骨形态发生蛋白9诱导成骨机制及其临床应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1839

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (33): 5404-5412.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1839

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骨形态发生蛋白9诱导成骨机制及其临床应用

朱正清，陈香润，贾方腾，黄岚峰

吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041

修回日期:2019-06-15 出版日期:2019-11-28 发布日期:2019-11-28
通讯作者: 黄岚峰，主任医师，教授，硕士生导师，吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041
作者简介:朱正清，男，1994年生，汉族，吉林大学第二医院骨科在读硕士，主要从事骨组织工程细胞因子及骨缺损的临床治疗研究。
基金资助:
吉林省财政厅卫生专项项目(201817294302)，项目负责人：黄岚峰

Bone morphogenetic protein 9: osteogenic induction mechanism and clinical application

Zhu Zhengqing, Chen Xiangrun, Jia Fangteng, Huang Lanfeng

Department of Orthopedics, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China

Revised:2019-06-15 Online:2019-11-28 Published:2019-11-28
Contact: Huang Lanfeng, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China
About author:Zhu Zhengqing, Master candidate, Department of Orthopedics, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China
Supported by:
the Health Special Project of Jilin Provincial Finance Department, No. 201817294302 (to HLF)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein，BMP9)：也被称为生长分化因子2，其基因最初是从胎鼠肝脏cDNA文库中分离出来的。骨形态发生蛋白9参与调节细胞的增殖、分化和凋亡，其不仅能调节细胞内皮功能和促进血管生成，还能诱导成骨，在脊椎动物和无脊椎动物的各种组织的发育和维持中起着关键的作用。研究表明骨形态发生蛋白9与能够诱导成骨的骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7相比，具有更强的成骨诱导能力。
WNT通路：在骨骼发育和成骨细胞分化中起着重要作用，是调节骨骼系统发育的另一个重要信号通路。其可能参与调节骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白9诱导的成骨作用。WNT通路分为经典WNT通路和非经典WNT通路。

摘要
背景：骨形态发生蛋白9作为成骨诱导生长因子已经被证实为骨形态发生蛋白家族中成骨能力最强的生长因子。
目的：探讨骨形态发生蛋白9的诱导成骨机制及其应用的研究进展。
方法：作者在Web of Science、PubMed、万方、中国知网中以“bone morphogenetic protein9/BMP9，bone ingrowth，bone tissue engineer，osteogenic differentiation”；“骨形态发生蛋白9，细胞因子”为关键词，检索1989年至2019年期间的文献。排除无关及重复文献，详细地进行分析与综述。
结果与结论：目前为止，骨形态发生蛋白9已经被证实是14种骨形态发生蛋白家族中在体外和体内诱导间充质干细胞成骨分化方面最有效的生长因子之一，并且，骨形态发生蛋白9在骨与软骨损伤的修复过程及促进成骨分化当中扮演着重要的角色。骨形态发生蛋白9也被称为生长分化因子2，其诱导成骨分化机制非常复杂，其信号传导通路涉及到了各种成骨信号通路，各种生长调控因子也参与进骨形态发生蛋白9诱导成骨的全部过程，且其成骨机制与其他骨形态发生蛋白家族成员的成骨机制具有差异。在各种动物实验中，骨形态发生蛋白9可以促进骨折的愈合、软骨的生成、脊柱融合等。因此，骨形态发生蛋白9在应用基础研究中具有非常大的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0109-1771(朱正清)

关键词: 骨形态发生蛋白9, 骨诱导, 骨再生, 骨长入, 成骨分化, 间充质干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 9 has been proven to be the strongest osteogenic growth factor in the bone morphogenetic protein family.
OBJECTIVE: To explore the research progress of bone morphogenetic protein 9 induced osteogenic mechanism and its application.
METHODS: Web of Science, PubMed, WanFang and CNKI were searched using “bone morphogenetic protein9/BMP9, bone ingrowth, bone tissue engineering, osteogenic differentiation, cytokines” as key words for relevant articles published from 1989 to 2019. A comprehensive analysis and review was performed after removal of irrelevant and repetitive literature.
RESULTS AND CONCLUSION: To date, bone morphogenetic protein 9 has been shown to be one of the most potent growth factors for inducing the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in vitro and in vivo in the 14 bone morphogenetic protein family members. Moreover, bone morphogenetic protein 9 plays an important role in the repair of bone and cartilage damage and in promoting osteogenic differentiation. Bone morphogenetic protein 9 is also known as growth differentiation factor 2, and its mechanism underlying osteogenic induction is very complicated. Its signaling pathway involves various osteogenic signaling pathways, and various growth regulators are also involved in the entire osteogenic induction by bone morphogenetic protein 9. The osteogenic mechanism of bone morphogenetic protein 9 is different from the osteogenesis mechanism of other bone morphogenetic protein family members. In animal experiments, bone morphogenetic protein 9 can promote fracture healing, cartilage formation, and spinal fusion. Therefore, bone morphogenetic protein 9 has a great potential in basic research.

