纯钛表面硅烷偶联剂复合氧化石墨烯涂层对施万细胞生物学行为的影响

doi:10.12307/2023.555

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (30): 4783-4789.doi: 10.12307/2023.555

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纯钛表面硅烷偶联剂复合氧化石墨烯涂层对施万细胞生物学行为的影响

徐星星，文超举，李英，孟茂花，王勤英，陈镜桥，董强

贵州医科大学口腔医学院/贵州医科大学附属口腔医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-08-11 接受日期:2022-10-14 出版日期:2023-10-28 发布日期:2023-04-01
通讯作者: 董强，博士，主任医师，博士生导师，贵州医科大学口腔医学院修复学教研室，贵州医科大学附属口腔医院修复种植科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:徐星星，女，1998年生，河南省许昌市人，在读硕士，主要从事口腔种植骨组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860192)，项目负责人：董强；贵州医科大学附属口腔医院口腔医学院科研基金(GYKQKY-2020-05号)，项目负责人：文超举

Effect of silane coupling agent composite graphene oxide coating on biological behavior of Schwann cells on pure titanium

Xu Xingxing, Wen Chaoju, Li Ying, Meng Maohua, Wang Qinying, Chen Jingqiao, Dong Qiang

School of Stomatology, Guizhou Medical University/Aﬃliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-08-11 Accepted:2022-10-14 Online:2023-10-28 Published:2023-04-01
Contact: Dong Qiang, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, School of Stomatology, Guizhou Medical University/Aﬃliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Xu Xingxing, Master candidate, School of Stomatology, Guizhou Medical University/Aﬃliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81860192 (to DQ); the Scientific Research Fund of Stomatological College of Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University, No. GYKQKY-2020-05 (to WCJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

硅烷偶联剂：硅烷偶联剂已逐渐被应用于钛金属的表面处理中。钛表面可以通过硅烷偶联剂预处理引入氨基等活性基团，从而为实现钛及钛合金表面的生物大分子的连接提供可能。研究表明这种共价连接的方式可能更加稳定。
氧化石墨烯：是一种高度氧化的石墨烯衍生物，其二维结构由单层和多个官能团组成，由于在同一平面上存在环氧基、羟基和羧酸官能团，具有良好的理化性质。研究表明氧化石墨烯具有成骨、抗菌及载药作用，并对种植体周围炎的治疗与预防也有一定作用。

背景：研究种植体表面处理时更看重是否能提高种植体骨结合的效率，而有关口腔种植体骨感知功能的研究则相对较少。
目的：探讨纯钛表面硅烷偶联剂共价连接氧化石墨烯涂层对体外施万细胞生物学行为的影响。
方法：在TA4钛片表面通过硅烷偶联剂的氨基基团共价连接制备不同质量浓度的氧化石墨烯涂层(0.25，0.5，0.75，1.0 mg/mL，分别命名为0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组、0.75-Ti-APTES-GO、1.0-Ti-APTES-GO组)，通过扫描电镜、拉曼光谱和接触仪对涂层的微观结构、成分及接触角进行表征。分别在光滑钛片、硅烷偶联改性钛片及不同质量浓度氧化石墨烯涂层改性钛片上培养大鼠施万细胞，采用CCK-8法检测各组施万细胞的增殖活性，RT-qPCR和Western blot检测钛片上施万细胞分泌神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子的能力。

结果与结论：①扫描电镜下可见，不同质量浓度的氧化石墨烯涂层呈云雾状，高质量浓度氧化石墨烯涂层呈现的云雾状突起更加致密；②与光滑钛片组相比，硅烷偶联改性组钛片表面接触角较小(P < 0.05)；随氧化石墨烯质量浓度的增加，钛片表面接触角逐渐变小，其中0.75-Ti-APTES-GO组、1.0-Ti-APTES-GO组组接触角小于光滑钛片组(P < 0.05)；③CCK-8实验显示，与光滑钛片组比较，硅烷偶联剂改性组、0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组细胞增殖无明显变化(P > 0.05)，0.75-Ti-APTES-GO组、1.0-Ti-APTES-GO组细胞增殖受到抑制(P < 0.05)，所以后续实验选择0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组；④RT-qPCR检测显示，0.5-Ti-APTES-GO组神经生长因子mRNA表达量高于其他3组(P < 0.05)；0.25-Ti-APTES-GO组胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达量低于其他3组(P < 0.05)，0.5-Ti-APTES-GO组胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达量高于光滑钛片组、硅烷偶联剂改性组(P < 0.05)；⑤Western blot检测显示，0.5-Ti-APTES-GO组神经生长因子蛋白表达量高于光滑钛片组、0.25-Ti-APTES-GO组(P < 0.05)，胶质细胞源性神经营养因子蛋白表达量高于其他3组(P < 0.05)；⑥结果表明，硅烷偶联剂复合0.5 mg/mL氧化石墨烯涂层有良好的生物相容性，能较好地促进纯钛表面施万细胞神经生长因子及胶质细胞源性神经营养因子的表达。

