has-miR-100-5p靶向含7A的锌指和BTB结构域是绝经后骨质疏松的潜在靶标

doi:10.12307/2023.843

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (32): 5168-5172.doi: 10.12307/2023.843

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has-miR-100-5p靶向含7A的锌指和BTB结构域是绝经后骨质疏松的潜在靶标

麦合木提江·穆海麦提，买买提沙吾提阿吉·买买提，唐军伟，张玉新

喀什地区第一人民医院脊柱骨科，新疆维吾尔自治区喀什市 844099

收稿日期:2022-08-10 接受日期:2022-11-18 出版日期:2023-11-18 发布日期:2023-03-23
通讯作者: 张玉新，主任医师，喀什地区第一人民医院脊柱骨科，新疆维吾尔自治区喀什市 844099
作者简介:麦合木提江·穆海麦提，男，1986年生，新疆维吾尔自治区喀什市人，维吾尔族，硕士，主治医师，主要从事骨与关节疾病诊疗研究。
基金资助:
喀什地区科技计划项目(KS2020008)，项目负责人：麦合木提江·穆海麦提

Has-miR-100-5p targeting zinc finger and BTB domain containing 7A is a potential target for postmenopausal osteoporosis

Maihemutijiang · Muhaimaiti, Maimaitishawutiaji · Maimaiti, Tang Junwei, Zhang Yuxin

Department of Spinal Orthopedics, the First People’s Hospital of Kashgar, Kashgar 844099, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2022-08-10 Accepted:2022-11-18 Online:2023-11-18 Published:2023-03-23
Contact: Zhang Yuxin, Chief physician, Department of Spinal Orthopedics, the First People’s Hospital of Kashgar, Kashgar 844099, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Maihemutijiang · Muhaimaiti, Master, Attending physician, Department of Spinal Orthopedics, the First People’s Hospital of Kashgar, Kashgar 844099, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Kashgar Regional Science and Technology Program Project, No. KS2020008 (to MM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
绝经后骨质疏松症：在绝经期妇女中，在临床上骨矿物质密度T评分≤-2.5被判定为绝经后骨质疏松症，增加了患者骨折风险。由于雌激素缺乏和老龄化，绝经后骨质疏松症患者的破骨细胞分化和功能增强，骨吸收远远大于骨形成，骨质疏松症开始出现，增加了骨骼脆弱和骨折的风险。对绝经后骨质疏松分子机制的探讨有望为评估绝经后骨质疏松患者的治疗策略提供新的方案。
MicroRNAs：即miRNAs，是长度为18-24个核苷酸的非编码单链RNA小分子，通过直接结合靶标信使RNA (mRNA)的3’-非翻译区，调控靶标mRNA的表达。miRNAs已经成为控制骨形成和吸收、骨重塑和退化基因的重要调节因子。miRNAs不仅能够调节骨髓间充质干细胞的成骨分化，还与血管生成和骨生成密切相关。越来越多的miRNAs被发现在绝经后骨质疏松中异常表达，可作为潜在治疗靶点或诊断生物标志物。

