富血小板血浆干预膝关节骨性关节炎模型兔关节软骨和滑膜的改变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2594

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (14): 2205-2210.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2594

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富血小板血浆干预膝关节骨性关节炎模型兔关节软骨和滑膜的改变

邱皓，陈诗谋，翁政，朱云，刘盾，陈渝

重庆市第九人民医院创伤中心(骨科病区)，重庆市 400700

收稿日期:2019-07-10 修回日期:2019-08-21 接受日期:2019-10-24 出版日期:2020-05-18 发布日期:2020-03-15
通讯作者: 陈渝，博士，主任医师，重庆市第九人民医院创伤中心(骨科病区)，重庆市 400700
作者简介:邱皓，男，1991年生，重庆市人，汉族，2014年重庆医科大学毕业，硕士，主要从事创伤骨科的研究。
基金资助:
重庆市北碚区科学技术委员会科研项目(2018-8)

Platelet-rich plasma interferes with changes in articular cartilage and synovium of rabbits with knee osteoarthritis

Qiu Hao, Chen Shimou, Weng Zheng, Zhu Yun, Liu Dun, Chen Yu

Center for Traumatology, Ninth People’s Hospital of Chongqing, Chongqing 400700, China

Received:2019-07-10 Revised:2019-08-21 Accepted:2019-10-24 Online:2020-05-18 Published:2020-03-15
Contact: Chen Yu, MD, Chief physician, Center for Traumatology, Ninth People’s Hospital of Chongqing, Chongqing 400700, China
About author:Qiu Hao, Master, Center for Traumatology, Ninth People’s Hospital of Chongqing, Chongqing 400700, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Chongqing Beibei District Science and Technology Commission, No. 2018-8

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

富血小板血浆(PRP)：1993年Hood等首先提出富血小板血浆概念，并发现富血小板血浆含有丰富的血小板，其数目比全血中数目高3倍以上。血小板中含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子β、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子等。

Ⅱ型胶原纤维(COL Ⅱ)：胶原纤维是关节软骨基质的重要组成结构之一，其中含量最多的Ⅱ型胶原纤维是构成软骨的基本框架，具有维持关节软骨的形态结构和抗张力强度的功能。基质金属蛋白酶为Ⅱ型胶原纤维的特异性降解酶，其中基质金属蛋白酶13降解Ⅱ型胶原纤维的速度是基质金属蛋白酶1的10倍。

背景：研究显示富血小板血浆具有很强的促进软骨细胞修复和增生作用。

目的：探讨富血小板血浆在骨性关节炎中对软骨细胞修复及滑膜炎症抑制的疗效。

方法：新西兰大白兔40只，于兔耳中央动脉取血后采用Hokugo等的方法制备富血小板血浆，同时检测外周血及富血小板血浆的血小板、血小板衍生生长因子、转化生长因子β和血管内皮生长因子水平。采用前交叉韧带切断法来制作动物模型后随机将兔分为实验组和对照组，实验组双侧膝关节每周注射1次0.3 mL 富血小板血浆；对照组每周注射1次0.3 mL无菌生理盐水，共注射10周。注射后第2，4，6，8，10周对兔进行大体观察及膝关节组织学观察；检测关节软骨Ⅱ型胶原蛋白及基质金属蛋白酶13水平，并进行软骨组织Mankin评分。实验方案经重庆医科大学动物实验伦理委员会批准。

结果与结论：①富血小板血浆中血小板、血小板衍生生长因子、转化生长因子β和血管内皮生长因子水平分别是正常血中的5.5，4.8，7.7和6.2倍(均P < 0.05)；②注射后第6周实验组Mankin评分小于对照组(P < 0.05)；③实验组第4，6，8，10周时Ⅱ型胶原蛋白水平明显高于对照组(P < 0.05)；实验组第2，4，6，8，10周时基质金属蛋白酶13水平明显小于对照组(P < 0.05)；④结果表明，关节腔内注射富血小板血浆能通过缓解关节滑膜炎症及延缓甚至阻断软骨细胞的损伤来抑制骨性关节炎的进展。

ORCID: 0000-0001-6301-4790(邱皓)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 组织工程, 软骨缺损, 软骨细胞, 修复, 富血小板血浆, 骨性关节炎

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that platelet-rich plasma has a strong role in promoting chondrocyte repair and proliferation.