https://orcid.org/0000-0002-8772-9552 (徐星星)；https://orcid.org/0000-0001-8211-7138(董强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 纯钛表面, 氧化石墨烯, 硅烷偶联剂, 施万细胞, 骨感知, 神经营养因子

Abstract: BACKGROUND: The study of implant surface treatment pays more attention to whether it can improve the efficiency of implant osseointegration, while the study of oral implant bone perception function is relatively less.
OBJECTIVE: To investigate the effect of silane coupling agent covalently bonded graphene oxide coating on the biological behavior of Schwann cells in vitro.
METHODS: Different mass concentrations of graphene oxide coating (0.25, 0.5, 0.75, and 1.0 mg/mL, named as 0.25-Ti-APTES-GO group, 0.5-Ti-APTES-GO group, 0.75-Ti-APTES-GO, and 1.0-Ti-APTES-GO group) were prepared on the surface of TA4 titanium sheet by covalent bonding of amino groups of silane coupling agent. The microstructure, composition and contact angle of the coating were characterized by scanning electron microscopy, Raman spectroscopy and contact instrument. Rat Schwann cells were cultured on smooth titanium sheet, silane coupling modified titanium sheet and graphene oxide coating modified titanium sheet with different mass concentrations. The proliferation activity of Schwann cells in each group was detected by CCK-8 cell proliferation assay. RT-qPCR and western blot assay were used to detect the ability of Schwann cells to secrete nerve growth factor and glial cell-derived neurotrophic factor on titanium sheets.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that silane coupling agent composite with different concentrations of graphene oxide coatings were cloudy, and high concentration of graphene oxide coating appeared more dense cloudy protrusions. (2) Compared with the smooth titanium sheet group, the contact angle of the silane coupling agent film titanium group was smaller (P < 0.05). The contact angle of silane coupling agent composite graphene oxide coating became small with the increase of graphene oxide concentration. Among them, the contact angle of 0.75-Ti-APTES-GO group and 1.0-Ti-APTES-GO group was smaller than that of smooth titanium sheet group (P < 0.05). (3) In the CCK-8 cell proliferation assay, compared with the smooth titanium sheet group, there was no significant change in cell proliferation in silane coupling modified titanium sheet group, 0.25-Ti-APTES-GO group and 0.5-Ti-APTES-GO group (P > 0.05). Cell proliferation was inhibited in 0.75-Ti-APTES-GO group and 1.0-Ti-APTES-GO group (P < 0.05), so 0.25-Ti-APTES-GO group and 0.5-Ti-APTES-GO group were selected for subsequent experiments. (4) RT-qPCR exhibited that the expression of nerve growth factor mRNA in 0.5-Ti-APTES-GO group was higher than that in the other three groups (P < 0.05). The expression of glial cell-derived neurotrophic factor mRNA in 0.25-Ti-APTES-GO group was lower than that in other three groups (P < 0.05). The expression of glial cell-derived neurotrophic factor mRNA in 0.5-Ti-APTES-GO group was higher than that in smooth titanium sheet group and silane coupling modified titanium sheet group (P < 0.05). (5) Western blot assay exhibited that the expression level of nerve growth factor protein in the 0.5-Ti-APTES-GO group was higher than that in the smooth titanium sheet group and 0.25-Ti-APTES-GO group (P < 0.05), and the expression level of glial cell-derived neurotrophic factor protein was higher than that in the other three groups (P < 0.05). (6) The results indicated that silane coupling agent combined with 0.5 mg/mL graphene oxide coating had good biocompatibility and could promote the expression of Schwann cell nerve growth factor and glial cell-derived neurotrophic factor on pure titanium surface.