背景：miRNAs在骨质疏松症的发病机制中起重要作用，因此可以成为重要的治疗靶点。其中，靶向miR-100-5p调控轴促进成骨细胞分化是骨质疏松的潜在治疗靶标。
目的：探讨has-miR-100-5p和has-miR-101-3p在绝经后骨质疏松中的靶向调控作用。
方法：比较GSE56814和GSE56815数据中高骨矿物质密度和低骨矿物质密度之间的差异表达基因，并进行富集分析。预测差异表达基因中has-miR-100-5p和has-miR-101-3p的靶向调控的基因。随后，收集40例绝经后骨质疏松患者和40例健康对照者的外周血样本，采用qRT-PCR法检测has-miR-100-5p和has-miR-101-3p以及靶标基因的差异表达。最后，通过双荧光素酶报告基因检测has-miR-100-5p对靶标基因3’UTR的结合作用。
结果与结论：①富集分析显示，高骨矿物质密度和低骨矿物质密度之间鉴定到81个共同差异表达基因，显著富集于免疫、核因子κB复合物、肿瘤坏死因子信号通路等；②miRTargetbase数据库和miRTarget数据库预测显示，has-miR-100-5p和has-miR-101-3p均靶向调控含7A的锌指和BTB结构域(zinc finger and BTB domain containing，ZBTB7A)；③qRT-PCR检测显示，与健康对照组比较，骨质疏松组has-miR-100-5p mRNA表达上调(P < 0.001)，has-miR-101-3p和ZBTB7A mRNA表达下调(P < 0.001)；双荧光素酶报告系统显示，野生型ZBTB7A-3’UTR共转染has-miR-100-5p后，293T细胞的荧光活性下调；④结果显示，has-miR-100-5p靶向ZBTB7A可能是绝经后骨质疏松症的潜在靶标。
https://orcid.org/0000-0003-4130-007X(麦合木提江·穆海麦提)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 绝经后骨质疏松, has-miR-100-5p, has-miR-101-3p, ZBTB7A, 骨矿物质密度

Abstract: BACKGROUND: miRNAs play an important role in the pathogenesis of osteoporosis, which therefore can be important therapeutic targets. Among them, targeting the miR-100-5p regulatory axis to promote osteoblast differentiation is a potential therapeutic target for osteoporosis.
OBJECTIVE: To explore the targeted regulatory roles of has-miR-100-5p and has-miR-101-3p in postmenopausal osteoporosis.
METHODS: Differentially expressed genes between high and low bone mineral density in the GSE56814 and GSE56815 datasets were identified and subjected to enrichment analyses. Target genes of has-miR-100-5p and has-miR-101-3p among the differentially expressed genes were predicted. Peripheral blood samples from 40 patients with postmenopausal osteoporosis and 40 healthy controls were selected and qRT-PCR experiments were performed to detect the differential expression of has-miR-100-5p and has-miR-101-3p as well as target genes. Dual luciferase reporter assay was used to measure the targeting effect of miRNAs to the 3'UTR of target genes.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 81 common differentially expressed genes were identified between high and low bone mineral density, mainly significantly enriched in immunity, nuclear factor-κB compound, and tumor necrosis factor signaling pathway. Has-miR-100-5p and has-miR-101-3p were targeted to regulate zinc finger and BTB domain containing 7A (ZBTB7A) based on miRTargetbase database and miRTarget database predictions. Has-miR-100-5p was up-regulated (P < 0.001) and has-miR-101-3p and ZBTB7A were down-regulated (P < 0.001) in postmenopausal osteoporosis patients compared with the healthy controls. The fluorescence activity of 293T cells was down-regulated after co-transfection of has-miR-100-5p with wild-type ZBTB7A-3’UTR. To conclude, has-miR-100-5p targeting ZBTB7A may be a potential target for postmenopausal osteoporosis.

Key words: postmenopausal osteoporosis, has-miR-100-5p, has-miR-101-3p, ZBTB7A, bone mineral density

中图分类号:

麦合木提江·穆海麦提, 买买提沙吾提阿吉·买买提, 唐军伟, 张玉新. has-miR-100-5p靶向含7A的锌指和BTB结构域是绝经后骨质疏松的潜在靶标[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5168-5172.

Maihemutijiang · Muhaimaiti, Maimaitishawutiaji · Maimaiti, Tang Junwei, Zhang Yuxin. Has-miR-100-5p targeting zinc finger and BTB domain containing 7A is a potential target for postmenopausal osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(32): 5168-5172.