Key words: bone morphogenetic protein 9, osteogenic induction, bone regeneration, bone ingrowth, osteogenic differentiation, mesenchymal stem cells

中图分类号:

朱正清，陈香润，贾方腾，黄岚峰. 骨形态发生蛋白9诱导成骨机制及其临床应用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(33): 5404-5412.

Zhu Zhengqing, Chen Xiangrun, Jia Fangteng, Huang Lanfeng. Bone morphogenetic protein 9: osteogenic induction mechanism and clinical application[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(33): 5404-5412.

图/表（结果） 1

2.1 骨形态发生蛋白9的基本特征 骨形态发生蛋白最初被发现是作为骨提取物中的骨诱导成分，目前已经发现其在各种器官及组织(包括骨、软骨、肌肉、肾脏和血管)的生长和发育过程中发挥重要作用。骨形态发生蛋白是转化生长因子β家族的成员，其通过Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸-苏氨酸激酶受体及其细胞内的下游效应器(包括SMAD蛋白)传递信号。骨形态发生蛋白家族的配体在胚胎发育和保持体内环境稳定的多种过程中起着重要的作用，它通过调节细胞的形态发生、谱系结合、分化、增殖和凋亡，在全身各个类型的细胞中发挥着至关重要的作用^[15-16]，并已被证明能调节干细胞增殖和成骨分化^[17-19]。在过去的几十年中，研究人员研究了骨形态发生蛋白9与成骨细胞分化有关的几种调控途径，如经典WNT信号通路、胰岛素生长因子2(IGF2)/PI3K/AKT信号通路、类维生素A(RAs)信号通路、Notch信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路等^[20-24]，转录因子、染色质结构修饰剂和骨形态发生蛋白等信号分子在成骨分化过程中起着关键性作用^[25-27]。人类中被鉴定的骨形态发生蛋白至少有15种，部分成员是有效的骨诱导因子,如骨形态发生蛋白2、4、6、7和9^[28-32]。骨形态发生蛋白的配体、各种受体之间的关系见表1。

骨形态发生蛋白9(也称为生长分化因子2；GDF2)其基因首先在发育中的胎鼠肝脏cDNA文库中被鉴定出来^[33]，骨形态发生蛋白9还被证明在诱导和维持胚胎基底前脑胆碱能神经元的胆碱能表型中发挥作用^[29]，其抑制肝糖原生成及抑制诱导脂代谢关键酶的表达^[3⁰^]，调节内皮功能和血管生成^[31]。此后被认为是最具骨诱导分化能力的骨形态发生蛋白之一^[3⁴^-3⁶^]，其比骨形态发生蛋白2更具有骨再生潜力，同时也是血管生成和软骨生成的主要调节剂^[^6，¹⁴^，³⁷^]。骨形态发生蛋白9调节一组独特的下游靶点，这些靶点可能在调节骨形态发生蛋白诱导的骨髓间充质干细胞分化中发挥作用^[³⁸^-4⁰^]。人的骨形态发生蛋白9位于10q11.22染色体上，它的前体蛋白包括了428个氨基酸残基，其氨基酸序列中有50%-55%与骨形态发生蛋白2、4、5、6、7、8相同^[4¹^-4²^]。然而，作为研究最少的骨形态发生蛋白之一，骨形态发生蛋白9诱导成骨分化的机制及其传导的重要介质仍有待充分阐明。

2.2 骨形态发生蛋白9成骨作用的经典信号通路

2.2.1 Notch信号通路 Notch是一种跨膜蛋白，其信号通路在决定细胞分化和细胞生长发育过程中具有至关重要的作用。且Notch信号是骨形成的一个重要调节器^[4³^]。Notch信号传导通路广泛存在于脊椎动物及无脊椎动物多个物种，并且参与调控一系列生理过程中的生命相关活动，包括细胞分化，增殖，凋亡，上皮间质转化，血管生成，细胞迁移和黏附等^[4⁴^]。

脊椎动物有4种Notch受体蛋白(Notch1-4)和5种Notch配体蛋白(Delta1，3，4和Jagged1，Jagged2)^[4⁵^{- 4}⁷^]，均为单次跨膜蛋白。Notch信号通过与Notch受体结合的配体、Notch胞外结构域的顺序蛋白水解酶和释放Notch胞内活性结构域(The Active Intracellular Domain，NICD)激活，且NICD是Notch信号的功能部分^[4^3，48^]。Cui等^[⁴⁹^]研究了Notch信号在介导骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化是必要的，他们通过过度表达NICD突变体和Notch配体，证明了骨形态发生蛋白9在成骨分化的中间阶段激活Notch信号，并且Notch信号对于骨形态发生蛋白9在间充质干细胞中诱导的有效骨形成是必需的。Cao等^[5⁰^]研究了Notch信号在骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化中的作用。他们采用了一种γ-分泌酶复合物抑制剂DAPT来抑制间充质干细胞的Notch活性。此外，通过碱性磷酸酶染色和活性测定，发现骨形态发生蛋白9诱导的碱性磷酸酶活性被DAPT显著抑制。这些数据表明，Notch信号增强了骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞早期成骨分化。不管是在体外还是体内，Notch信号传导通路的增强都能明显提高骨形态发生蛋白9的成骨分化能力。Notch信号增强了骨形态发生蛋白9诱导的BMP/SMAD信号的活性，增加了骨形态发生蛋白9诱导的骨形成因子在间充质干细胞中的基因表达，如RUNX2、Cola1等。Notch信号还可促进骨形态发生蛋白9诱导的活化素样激酶2(ALK2)的表达，在骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化过程中，Notch在介导骨形态发生蛋白9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化中起着重要作用，其部分调控可能是通过上调ALK2来调控的^[5¹^]。