Key words: pure titanium surface, graphene oxide, silane coupling agent, Schwann cell, bone perception, neurotrophic factor

中图分类号:

徐星星, 文超举, 李英, 孟茂花, 王勤英, 陈镜桥, 董强. 纯钛表面硅烷偶联剂复合氧化石墨烯涂层对施万细胞生物学行为的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4783-4789.

Xu Xingxing, Wen Chaoju, Li Ying, Meng Maohua, Wang Qinying, Chen Jingqiao, Dong Qiang. Effect of silane coupling agent composite graphene oxide coating on biological behavior of Schwann cells on pure titanium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(30): 4783-4789.

图/表（结果） 7

2.1 各组钛片表面形貌扫描电镜下可见，SS组表面相对较光滑；Ti-APTES组表面可见棒状结构突起；0.25-Ti-APTES-GO、0.5-Ti-APTES-GO、0.75-Ti-APTES-GO、1.0-Ti-APTES-GO组钛片表面氧化石墨烯涂层均呈云雾状，且随着氧化石墨烯质量浓度的增加，云雾状的涂层更加致密，见图2。

2.2 各组钛片表面接触角检测 SS组、Ti-APTES组、0.25-Ti-APTES-GO、0.5-Ti-APTES-GO、0.75-Ti-APTES-GO、1.0-Ti-APTES-GO组钛片表面接触角分别为(68±1)°，(37±3)°，(74±1)°，(68±2)°，(60±1)°，(56±1)°，见图3。

检测结果显示，与SS组比较，Ti-APTES组接触角明显减少(P < 0.05)，0.25-Ti-APTES-GO组接触角增大(P < 0.05)；随着氧化石墨烯质量浓度的增加，钛片表面接触角逐渐减少，其中0.75-Ti-APTES-GO、1.0-Ti-APTES-GO组接触角小于SS组(P < 0.05)。
2.3 各组钛片表面成分检测拉曼光谱是对高拉曼强度的碳基材料有效的表征手段，一般来说，碳基材料的拉曼光谱在 1 350 cm-1及 1 580 cm-1附近处会有明显的 D峰和 G 峰。G 峰是石墨烯材料的主要特征峰，是由碳原子sp2轨道面内震动引起用于表征石墨烯样品中碳原子的层间堆垛方式。而D峰通常被认为是石墨烯的无序振动峰，用于表征石墨烯样品中的结构缺陷或边缘[15]。实验组中仅以0.5-Ti-APTES-GO为例，在1 592 cm-1和1 347 cm-1附近处可清楚地观察到2个特征峰的存在，分别属于氧化石墨烯的G峰和D峰[15]，表明氧化石墨烯涂层成功地制备在钛片表面；Ti-APTES、光滑钛片组无石墨烯类特征峰的存在，几乎呈一条直线，见图4。

2.4 各组钛片表面施万细胞增殖能力结果显示，与SS组相比，0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组细胞增殖无明显变化(P > 0.05)，0.75-Ti-APTES-GO组、1.0-Ti-APTES-GO组细胞增殖受到抑制(P < 0.05)，见图5。

综合考虑高质量浓度氧化石墨烯涂层(即0.75-Ti-APTES-GO和1.0-Ti-APTES-GO两组)对施万细胞增殖及细胞活力存在一定的细胞毒性，该作用原则上不符合临床医疗的要求。故后续实验探讨光滑钛片组、Ti-APTES、0.25-Ti-APTES-GO、0.5-Ti-APTES-GO组钛片表面对施万细胞分泌神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子的影响。
2.5 各组钛片表面施万细胞分泌神经生长因子与胶质细胞源性神经营养因子情况
2.5.1 RT-qPCR检测结果结果显示，Ti-APTES组神经生长因子mRNA表达量高于SS组、0.25-Ti-APTES-GO组(P < 0.05)，0.5-Ti-APTES-GO组神经生长因子mRNA表达量高于SS组、Ti-APTES组、0.25-Ti-APTES-GO组(P<0.05)，SS组与0.25-Ti-APTES-GO组神经生长因子mRNA表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6A。
0.5-Ti-APTES-GO组胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达量高于SS组、Ti-APTES、0.25-Ti-APTES-GO组(P < 0.05)，SS组、Ti-APTES组胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达量高于0.25-Ti-APTES-GO组(P < 0.05)，SS组、Ti-APTES组胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6B。