图/表（结果） 4

2.1 骨质疏松患者的异常表达基因为了鉴定骨质疏松患者中的差异表达基因，在高骨矿物质密度和低骨矿物质密度患者之间进行了差异分析。在GSE56814数据中鉴定了398个差异表达基因(图1A)，在GSE56815数据中鉴定了3 429个差异表达基因(图1B)，其中，有81个差异表达基因同时存在于两组数据中(图1C)，这些基因被认为是共同差异表达基因(图1D)。

2.2 差异表达基因参与的生物作用富集分析结果发现，共同差异表达基因显著参与造血或淋巴器官发育、免疫系统发育、造血等生物进程；I-κB/核因子κB复合物、转录因子AP-1复合物、线粒体膜等细胞成分；丝氨酸型内肽酶活性、内肽酶活性、金属肽酶活性等分子功能(图2A)。肿瘤坏死因子信号通路、破骨细胞分化、产热等KEGG信号通路被共同差异表达基因显著富集(图2B)。

2.3 has-miR-100-5p和has-miR-101-3p靶标基因通过miRTargetbase数据库和miRTarget数据库预测has-miR-100-5p和has-miR-101-3p
的调控靶标基因，并与共同差异表达基因比较。鉴定了has-miR-100-5p和has-miR-101-3p靶向CAMKK2、EIF5A、PIM1、ZBTB7A的调控网络，见图3A。其中，ZBTB7A同时被has-miR-100-5p和has-miR-101-3p所调控，被认为是关键靶标基因。miRTargetbase数据库中预测的ZBTB7A与has-miR-100-5p和has-miR-101-3p的结合位点，见图3B。

2.4 分子实验验证与健康对照组比较，骨质疏松组has-miR-100-5p表达显著升高(P < 0.001)，has-miR-101-3p mRNA表达显著下降(P < 0.001)， ZBTB7A mRNA表达水平显著下降 (P < 0.001)，见图4A。基于miRNA与靶标基因的靶向负调控关系提示，has-miR-100-5p可能靶向ZBTB7A并调控其表达。双荧光素酶报告系统显示，ZBTB7A突变后在miR-NC组、miR-100-5p模拟组之间无差异，miR-100-5p模拟物抑制了转染野生型ZBTB7A的293T细胞中相应的荧光素酶作用，见图4B。