OBJECTIVE: To investigate the efficacy of platelet-rich plasma in chondrocyte repair and synovial inflammation inhibition in osteoarthritis.

METHODS: The blood samples were extracted from the central artery of the ear in 40 New Zealand white rabbits and platelet-rich plasma was prepared by the method of Hokugo. The platelet, platelet-derived growth factor, transforming growth factor-β, vascular endothelial growth factor in the peripheral blood and platelet-rich plasma were detected simultaneously. Animal models were made by resection of anterior cruciate ligament and divided into experimental group and control group. In the experimental group, 0.3 mL of platelet-rich plasma was injected once a week for 10 weeks; in the control group, 0.3 mL of sterile saline was injected once a week for 10 weeks. Gross observation and histological observation of knee joints were performed; articular cartilage type II collagen and matrix metalloproteinase 13 levels were measured; and Mankin score of the cartilage tissue was performed at 2, 4, 6, 8, and 10 weeks after injection. The study protocol was approved by the Animal Experiment Ethics Committee of Chongqing Medical University.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The concentrations of platelet, platelet-derived growth factor, transforming growth factor-β, vascular endothelial growth factor in platelet-rich plasma were 5.5, 4.8, 7.7, and 6.2 times those of the peripheral blood, respectively. And there were significant differences between the platelet-rich plasma and peripheral blood (P < 0.05). (2) From the 6^th week, the Mankin score of the experimental group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). (3) The expression of type II collagen protein in the experimental group was significantly higher than that in the control group at the 4^th, 6^th, 8^th and 10^th weeks after injection (P < 0.05). The expression of matrix metalloproteinase-13 was significantly lower than that in the control group at the 2^nd, 4^th, 6^th, 8^th and 10^th week (P < 0.05). All these findings indicate that intra-articular injection of platelet-rich plasma can inhibit the development of osteoarthritis by alleviating synovial inflammation and delaying or blocking the damage of chondrocytes.

Key words: biomaterials, cartilage biomaterials, tissue engineering, cartilage defects, chondrocytes, repair, platelet-rich plasma, osteoarthritis

中图分类号:

邱皓, 陈诗谋, 翁政, 朱云, 刘盾, 陈渝. 富血小板血浆干预膝关节骨性关节炎模型兔关节软骨和滑膜的改变[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(14): 2205-2210.

Qiu Hao, Chen Shimou, Weng Zheng, Zhu Yun, Liu Dun, Chen Yu. Platelet-rich plasma interferes with changes in articular cartilage and synovium of rabbits with knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(14): 2205-2210.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析一共40只新西兰大白兔，分为2组，所有实验动物均进入结果分析。

2.2 外周血及富血小板血浆中各生长因子水平比较结果显示富血小板血浆中血小板、血小板衍生生长因子、转化生长因子β和血管内皮生长因子的平均水平分别是外周血中各生长因子平均水平的5.5，4.8，7.7和6.2倍，结果显示差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 一般情况所有实验动物无死亡，实验动物双侧肢体无骨性关节炎以外的其他症状。

2.4 大体观察及组织学观察第2周，实验组及对照组双侧膝关节的软骨均出现软骨变薄、软化、色泽暗淡等现象。实验组动物的滑膜组织稍水肿并伴随炎性反应，局部可见少量绒毛样的组织形成；对照组可见水肿伴渗出的滑膜组织，局部可见大量绒毛样的组织形成，外观呈黄褐色，部分融合成肉芽肿结节，细胞数目增多伴肥大，滑膜全层均有巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润。

第4周，实验组动物的双侧膝关节软骨情况与第2周相似，对照组动物的双侧膝关节软骨可见糜烂及裂隙等现象。实验组动物的滑膜组织水肿较前缓解，局部仍可见绒毛样的组织，而对照组滑膜组织水肿明显伴渗出，可见炎性细胞浸润，滑膜表面可见血管翳样组织。