2.5.2 Western blot检测结果 Western blot检测结果显示，0.5-Ti-APTES-GO组神经生长因子蛋白表达量高于SS组、0.25-Ti-APTES-GO组(P < 0.05)，0.5-Ti-APTES-GO组胶质细胞源性神经营养因子蛋白表达量高于SS组、Ti-APTES组、 0.25-Ti-APTES-GO组(P < 0.05)，见图7。

2.6 氧化石墨烯涂层改性钛片的细胞相容性由CCK-8实验结果可知，0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组钛片具有良好的细胞相容性。

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引言

钛及钛合金由于其生物相容性等优点，在生物医学领域应用较为广泛。其中在口腔种植领域中，钛种植体支持的固定种植义齿目前被认为是天然牙的“最佳替代品”，然而，钛及钛合金材料固有的惰性且缺少刺激骨源性细胞生长和诱导的能力，这些都可能会导致种植失败。为了尽量减少种植体术后并发症，获得迅速而稳定的骨整合和提高种植体周围骨感知能力，许多学者开始研究种植体不同表面改性技术及其效果[1]。20世纪90年代，KLINGBERG提出经典的“骨感知”理论，使得骨结合与神经生理学有机结合。在缺乏牙周膜感受器的情况下，种植体周围的“骨感知”能有助于促进整个口腔运动觉的能力[2]。此外，有研究发现周围神经参与调节骨组织再生过程[3]。但种植体周骨感知能力仍较微弱，通常患者并不能有效感知咀嚼压力的精细变化，从而不能对过大或不利的咀嚼力进行及时有效的感知反馈和调节，这也是种植义齿出现机械并发症的主要原因之一，严重时也将造成种植体周围骨组织损伤。因此，对于维持种植体长期成功率以及不断提高患者生活质量，种植体周围神经再生的研究进展和突破将具有重要的临床意义。
种植表面改性通常是指采用物理、化学、生物等不同的方法去提高钛合金表面的生物相容性。研究发现，通过生物化学的方法可以获得最佳的表面特征[4]。然而，生物分子与钛合金表面不具有亲和性，这可以通过偶联剂的官能团与钛合金表面以及生物分子共价结合获得改善[5]。其中，有机硅烷偶联剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)经常被用于生物偶联技术中，它为材料表面提供末端-NH2活性基团，之后在偶联剂改性的材料表面共价连接生物分子。有研究表明，钛合金、偶联剂和生物分子之间的结合力较强，能在复杂动态变化的口腔环境中保持长期稳定[6]。氧化石墨烯具有成骨、抗菌、载药等作用[7-8]，将其用于种植体表面涂层可以显著促进骨整合的发生，也可以预防种植体周围炎的发生[7-10]。此外，石墨烯类也常被制备成复合凝胶材料或组织工程支架，应用于神经组织工程再生中[11]。其中，氧化石墨烯常被添加于复合水凝胶材料中，施加适当浓度的氧化石墨烯时，可促进施万细胞的黏附和增殖[12-13]。目前，尚未见有关纯钛表面硅烷偶联剂化学结合氧化石墨烯涂层对相关神经细胞作用的研究报道。
综上所述，此次实验采用自组装技术[14]，通过硅烷偶联剂改性TA4纯钛表面形成有机硅烷类自组装薄膜，将氧化石墨烯结合于偶联剂薄膜表面，通过化学涂层和生物化学物质共价结合的双重改性方式对钛片表面进行改性，并对其表面施万细胞的神经生长效应和影响机制进行初步研究，以期为实现和提高口腔种植体周骨感知能力提供一定的实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备与体外细胞学实验，组间比较进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年8月至2022年7月在贵州医科大学分子生物学重点实验室所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验材料与试剂 TA4级商业钛片(西安泰金工业)；硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(索莱宝)；单层氧化石墨烯溶液(南京先丰纳米)；大鼠施万细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)；胎牛血清(Biological Industeries，以色列)；青-链霉素、DMEM、含EDTA的胰蛋白酶(Gibcol，美国)；反转录试剂盒(上海奕杉)；PVDF膜(Millipore，美国)；CCK-8试剂盒(APEXBIO，美国)；Western及IP细胞裂解液(碧云天，中国)；兔来源多克隆神经生长因子抗体、兔来源单克隆胶质细胞源性神经营养因子抗体(华安生物，中国)。
1.3.2 主要仪器 CO2细胞培养箱(Sanyo，日本)；PCR仪、电泳仪(Bio-Rad，美国)；ECL化学发光成像仪(syngene，英国)；场发射扫描电镜(thermo scientific Apreo2C，美国)；激光共聚焦拉曼光谱仪Raman(赛默飞Dxr2xi，美国)；SL200系列接触角仪(上海棱伦)。
1.4 实验方法
1.4.1 钛片的预处理将TA4光滑钛片(直径10 mm、厚度1 mm)经过丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗10 min，烘干备用记为光滑钛片，命名为SS组。
1.4.2 钛片表面硅烷薄膜的制备将烘干备用的光滑钛片放入10 mol/L的 NaOH溶液中，60 ℃加热 24 h，纯钛表面引入羟基后[14]，用去离子水、无水乙醇反复清洗。烘干后再浸入含 3%3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液半小时，钛片表面的羟基与3-氨丙基三乙氧基硅烷水解后产生Si-OH 键结合形成氢键，之后又脱水形成Si-O-Ti共价键，使得氨基硅烷共价连接在钛片表面[14-15]，取出后用无水乙醇、去离子水反复清洗。烘干备用，记为Ti-APTES组。

