEL染色可见，亚低温组大鼠损伤脊髓组织中凋亡细胞数量为(11.38±2.72)/200倍视野，明显少于脊髓损伤组[(32.26±3.52)/200倍视野，P < 0.05]，假手术组未见凋亡细胞(图2)。

2.6 水通道蛋白4/9 mRNA表达水平造模后72 h，亚低温组大鼠损伤脊髓组织水通道蛋白4/9 mRNA的表达水平高于假手术组(P < 0.05)；亚低温组大鼠损伤区脊髓水通道蛋白4/9 mRNA的表达水平较脊髓损伤组明显降低(P < 0.05；图3，表2)。

2.7 水通道蛋白4/9蛋白表达水平造模后72 h，亚低温组大鼠脊髓损伤组织中水通道蛋白4/9蛋白表达水平高于假手术组(P < 0.05)；亚低温组大鼠损伤区脊髓水通道蛋白4/9蛋白的表达水平较脊髓损伤组明显降低(P < 0.05；图4，表2)。

2.8 体感诱发电位变化脊髓损伤后，大鼠诱发电位波形完全消失。造模后4周，脊髓损伤组大鼠的体感诱发电位少量恢复，亚低温组大鼠体感诱发电位潜伏期缩短，波幅增高。亚低温组与脊髓损伤组大鼠体感诱发电位潜伏期和波幅差异有显著性意义(P < 0.05)，且亚低温组与假手术组大鼠体感诱发电位潜伏期和波幅差异有显著性意义(P < 0.05；表3)，表明亚低温修复脊髓损伤大鼠神经传导通路。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料实验于2013年4月至2014年9月在天津医科大学神经病学研究所完成。清洁级成年雌性SD大鼠67只，鼠龄6周，体质量260-300 g，购自天津医科大学动物实验室，许可证号SCXK(津)20090010。大鼠饲养于25 ℃、自然光照环境。实验经过天津市第四中心医院动物伦理学委员会批准。取其中20只作为假手术组，其余大鼠建立脊髓损伤模型，剔除模型失败及死亡大鼠后，随机等分为脊髓损伤组和亚低温组。

大鼠脊髓损伤模型的亚低温治疗使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
水通道蛋白4/9兔抗大鼠多克隆抗体	上海研谨生物科技有限公司
β-actin兔抗鼠多克隆抗体	武汉博士德生物工程公司
AMV反转录试剂盒	上海酶联生物科技有限公司
反转录PCR试剂盒	德国QIAGEN公司
耐热性TaqDNA 聚合酶	广州东盛生物科技有限公司
100 bp DNA ladder	华美生物工程公司
AMV反转录试剂盒	杭州博日公司
TUNEL凋亡试剂盒	德国Roche公司
美同HP-V26温度测定仪	美国CSZ公司
Blanketrol II^®变温床	杭州沃克医疗器械有限公司
紫外分光光度计	上海元析仪器有限公司
Keypoint台式肌电-诱发电位仪	美国Medtronic公司