第6周，实验组软骨色泽较为暗淡，无裂隙等现象，对照组软骨色泽暗，可见糜烂、裂隙等现象。实验组动物的滑膜组织水肿比之间缓解明显，其中可见部分新生的血管，对照组滑膜组织明显水肿，有较多新生的血管及炎性组织，其中还可见纤维性沉积及血管翳样组织。

第8周，实验组软骨及滑膜组织情况较前仍好转，对照组软骨及滑膜组织情况仍较差。

第10周，实验组软骨色泽略暗淡，其他情况接近正常的软骨组织，对照组软骨色泽灰暗，出现糜烂及裂隙等现象。实验组滑膜组织接近正常滑膜组织，对照组滑膜组织水肿及渗出，出现大量炎性细胞浸润，滑膜组织表面有纤维性沉积及血管翳样组织形成。见图1，2。

2.5 免疫组织化学染色检测兔关节软骨基质金属蛋白酶13和Ⅱ型胶原蛋白水平实验组第2，4，6，8，10周时基质金属蛋白酶13水平显著低于对照组(P < 0.05)。实验组间第2周和第4周之间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，其余各时间点之间的比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。对照组第2周和第4周之间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，其余各时间点之间的比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。见表2。

实验组第4，6，8，10周的Ⅱ型胶原蛋白水平均显著高于对照组(P < 0.05)，第2周两组间Ⅱ型胶原蛋白水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组组内比较，第2，4周间和第4，6周间差异无显著性意义(P > 0.05)，其余各时间点之间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。对照组组内各时间点之间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。见表3。

2.6 软骨组织Mankin评分实验组和对照组第6，8，10周时的Mankin评分比较差异有显著性意义(P < 0.05)，而第2周和4周时2组之间的Mankin评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组内比较，第2周和第4周比较差异无显著性意义(P > 0.05)，其他各时间点比较差异有显著性意义(P < 0.05)。对照组组内各时间点比较均差异均无显著性意义(P > 0.05)。见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组动物实验。

1.2 时间及地点 2018年6月至2019年2月在重庆医科大学动物实验室完成。

1.3 材料共40只新西兰大白兔，兔龄4-6个月，体质量2.5-3.0 kg，雌雄不限，由重庆医科大学动物中心提供，SCXK(渝)2012-0001。免疫组织化学、番红O-固绿及血小板衍生生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子检测ELISA试剂盒(基尔顿生物科技(上海)有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 富血小板血浆的制备及检测采用HOKUGO等^[21]方法制备富血小板血浆，从耳缘静脉注射戊巴比妥钠(1 mL/kg)将40只兔进行麻醉，然后从大白兔耳背中央动脉取血20 mL，与枸橼酸钠抗凝剂(全血与抗凝剂比例约为1∶9)充分混合后转移到无菌离心管(15 mL)中；先从中抽取20 μL进行全血细胞计数，然后将动脉血进行离心(转速2 400 r/min，10 min)，吸取离心之后动脉血的全部上清液，将剩下部分再次进行离心(3 600 r/min，10 min)，然后吸取离心之后的3/4上清液，剩下的部分则为富血小板血浆。通过ELISA法分别检测富血小板血浆和正常血中各生长因子的浓度(包括血小板、血小板衍生生长因子、转化生长因子β和血管内皮生长因子等)。

1.4.2 制备动物模型采取前交叉韧带切断法来制作膝关节骨性关节炎的动物模型。将40只兔进行全身麻醉，对兔双侧后腿膝关节进行常规备皮及消毒，在膝关节内侧作切口，首先切开皮肤及皮下组织，依次切开筋膜层，再切开关节囊，后使髌骨向外侧脱位，然后将膝关节屈曲，暴露前交叉韧带并切断，仔细冲洗关节腔后将复位髌骨，逐层对位缝合切口。

1.4.3 动物分组造摸成功后1周，采取完全随机的分组方法，将实验动物分为实验组(20只兔)和对照组(20只兔)，实验组：于兔双侧膝关节每周注射1次0.3 mL 富血小板血浆，共10周；对照组：于兔双侧膝关节每周注射1次0.3 mL无菌生理盐水，共10周。从第1次注射开始记录，在第2，4，6，8，10周分别对每只兔进行观察。