1.4.3 氧化石墨烯涂层的制备将烘干后的硅烷偶联剂改性钛片分别浸入 0.25，0.5，0.75，1.0 mg/mL不同质量浓度梯度的氧化石墨烯溶液中，60 min后取出，钛片表面 3-氨丙基三乙氧基硅烷的终末氨基基团与氧化石墨烯的环氧基及羧基发生亲核取代反应及酰胺化作用结合[15]，氧化石墨烯通过硅烷偶联剂的共价连接结合于钛片表面，制备的氧化石墨烯涂层分别记为0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组、0.75-Ti-APTES-GO、1.0-Ti-APTES-GO组。纯钛表面硅烷偶联剂复合氧化石墨烯涂层的制备流程示意图，见图1。

1.4.4 钛片的表征检测
扫描电镜检测：分别在6组钛片表面喷洒一层薄的金钯膜，数秒后进行扫描电镜观察，放大倍率为1.00 μm。
接触角检测：采用静滴法评估不同改性钛片表面的亲水性。重新选择样品(每组3个)并充分干燥后，在距离样品表面约5 cm处滴加去离子水约10 μL，通过SL200系列接触角仪进行样品表面水接触角测量。
拉曼光谱检测：采用拉曼光谱对改性前后的钛片表面(光滑钛片、Ti-APTES、0.5-Ti-APTES-GO)成分进行表征检测，发射波长是633 nm，工作时间是10 s，测试波数范围为50-3 500 cm-1。
1.4.5 大鼠施万细胞的培养将大鼠施万细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的 DMEM高糖完全培养基中。待细胞生长至T25瓶90%左右时传代，取对数生长期的大鼠施万细胞，并按适当细胞密度接种于不同处理组的钛片上，进行后续实验。
1.4.6 CCK-8法测定细胞增殖情况通过紫外线照射6组钛片正反面各30 min进行消毒灭菌处理，使用无菌镊子将其转入至48孔板中。将大鼠施万细胞以1×107 L-1的细胞浓度接种于48 孔板中，每孔500 μL。培养第1，3，5天时，转移各组钛片于新的48孔板中，每孔加入500 μL含10%CCK-8 溶液的完全培养基，置于37 ℃的CO2培养箱中孵育 2 h，吸取100 μL的混合液转移至96孔板中，用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值。
1.4.7 不同处理钛片对施万细胞分泌神经营养因子的影响通过紫外线照射SS组、Ti-APTES组、0.25-Ti-APTES-GO组、0.5-Ti-APTES-GO组钛片正反面各30 min进行消毒灭菌处理，使用无菌镊子将其转入至48孔板中。将大鼠施万细胞以1×107 L-1的细胞浓度接种于48 孔板中，每孔500 μL。