1.2 造模方法采用的改良Allen打击法建立大鼠脊髓损伤模型，这是一种模型操作技术简单、重复性好，易于掌握，便于推广且实用的动物模型制作方法。在Allen’s动物模型的基础上加以改进根据实验结果打击量的大小影响脊髓损伤的自主功能恢复，打击量越大，脊髓功能自主恢复越慢，行为学评分也较低。取雌性SD大鼠67只，以3.6%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，取俯卧位。将大鼠俯卧位固定于实验台上，腰背部剪毛，以T8-9棘突为中心，自背部正中切口，显露T7-10棘突及椎板，切除T8-9棘突及部分椎板组织，暴露脊髓组织作为损伤区。制模方法参照改良Allen打击法^[10]，将10 g重物从2.5 cm高度垂直落下并直接撞击大鼠脊髓组织。由不锈钢材料制成手术固定槽，槽宽度为8 cm，长度为20 cm，另有臂长不同的钳夹，可以根据模型制作时，损伤脊髓阶段的不同选择不同的钳夹。此装置在打击脊髓时用于固定双侧组织，一则便于切口的暴露，减少由移动造成的误差；二则避免脊髓受打击后反弹引起的“二次打击损伤”。其基本方法是椎板开窗，将直角撞击钩置于脊髓前方，钩固定于杠杆的一端，重物坠击于杠杆的一端，利用杠杆原理使钩端上跷，钩随之上提撞击脊髓腹侧而受伤。
1.3 造模成功的检测标准术后大鼠尾巴痉挛摆动后双下肢瘫痪表明制模成功^[10]。
1.4 亚低温治疗造模后，假手术组和脊髓损伤组大鼠置于常温操作台上，使其肛温保持在(37.0±0.5) ℃，维持72 h。亚低温组大鼠置于冰毯机上，使其肛温保持在(34.0±0.5) ℃，维持72 h，然后室温下自然复温。连续监测大鼠肛温。
1.5 运动功能评定分别于损伤前、损伤后1，3 d、1，2，3，4周对脊髓损伤组、亚低温组及假手术组大鼠进行运动功能评定。评定项目包括BBB评分和斜板试验^[11-12]。BBB评分将大鼠后肢运动分为22个等级，全瘫为0分，完全正常为21分，评分采用盲法。斜板试验：在斜板上将鼠头朝向上、下、左、右，记录其保持5 s的最大角度。
1.6 凋亡细胞检测伤后72 h，3组大鼠各取9只，麻醉后剖胸，经左心室-主动脉插管，40 g/L多聚甲醛灌流固定。以伤处为中心取1.5 cm脊髓组织，多聚甲醛浸泡固定。石蜡切片脱蜡，TUNEL法检测计数，按试剂盒说明操作。胞核呈棕黄色颗粒为TUNEL阳性细胞，对10帧照片上的凋亡细胞数进行计数，计算凋亡指数=阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)×100%。
1.7 反转录PCR检测分别取各组各时间点5只实验动物脊髓损伤区组织周围部分50 mg进行反转录PCR分析。采用Trizol试剂说明书介绍的方法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，利用反转录PCR两步法试剂盒说明将mRNA反转录成cDNA，然后再将cDNA进行PCR扩增。按AMV反转录试剂盒的操作说明将mRNA反转录为cDNA。用以下引物对水通道蛋白4/9及β-actin的cDNA进行扩增[7]：水通道蛋白9(137 bp)引物序列为：上游5’-CCA GCT CCA TTC ATA TCC AC-3’，下游5’-CTA ATG ACA ACA GGC TCC AG-3’；β-actin(175 bp)引物序列：上游5’-CCA TCA TGA AGT GTG ACG TTG-3’，下游5’-ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA-3’。水通道蛋白4(305 bp)引物序列：上游5’-CCA GCT GTG ATT CCA AAA CGG AC-3’，下游5’-TCT AGT CAT ACT GAA GAC AAT ACC TC-3’。取PCR扩增产物进行电泳，电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带吸光度分析，计算水通道蛋白4/9产物与β-actin产物的积分吸光度的比值，作为水通道蛋白4/9 mRNA表达水平的指标。采用Image-ProPlus 5.0图像处理与分析系统进行图像分析。