1.4.4 检测指标

(1)一般情况：制作模型及进行实验后，分别观察兔的存活情况以及双侧膝关节皮温、颜色及肿胀情况等。

(2)大体观察、Ⅱ型胶原蛋白及基质金属蛋白酶13阳性面积测定：各时间点两组分别随机取4只兔，处死兔子(麻醉后利用空气栓塞法)，切开皮肤及皮下组织，暴露膝关节腔，在取材之前先进行大体观察，主要观察股骨内髁及外髁关节软骨大体情况(如光滑程度、色泽、滑膜增生情况及质地等)。在距股骨内髁后缘约3 mm处去标本(宽约2 mm)，此点为后方负重区。取标本时将关节软骨及软骨下骨同时取下，然后将关节软骨仔细剥离，避免因残留软骨下骨而影响结果的准确性。然后将标本放在体积分数4%甲醛中固定，标本固定好之后用流水冲洗干净，然后浸蜡并石蜡切片，每片厚4-7 μm，进行免疫组织化学染色，最后进行图像采集和分析，通过显微镜拍照计算阳性面积。

(3)组织学观察及软骨组织Mankin评分：使用上面的方法来制作石蜡切片，进行番红-固绿染色，在电子光镜下观察软骨的修复情况，采用Mankin评分对软骨进行评分^[23]。并将膝关节内的滑膜组织放置于中性甲醛中固定，然后将标本进行石蜡切片(厚4-7 μm)，再进行苏木精-伊红染色，在光镜下进行组织学观察，观察内容包括细胞浸润、组织增生和血管生长等情况。

1.5 主要观察指标 ①外周血及富血小板血浆中各生长因子浓度比较；②兔一般情况观察；③大体观察及组织学观察；④Ⅱ型胶原蛋白及基质金属蛋白酶13阳性面积测定；⑤软骨组织Mankin评分。

1.6 统计学分析统计学分析软件采用SPSS 23.0。计量资料用x(_)±s表示，采用独立样本t 检验的方法进行比较两组之间同一时间点的差异，采取方差分析的方法进行比较组内不同时间点之间的差异，采取SNK检验比较两两之间的差异；α=0.05为检验水准。

讨论

骨性关节炎是一种以关节软骨变性和丢失及关节边缘和软骨下骨骨质再生为特征的慢性关节炎疾病。前交叉韧带切断法通过破坏膝关节稳定性诱导骨关节炎的发生，因其创伤较小，对生理结构影响少，能够较全面反映骨关节炎病理进程，近年来成为了应用较多的骨关节炎动物模型制备方法。STOOP等^[22]研究发现在切断大鼠的膝关节前交叉韧带后，关节软骨损害最早发生于表层软骨细胞和基质，表现为表层带纤维化及软骨细胞数量减少，且随时间进展，术后10周时上述改变更加明显。因此，此次研究选择以切断前交叉韧带建立兔膝关节骨性关节炎模型，模型均顺利制备成功。

滑膜为关节囊的内层，由疏松结缔组织组成，能够分泌滑液营养和润滑关节软骨，在关节活动中起重要作用。滑膜炎症在骨性关节炎的发展机制中扮演着重要的角色，且滑膜炎症严重程度与骨性关节炎的进展呈相关性^[24-25]。滑膜组织在发生炎性反应时，可出现充血、水肿和中性粒细胞浸润等现象；同时滑膜的血管扩张，血浆和细胞外渗从而导致大量渗出液，渗出液中含有红细胞、白细胞、粘液素和纤维素等，若未及时处理，滑膜炎症反应可转为慢性，表现为淋巴细胞和浆细胞浸润，滑膜组织可见纤维性沉积及血管翳样组织。此次研究的组织学结果显示实验组在进行两三次关节腔注射富血小板血浆后，滑膜炎症即得到缓解；组织学观察显示，第10周时的滑膜组织已接近正常滑膜组织；而对照组则无明显改善，且滑膜炎症反应向慢性转变，至第10周时滑膜组织可见大量炎性细胞浸润，表面有纤维性沉积及血管翳样组织形成。