RT-qPCR检测：培养第5天，收集细胞，提取总RNA。利用核酸分析仪检测各组RNA的浓度。反转录合成cDNA，置于-80 ℃保存备用。以β-actin作为内参基因，神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子作为目的基因，每组3个复孔，最后Ct值结果用相对定量法进行统计学分析。引物序列见表1。每组设3个复孔，独立实验重复3次。

Western blot检测：培养第5天，收集细胞，提取蛋白，之后用BCA法测定蛋白浓度，变性处理，采用Western blot检测神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子的蛋白表达水平。于10%的PAGE凝胶电泳分离，转膜用PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗兔来源多克隆神经生长因子抗体(1∶1 000)、兔来源单克隆胶质细胞源性神经营养因子抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，洗去多余一抗，加入HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000)，室温孵育1 h，洗去多余二抗，显影曝光。以β-actin作为内参，利用Image J软件进行数据分析。
1.5 主要观察指标 ①扫描电镜、接触仪和拉曼光谱对钛片进行表征检测；②CCK-8法检测大鼠施万细胞在不同处理组钛片表面的增殖情况；③RT-qPCR和Western blot检测不同处理组钛片对大鼠施万细胞分泌神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子的情况。
1.6 统计学分析应用 GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析并作图，以 P < 0.05为差异有显著性意义，所有实验至少重复3次。文章统计学方法已经贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