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引言

骨质疏松是以低骨量和骨组织微结构退化为特征的进行性全身性骨骼疾病，导致骨脆性和骨折易感性增加，约80%的骨折与骨质疏松症有关[1]。骨质疏松在患者、医疗保健提供者和政策制定者的层面上给健康和社会护理带来了巨大负担[2]。由于人口老龄化，骨质疏松症的发病率正在迅速增加，并逐渐成为一个公共卫生问题 [3]。由于微结构恶化无法在临床上测量，因此骨矿物质密度T评分≤-2.5是骨质疏松症的临床评价标准。在绝经期妇女中，绝经5-10年后骨量的快速损失被称为绝经后骨质疏松症[4]。衰老和雌激素下降是绝经后骨质疏松症最常见的2个风险因素[5]。在评估高或低骨折风险的受试者时，区域骨矿物质密度和骨转换标记物的有限辨别能力导致错过预防骨折的机会[6]，因此，需要对绝经后骨质疏松症的分子机制和诊疗策略进行不断的研究。
骨质疏松性骨折与患者生活质量的下降和过早死亡率、残疾和经济负担的增加有关[7]，识别高骨折风险的个体并为他们提供适当的治疗选择是有必要的。口服双膦酸盐是治疗原发性骨质疏松症的首选药物，然而，它们与多种不良反应有关，包括食管炎和食管溃疡、颌骨坏死和非典型股骨部分[8]。研究证据表明，MicroRNAs(miRNAs)提供了关于骨状态的有价值信息，并可能作为骨疾病的生物标志物[9]。miRNAs在骨质疏松症的发病机制中起重要作用，因此可以成为重要的治疗靶点[10]。miRNAs被鉴定为各种细胞过程如细胞增殖、凋亡和细胞分化的潜在调节剂。据报道，miRNAs与绝经后骨质疏松症患者脆性骨折的风险相关[11]。ZHAO等[12]证明，miR-100-5p的增加可通过减少破骨细胞活性来避免卵巢切除动物的骨质流失。靶向miR-100-5p调控轴促进成骨细胞分化，是骨质疏松的潜在治疗靶标[13]。与非骨质疏松患者分离的骨髓间充质干细胞相比，从骨质疏松患者分离的骨髓间充质干细胞中miR-100-5p表达上调，调节骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞[14]。而miR-101-3p的下调与促进破骨细胞成熟有关，并且miR-101-3p减少了卵巢切除小鼠的破骨细胞分化[15]。
此次实验旨在确定绝经后骨质疏松患者的分子失调机制，以及miR-100-5p和miR-101-3p的靶向调控网络，并为这种疾病的治疗提供治疗靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计探索性实验，两组间比较采用学生t检验分析。
1.2 时间及地点实验于2021年7月至2022年3月于喀什地区第一人民医院进行。
1.3 材料 Trizol(Invitrogen，美国)；Primescript RT master mixture试剂盒(Invitrogen，美国)；SYBR Green PCR master mix试剂盒(Invitrogen，美国)；双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，美国)；ABI 7500实时荧光定量系统(Thermo，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 数据收集及处理 GSE56814和GSE56815数据从基因表达总括(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库中下载。GSE56814数据包含来自于42例高骨矿物质密度女性和31例低骨矿物质密度女性的外周血单核细胞的基因表达谱。GSE56815数据包含来自于40例高骨矿物质密度女性和40例低骨矿物质密度女性的外周血单核细胞的基因表达谱。使用稳健多阵列平均值方法对阵列信号进行归一化。
1.4.2 生物信息学分析使用limma R语言包分析高骨矿物质密度和低骨矿物质密度之间的差异表达基因，筛选条件为P < 0.05。使用clusterProfiler R语言包对差异表达基因进行富集分析，P < 0.05时认为是差异表达基因显著富集的GO和KEGG信号通路。miRTargetbase数据库和miRTarget数据库用来预测靶向调控差异表达基因的miRNA。has-miR-100-5p和has-miR-101-3p与靶标基因的调控关系用桑基图展示。
1.4.3 临床样本收集随机选择2021年7月至2022年3月于喀什地区第一人民医院接受诊治的绝经后骨质疏松患者40例，采用病例对照研究方法选择同期40例绝经后非骨质疏松的健康对照者。采集两组外周血样本。所有受试者均知晓研究内容并签署知情同意书。研究获得了喀什地区第一人民医院伦理委员会的批准，审批号：[2020]快审研第(33)号。
骨质疏松组纳入标准：所有受试者均是50岁以上的绝经后妇女，并且双能射线示骨矿物质密度T 评分≤-2.5，血清钙水平低于110 mg/L，血清 25-羟基维生素D≥15 ng/mL，并且甲状旁腺激素、促甲状腺激素处于正常水平。
骨质疏松组排除标准：年龄< 50 岁的绝经后妇女；继发性骨质疏松患者，存在其他代谢紊乱性骨病、精神疾病、甲状腺和甲状旁腺功能异常、严重的心脏、肝肾功能异常或癌症等严重恶性疾病患者；有不良饮食习惯，如大量饮酒、吸烟者；体质量低于40 kg，有明显营养不良者；1年之内服用过双膦酸盐类药物治疗的患者；8 周之内有其他任何可以影响骨代谢药物服用史，如雌激素替代治疗、选择性雌激素受体抑制剂、甲状腺素抑制剂等。
健康对照组纳入标准：50岁以上的绝经后健康女性人群。
健康对照组排除标准：患有任何可显著影响骨代谢的疾病，如甲状腺疾病、糖尿病、癌症、肾脏疾病或强直性脊柱炎；精神疾病、甲状腺和甲状旁腺功能异常、严重的心脏、肝肾功能异常或癌症等严重恶性疾病患者；血清钙水平低于110 mg/L，血清 25-羟基维生素 D≥15 ng/mL；有不良饮食习惯，如大量饮酒、吸烟者；体质量低于 40 kg，有明显营养不良者；8 周之内有其他任何可以影响骨代谢药物服用史。
1.4.4 qRT-PCR检测采用qRT-PCR法检测外周血样本中
has-miR-100-5p、has-miR-101-3p及含7A的锌指和BTB结构域(zinc finger and BTB domain containing，ZBTB7A)mRNA的表达。