1.8 Western Blot检测将反转录PCR提取后剩余物以 1 500 r/min 离心30 min，取上清为粗体蛋白质，Bradford法测定蛋白浓度。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，洗膜10 min×3次，水通道蛋白9/水通道蛋白4多克隆抗体(1∶500)室温孵育60 min；TBST洗膜10 min×3次，加入1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的兔抗鼠抗体。室温孵育60 min；TBST洗膜10 min×3次，再用TBS洗膜10 min DAB显色，Quantity one软件(美国Bio-Rad公司)图像分析，通过目的条带与β-actin条带吸光面积的比值评定蛋白表达水平。
1.9 体感诱发电位的检测术后第4周，3组各取7只大鼠，参考文献[8]的方法用诱发电位仪测定体感诱发电位。体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将其平放在水平面上，后肢固定刺激电极。记录电极安放于冠状缝和矢状缝愈合线的相交处头皮下(即后肢皮层感觉区)，参考电极置于其后方0.5 cm处。给予直流方波电脉冲刺激，以后肢轻微抽动为宜，电流强度为5-15 mA，波宽0.2 ms，频率3 Hz，叠加次数50-60次，记录体感诱发电位潜伏期及波幅的变化，观察神经电生理恢复情况。
1.10 主要观察指标大鼠后肢运动功能、脊髓损伤区神经细胞的凋亡及脊髓损伤区及周围组织水通道蛋白4/9的表达水平和神经电生理恢复情况。
1.11 统计学分析数据用x±s表示。实验数据用SPSS 17.0软件分析，两组均数比较用t 检验，多组均数比较用单因素方差分析(LSD法)。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近些年来，脊髓损伤的发病率逐渐上升，对人类的健康及生命安全造成危害。脊髓损伤后受损的神经不能再生及修复，这就导致了患者死亡率及致残率的升高，如何解决这一问题一直是神经外科研究的重点^[10-12]。动物实验采用的主要脊髓损伤模型有脊髓撞击损伤模型、脊髓压迫损伤模型、切割和吸除型脊髓损伤模型等。其中Allen法打击建立的脊髓撞击损伤模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律，且具有可以具体量化的有点，模型的稳定性良好，是否为国内外认证的经典方法，故实验采用改良的Allen法打击建立大鼠脊髓损伤模型。目前，亚低温(33-35 ℃)在治疗脑和脊髓损伤中的作用越来越受到医务工作者的关注^[13-17]。大量实验研究表明，亚低温可改善脊髓损伤区域的微环境，能够抑制脊髓水肿，保护神经细胞功能^[18-23]。本实验探讨亚低温对脊髓损伤后神经再生微环境的影响及其神经再生和功能恢复的可能作用机制。
本实验通过BBB评分进行运动功能评定，结果显示在治疗后2周，亚低温组在各个时间点的神经功能评分都增加。说明亚低温可以改善脊髓损伤后大鼠的神经功能。在脊髓损伤发生后，因脊髓缺血而导致脊髓水肿，水肿又进一步加重局部缺血，这样形成恶性循环。亚低温是通过降低脊髓损伤区的血管通透性，减少血液外渗，减轻水肿，抑制氧自由基产生，减轻脂质过氧化，稳定细胞膜，减轻脊髓水肿，继而发挥对神经细胞的保护功能^[24-28]。亚低温改善脊髓损伤后大鼠神经功能的机制，还可能通过减少中性粒细胞浸润及白细胞介素8在脊髓组织中的表达，抑制脊髓缺血再灌注后炎症反应，减少缺血再灌注后的过度充血^[29-32]，阻止迟发性的兴奋性氨基酸释放，阻断毒性物质对神经细胞的损害，从而减轻脊髓继发性损伤，使得脊髓损伤后神经功能的恶化得以明显改善^[33-36]。本实验显示亚低温使大鼠损伤脊髓组织中凋亡指数降低，而亚低温抑制细胞凋亡的机制可能有：①通过凋亡的调节系统来抑制细胞凋亡[36-40]。②通过减少自由基的产生、抑制兴奋性氨基酸的释放、减轻炎症反应而抑制细胞凋亡^[41-45]。③与降低神经元代谢，抑制核转录因子核转录因子κB易位，抑制诱导型一氧化氮合酶活性，降低核酸内切酶活性等因素有关^[44-49]。实验结果显示亚低温使大鼠损伤脊髓组织中水通道蛋白4/9 mRNA和蛋白表达水平降低，体感诱发电位潜伏期和波幅恢复，表明亚低温可促进脊髓损伤后神经再生微环境的改善及其神经再生和功能的恢复。
综上所述，亚低温可有效干预大鼠脊髓损伤后神经功能的改善。亚低温能够减少神经细胞氧消耗，维持内环境稳定，减少乳酸蓄积，降低中枢神经细胞氧耗，通过亚低温使脊髓代谢率降低，进而改善氧的供需关系和脊髓的缺血缺氧状态^[50-53]。随着人们对亚低温的深入研究，相信在不久的将来亚低温的临床应用将会逐步成熟起来。

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