Mankin评分由MANKIN等^[23]于1971年首次提出，它从整体结构、细胞结构、番红染色、潮线完整性等4个方面进行评分，最高分14分，最低分0分，分值越低代表软骨组织情况越好。此次研究结果显示滑膜组织Mankin评分自第6周起，实验Mankin评分明显小于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。组织学观察及Mankin评分均提示富血小板血浆具有修复关节软骨的作用。

胶原纤维是关节软骨基质的重要组成结构之一，其中含量最多的胶原纤维为Ⅱ型胶原纤维有维持关节软骨形态结构等功能。基质金属蛋白酶为Ⅱ型胶原纤维的特异性降解酶，其中基质金属蛋白酶13降解Ⅱ型胶原纤维的速度是基质金属蛋白酶1的10倍，可加速软骨基质的降解，促进软骨退变^[26]。此次研究结果显示实验组第4，6，8，10周时Ⅱ型胶原纤维阳性面积明显大于对照组，且实验组随着时间的增加，Ⅱ型胶原纤维阳性面积逐渐增大，对照组随着时间的增加，Ⅱ型胶原纤维阳性面积逐渐减小。结果还显示第2，4，6，8，10周时基质金属蛋白酶13阳性面积明显小于对照组，且实验组随着时间的增加，基质金属蛋白酶13阳性面积逐渐减小，对照组随着时间的增加，基质金属蛋白酶13阳性面积逐渐增大。提示富血小板血浆具有修复关节软骨的作用。

富血小板血浆中除了含有大量的血小板外，还含有多种生物活动蛋白质和生长因子，如转化生长因子β、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1等^[27-28]，这些生长因子在软骨组织修复中具有重要作用^[28-29]。另有多项研究证实，富血小板血浆能显著刺激关节软骨细胞增殖和胶原合成，改善骨性关节炎的临床症状^[30]。SPREAFICO等^[31]研究发现富血小板血浆释放物能促进人关节软骨细胞增殖，SOX-9蛋白和聚集蛋白聚糖水平随着实验时间的延长不断增加，提示软骨细胞发生了再次增殖，富血小板血浆能显著诱导软骨细胞在增殖过程中分泌多种蛋白。PETTERSSON等^[32]将富血小板血浆作为诱导物在明胶微载体模型上培养人关节软骨细胞，证实富血小板血浆能促进软骨细胞增殖和基质形成。ANGOORANI等^[33]对54例膝关节骨性关节炎患者进行了一项随机对照实验，结果显示关节腔内注射富血小板血浆是一种安全、有效的方法。MEHEUX等^[34]对膝关节骨性关节炎患者关节腔内注射富血小板血浆的有效性进行系统评价，结果显示关节腔内注射富血小板血浆能够显著改善膝关节骨性关节炎患者的临床症状。

通过研究并结合文献，作者认为富血小板血浆在软骨损伤修复方面具有以下优点：首先，富血小板血浆可释放多种可促进软骨组织修复的生长因子，它们之间具有很好的协同作用，每种生长因子都具有生物学效应，各生长因子之间相互作用又能更大的发挥其功能。此次实验相关结果表明，富血小板血浆中多种生长因子的浓度均高于外周血。作者认为：在动物实验中，富血小板血浆能够明显促进软骨组织的修复。其次，富血小板血浆的制作方法简单，且快捷，制作时间一般在半小时以内，并且目前已有仪器来专门制作富血小板血浆。

综上所述，作者认为关节腔内注射富血小板血浆能通过缓解关节滑膜炎症及延缓甚至阻断软骨细胞的损伤来抑制骨性关节炎的进展，能在一定程度上缓解骨性关节炎的临床症状。此结论仅为动物实验阶段的结论，不作为临床研究的结论，且由于此次研究样本量较小，存在一定的局限性，所以今后仍需要大量相关高质量的实验研究来验证上一结论。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板血浆干预膝关节骨性关节炎模型兔关节软骨和滑膜的改变

Platelet-rich plasma interferes with changes in articular cartilage and synovium of rabbits with knee osteoarthritis

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