利用Trizol提取外周血样本的总RNA，并使用Primescript RT master mixture试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green PCR master mix试剂盒进行qRT-PCR实验。在qRT-PCR过程中，将各个cDNA的模板进行4个扩增阶段：初级变性阶段(Ⅰ)(94 ℃ 2 min)，变性阶段(Ⅱ)(94 ℃ 30 s)，退火阶段(Ⅲ)(59 ℃ 30 s)和扩增阶段(Ⅳ)(72 ℃ 30 s)，程序共被执行42个循环。以U6作为miRNA的内参基因，GAPDH为mRNA的内参基因，通过2-ΔΔCt方法计算检测基因的相对表达水平。所用引物序列见表1。

1.4.5 双荧光素酶活性检测获取miRTargetbase中预测ZBTB7A基因与miRNA结合的3’UTR结合序列。从人外周血样本提取DNA中进行PCR扩增结合序列片段，将扩增子克隆到pMIR双荧光素酶报告载体萤火虫荧光素酶终止密码子的下游中，以获得命名为WT的野生型报告质粒。然后通过PCR扩增结合序列的6-7 bp位点突变，得到序列突变的扩增子，将扩增子克隆到pMIR双荧光素酶报告载体中并获得命名为MUT的突变型报告质粒。miR模拟物和miR对照模拟物(miR-NC)由锐博生物设计合成。细胞分组为miR-NC加ZBTB7A-WT、miR模拟物加ZBTB7A-WT、miR-NC加ZBTB7A-MUT、miR模拟物加ZBTB7A-MUT。使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(Invitrogen)分别将两种质粒、miR模拟物和miR-NC共转染至处于指数期的293T细胞(上海佰晔生物)中，继续培养2 d，将被动裂解缓冲液加入细胞培养板中，然后将其置于平板振荡器上，在室温下剧烈摇动15 min，使细胞完全裂解，使用酶标仪检测双荧光素酶报告物测定系统(Promega)的萤火虫荧光素酶活性值。
1.5 主要观察指标 has-miR-100-5p和has-miR-101-3p在绝经后骨质疏松中的靶向调控作用。
1.6 统计学分析所有数据用Prism 9.3.0软件进行统计学分析和绘图，计量资料采用x±s表示。两组间比较采用学生t检验分析。P < 0.05被认为差异有显著性意义。检验水准α=0.05(双侧)。该文统计学方法已经喀什地区第一人民医院生物统计学专家审核。