3.1 此次研究结果综上所述，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测探讨各组钛片表面对施万细胞分泌神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子的影响。RT-qPCR检测结果表明，Ti-APTES组神经生长因子基因表达要比光滑钛片组、0.25-Ti-APTES-GO组高，这可能与不同处理组钛片表面的形貌结构及化学成分有关。钛片表面硅烷偶联剂薄膜涂层(即Ti-APTES组)因暴露的氨基(−NH2)基团功能化表面所获得的正电荷，从而允许细胞和生物材料之间存在有利的静电相互作用；此外，亲水基团氨基也可以通过酰胺键与细胞表面跨膜蛋白共价相互作用，且Ti-APTES组亲水性较好，这对细胞生物学行为有一定的影响[16]。但目有关前硅烷化处理对天然生物材料尤其是具体生物反应的研究相对较少。而光滑钛片组、Ti-APTES组胶质细胞源性神经营养因子的基因表达量高于0.25-Ti-APTES-GO组。之前接触角检测实验表明，光滑钛片组、Ti-APTES组接触角小于0.25-Ti-APTES-GO组，接触角越大亲水性越差。王艳颖等[17]研究发现，亲水性表面比非亲水性表面更利于早期神经营养因子的蛋白分泌和基因表达。这可能是因为大量的血清蛋白会吸附到亲水性表面，对施万细胞的分泌功能起刺激作用，然而具体分子机制有待进一步深入研究。Western blot检测结果也有此类趋势，检测结果显示，0.5-Ti-APTES-GO组神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子蛋白表达量高于光滑钛片组、0.25-Ti-APTES-GO组，0.5-Ti-APTES-GO组胶质细胞源性神经营养因子蛋白表达量高于Ti-APTES组。先前也有研究表明，氧化石墨烯基材料已被用于促进周围神经再生的研究中，表现出良好的生物相容性和对周围环境的保护，并进一步改善人许旺样脂肪间充质基质细胞分泌神经生长因子和神经胶质源性神经营养因子[18]。
这可能归因于钛片表面氧化石墨烯涂层引入了-NH2、-COOH、-OH等亲水基团，表现出较好的亲水性[19]。亲水性表面有利于血清蛋白的吸附于材料表面[17]；此外，氧化石墨烯因其独特的空间结构对血清蛋白也具有较强的吸附能力，这可能对施万细胞的分泌功能也起到一定刺激作用[20]。
3.2 既往研究的贡献和存在的问题钛种植体表面处理(材料、成分和形貌结构)是影响种植体周围神经纤维再生的重要因素[21]。其中，YUAN等[22]比较光滑钛片组、喷砂酸蚀、钛等离子喷涂、羟基磷灰石涂层4种表面处理后对施万细胞增殖黏附及神经营养因子分泌的影响；王艳颖等[17]研究光滑钛片、喷砂酸蚀、大颗粒酸蚀喷砂3组钛片对施万细胞生物学行为的影响。以上研究主要集中在几种现有的不同处理的钛片组对于骨感知领域影响的对比研究。近年来，也有不少研究致力于开发一种能诱导周围神经再生的种植体表面涂层材料。ZHAO等[23]发现钛表面通过氨基等离子体增强化学气相沉积改性，可以促进施万细胞的黏附，而不具有细胞毒性，但这种修饰实际上抑制了施万细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子和神经生长因子；LAN等[24]通过在阳极氧化纯钛表面制备了TiO2纳米管，发现负载质量浓度为20 μg/mL米诺环素的二氧化钛纳米管可促进施万细胞增殖和神经营养因子的分泌；程景阳[25]利用微弧氧化与LiOH碱液处理技术制备载锂二氧化钛纳米复合涂层，该涂层对大鼠施万细胞有良好的生物活性。以上研究对材料制备的条件要求高，制作工艺较为复杂，促神经再生的效果差异较大。
3.3 此次研究区别于他人他篇的特点此次实验采用自组装技术[14]，利用有机硅烷偶联剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)对钛片表面进行预处理，通过硅烷偶联剂改性TA4纯钛表面形成有机硅烷类自组装薄膜。3-氨丙基三乙氧基硅烷具有3个烷氧基，可通过硅氧烷键与碱热处理后的钛片上羟基连接；在分子的另一边，氨基基团作为锚点，通过共价连接的方法使氧化石墨烯等分子物质进一步结合[26]。而且，氧化石墨烯上的环氧基、羧基等基团易与3-氨丙基三乙氧基硅烷的氨基反应形成稳定的共价键[27]；此外，共价键连接表现出比简单物理吸附化合物具有更强的稳定性[28]。在神经组织再生工程中，氧化石墨烯常被添加于复合支架和水凝胶材料中，在周围神经再生领域中有较大的应用前景[29-30]。在口腔种植领域中，氧化石墨烯也常被应用于种植体表面涂层，具有成骨和抗菌等作用[8-9]。而氧化石墨烯应用于种植体周围神经再生的研究较少，之前只有冯曦等[20]仅是简单涂布氧化石墨烯于喷砂酸蚀处理钛片表面，结果发现0.25 mg/mL 氧化石墨烯溶液制备的涂层表面促进施万细胞的增殖，但并未促进神经生长因子基因的表达。此次实验思路是鉴于硅烷偶联剂能引入氨基基团而获得稳定的共价连接[5]，综合考虑硅烷偶联剂及氧化石墨烯双重改性的特点和优势，设计将硅烷偶联剂共价连接氧化石墨烯制备成钛种植体表面涂层，体外培养和观察施万细胞神经再生效应的变化及作用机制，目前尚未见相关研究报道。