讨论

鉴于总人口的逐渐老龄化，绝经后骨质疏松症是一个日益增长的公共健康问题。这项研究鉴定了绝经后骨质疏松患者的异常表达基因，以及他们所参与的生物功能，进一步研究发现miR-100-5p和ZBTB7A mRNA在绝经后骨质疏松患者中的表达方向相反，因此ZBTB7A的表达可能受到了miR-100-5p的靶向调控。
差异表达基因的富集结果中发现了与骨质疏松相关的生物作用。与骨质疏松症相关的通路很多，主要涉及骨代谢、炎症反应、免疫反应、内分泌代谢和细胞凋亡[16]。过去几年的研究强调了骨和免疫系统之间在维持骨骼稳态方面存在巨大沟通[17-18]。骨免疫学领域的关键研究发现了核因子κB配体-骨保护素轴的受体激活剂，该途径在包括骨质疏松症在内的各种骨相关疾病的病理生理学中起着不可或缺的作用[19]。炎症打破了骨重建过程中的平衡，有利于通过破骨细胞进行骨吸收。骨骼对T细胞产生的肿瘤坏死因子α非常敏感，肿瘤坏死因子α也显示出与核因子κB配体协同促进破骨细胞生成[20]。阻断肿瘤坏死因子α已被用于治疗绝经后骨质疏松，显示出防止骨质流失的作用[21]。核因子κB途径的激活有助于破骨细胞成熟 [22]。骨稳态由成骨细胞和破骨细胞之间复杂的相互作用来维持和调节。研究表明，雌激素可以通过抑制破骨细胞活性来影响骨重建[23]。随后证明雌激素也负责抑制成骨细胞和基质细胞中的炎症递质[24]。此外，绝经和骨质疏松症之间的联系源于雌激素抑制细胞凋亡，从而增强间充质干细胞的成骨分化，在成骨细胞分化之前和之后促进成骨细胞，从而延长成骨细胞和骨细胞的寿命[25]。线粒体膜的通透性改变并释放内部凋亡因子，引起细胞凋亡，促进破骨细胞的分化[26]。因此，靶向调控这些生物作用可能是治疗骨质疏松的有效途径。
miRNAs失调与多种疾病有关，包括骨质疏松症。另外，miRNAs表达失调还可能与绝经后骨质疏松症妇女椎骨骨折的发生有关[27]。越来越多的miRNAs被鉴定为骨质疏松症的潜在治疗靶点或诊断生物标志物 [28-29]。miRNAs不仅与骨代谢紊乱有关，还能够调节骨髓间充质干细胞的成骨分化[30-31]。据报道，miR-100-5p与血管生成和骨生成密切相关[32]。VERDELLI等[33]将miR-100-5p描绘为与骨质疏松性骨折相关的miRNA。与此次实验结果一致，WANG等[34]通过绝经后骨质疏松症的RNA测序鉴定了miR-100-5p的上调表达。miR-100-5p也被报道用于骨组织工程[35]。此外，miR-101-3p的上调通过下调Dickkopf 1促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[36]，而miR-101-3p的下调促进骨髓来源巨噬细胞的破骨细胞分化作用[37]。
通过数据库的预测和双荧光素酶实验验证了miR-100-5p靶向调控ZBTB7A的表达。骨质疏松症的特征是骨吸收和骨生成之间的不平衡[38]。已有研究发现，miR-100 通过靶向调控ZBTB7A的表达参与骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞的骨再生缺陷 [39]。ZBTB7A通过调控NFATc1的表达来介导破骨细胞的分化[40]。ZBTB7A与基因组启动子和增强子的重要部分结合，包括核因子κB p65和多种其他转录因子的许多靶基因，进而调节通路活性[41]。ZBTB7A是一种多效性转录因子，其表达状态的异常对细胞存活是有害的。ZBTB7A可以挽救过早生长停滞及随后的衰老，并维持的细胞在增殖状态，上调细胞周期蛋白E的表达[42]。这些发现支持miR-100-5p在骨质疏松中上调靶向抑制ZBTB7A的表达，可能具有调控骨生成的作用。然而，还需要更多的研究来充分确定miR-100-5p与ZBTB7A相互作用并影响骨质疏松症进展的详细机制。
总之，绝经后骨质疏松症患者中miR-100-5p表达是上调的，而miR-101-3p和ZBTB7A表达是下调的。miR-100-5p通过靶向ZBTB7A，作为一种新的绝经后骨质疏松症潜在标志物的作用，代表了绝经后骨质疏松症治疗的新靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

has-miR-100-5p靶向含7A的锌指和BTB结构域是绝经后骨质疏松的潜在靶标

Has-miR-100-5p targeting zinc finger and BTB domain containing 7A is a potential target for postmenopausal osteoporosis

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