3.4 研究的局限性此次实验通过在碱热处理后的钛片上制备硅烷偶联剂薄膜以获得功能化的表面，借助硅烷偶联剂氨基反应位点共价连接氧化石墨烯对钛片表面进行二次修饰，并研究不同处理组钛片表面对施万细胞生物学行为产生的影响。CCK-8细胞增殖实验结果显示，与光滑钛片相比，Ti-APTES、0.25-Ti-APTES-GO和0.5-Ti-APTES-GO对施万细胞增殖无明显影响，而0.75-Ti-APTES-GO和1.0-Ti-APTES-GO对施万细胞增殖与细胞活力存在明显的抑制作用。综合考虑高质量浓度氧化石墨烯涂层对细胞产生的毒性作用，原则上不符合临床医疗的要求，故舍弃0.75-Ti-APTES-GO和1.0-Ti-APTES-GO两组。后续实验通过荧光定量PCR和Western Blot检测发现，0.5-Ti-APTES-GO组能有效促进施万细胞分泌神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。但0.5-Ti-APTES-GO与0.25-Ti-APTES-GO组在促进神经生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的表达中出现较大差异，这可能归因于钛片表面利用硅烷偶联剂共价连接不同质量浓度的氧化石墨烯涂层，将会引起材料表面形貌及亲水性能的改变，而且氧化石墨烯涂层表面粗糙和褶皱的形貌结构能够模拟细胞外基质的自然状态，且最佳含量的氧化石墨烯才具有良好拓扑结构性能，这对于进一步评估细胞活力和功能表达非常重要[31]。先前有研究表明，亲水性表面比非亲水性表面更利于早期神经营养因子的蛋白分泌和基因表达[17]。亲水性的氧化石墨烯分子在基准面和边缘上有大量的含氧活性基团——环氧基、羧基和羟基，它们通过共价键、静电吸附和氢键与细胞黏附相关蛋白连接相关，从而对细胞细胞生物学行为产生一定的影响[20，32]；此外，石墨烯及其衍生物具有特殊的空间结构，对粘连蛋白、血清蛋白等有较强的吸附性[32-34] ，这对施万细胞的分泌功能起刺激作用。研究发现氧化石墨烯涂层复合支架促进神经元及少突胶质细胞分化，与氧化石墨烯在整合素信号通路中上调这些下游分子的作用有关[34]，但目前促进施万细胞分泌神经营养因子的具体机制还需要深入研究。关于硅烷偶联剂处理的材料表面产生的具体生物学反应的研究相对较少，作用机制仍然也是未知的。此次实验是体外细胞水平的研究，缺乏动物体内实验的研究以进一步验证该涂层材料对种植体周围神经再生的影响效应。制作涂层工艺(如偶联剂最佳作用浓度)也有待进一步改善，后续研究还应进一步深入研究有关的作用机制和调节途径。
3.5 研究的重要意义口腔种植修复中种植义齿功能接近天然牙，但种植体周围组织没有牙周韧带及相关的Ruffini末梢，种植体的感觉阈值远高于天然牙，患者往往感觉不到施加在种植体上过大的咬合力，这可能会破坏周围骨组织。咬合超负载也是种植体周围炎和种植义齿机械并发症的重要危险因素之一[25]。因此，提高种植体周围的“骨感知”能力，对于维持种植体长期成功率以及提高患者生活质量具有重要临床意义。口腔种植体表面改性对于提高骨感知起到关键作用。有研究通过氨基硅烷连接剂与钛表面共价耦合，将骨涎蛋白和抗菌纳米复合材料应用于在牙科或骨科植入物上[35-36]，以此获得成骨、抗菌等性能。近年来有研究表明，氨基硅烷连接剂本身的修饰也可以促进成骨和细胞黏附[5，37-38]，具有良好的生物相容性。氨基硅烷在神经外科支架材料功能化的应用中也具有潜力。TAYLOR等[39]研究发现氨基表面改性可增强神经元细胞分化，支持神经元和施万细胞的活力。由此可见，硅烷偶联剂是一种较可靠和有效的表面改性技术。而氧化石墨烯具有优异的生物相容性、独特的空间结构和良好的抗菌性能，应用于种植体表面涂层时可以显著促进骨整合的发生和牙周附着，并对种植体周围病的治疗与预防有一定作用。
施万细胞与神经再生是密切相关的。其中在牙周韧带膜中，施万细胞在发育、维持和牙周Ruffini末梢再生中起着至关重要的作用，施万细胞可以分泌神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子等多种神经营养因子[40]。因此，此次实验采用施万细胞作为体外细胞模型来进行相关种植体周神经再生研究。神经生长因子具有滋养神经元和促进轴突生长的双重作用[41]，此外，神经生长因子还可以诱导种植体周早期骨整合的发生[42]。胶质细胞源性神经营养因子具有促进周围神经再生的潜能，其在牙周膜Ruffini末梢再生的最初、早期和成熟阶段也起着重要作用[40]。此次实验采用RT-qPCR和Western blot检测第5天各组钛片对施万细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子和神经生长因子 mRNA及蛋白的影响，钛表面0.5-Ti-APTES-GO涂层对目的细胞神经再生可能具有促进作用。研究表明，硅烷偶联剂复合0.5 mg/mL氧化石墨烯涂层对施万细胞具有良好的生物相容性，且能较好地促进纯钛表面施万细胞分泌神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子，提示该表面处理方法可能对提高口腔种植体周骨感知能力具有一定的临床应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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纯钛表面硅烷偶联剂复合氧化石墨烯涂层对施万细胞生物学行为的影响

Effect of silane coupling agent composite graphene oxide coating on biological behavior of Schwann cells on pure titanium

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