骨形态发生蛋白9在成骨分化的中间阶段上调了Notch受体和配体的表达，Notch受体释放NICDⅠ显著增强了骨形态发生蛋白9诱导的体内外成骨分化。当骨髓基质细胞受到骨形态发生蛋白9和NICDⅠ的刺激时，可形成骨强度更高骨形态更成熟的骨，并在骨周围形成广泛的血管化。骨形态发生蛋白9和NICDⅠ上调了体外永生化多能脂肪源（Immortalized Multipotent Adipose Derived，IMAD）间充质干细胞和异位骨组织中血管生成的表达。因此，骨形态发生蛋白9和Notch信号通路的同时激活能有效地促进骨髓间充质干细胞的成骨和周围血管的生成^[5²^]。

2.2.2 WNT信号通路 WNT通路在骨骼发育和成骨细胞分化中起着重要作用，是调节骨骼系统发育的另一个重要信号通路^[5³^-5⁶^]。其可能参与调节骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白9诱导的成骨作用。WNT通路分为经典WNT通路和非经典WNT通路。研究表明，骨形态发生蛋白9可以激活经典WNT/β-catenin信号，敲除β-catenin能明显降低骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白9的成骨潜能^[5⁷^]。然而，WNT非经典途径与骨形态发生蛋白9成骨潜能之间的关系尚不清楚。

WNT11是非经典WNT通路的配体之一，也参与了骨骼系统的发育。WNT11的过度表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力^[⁵⁸^]。从机制上讲，WNT11可能以依赖β-catenin的方式促进成骨细胞成熟和分化^[⁵⁹^]。一项研究发现，骨形态发生蛋白9上调了小鼠间充质干细胞系(C3H10T1/2)细胞中的WNT10b，Wnt10b增加了C3H10T1/2细胞中骨形态发生蛋白9诱导的成骨标志物和骨形成趋势，而沉默WNT10b则降低了骨形态发生蛋白9的这些成骨表达作用。WNT10b提高了骨形态发生蛋白9诱导的Smad1/5/8磷酸化水平，同时可以通过沉默WNT10b而降低骨形态发生蛋白9诱导的磷酸化水平；并且，WNT10b抑制了骨形态发生蛋白9诱导分化的成脂标志物。进一步分析表明，骨形态发生蛋白9上调了环氧化酶2和磷酸化水平。表明了WNT10b可促进骨髓基质细胞中骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化，这可能通过增强BMP/SMAD信号和降低脂肪分化信号来介导^[6⁰^]。

Tang等^[6¹^]发现Wnt3A和骨形态发生蛋白9都能有效地诱导碱性磷酸酶活性，并增强了彼此在间充质干细胞中诱导碱性磷酸酶活性的能力, 骨钙素和骨桥蛋白是晚期成骨的特征性标志物^[12^，⁶²^], 稳定β-catenin的过度表达使RUNX2诱导的骨钙素表达量增高。相反，沉默β-catenin表达导致骨形态发生蛋白9刺激的骨钙素表达量急剧下降，定量PCR进一步证实β-catenin表达的下调抑制了C3H10T1/2细胞中骨形态发生蛋白9诱导的晚期成骨标志物骨钙素和骨桥蛋白的表达。Tang等^[6¹^]发现β-catenin表达的下调，能有效地抑制C3H10T1/2细胞和MEFs细胞中骨形态发生蛋白9诱导的体外成骨作用，这些结果表明，典型的WNT/β-catenin信号可能在调节骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化的早期和晚期发挥重要作用。Yuan等^[6³^]研究表明局部粘着斑激酶(FAK)和骨形态发生蛋白9在WNT信号通路上相互作用，促进脂肪间充质干细胞成骨。FAK可通过WNT信号途径而非SMADs信号参与骨形态发生蛋白9诱导的脂肪源性干细胞成骨。Zhang等^[6⁴^]研究了Wnt/β-catenin信号对牙尖乳头干细胞成骨/成牙分化的影响，以及β-catenin在介导骨形态发生蛋白9和Wnt3A对成骨/成牙分化的协同作用中的作用。他们发现wnt3a诱导牙尖乳头干细胞中形成早期成骨标志物碱性磷酸酶，这可以被β-catenin敲除而显著降低。尽管Wnt3A和骨形态发生蛋白9增强了彼此在牙尖乳头干细胞中诱导碱性磷酸酶活性的能力，但抑制β-catenin却显著降低了骨形态发生蛋白9诱导的成骨/成牙细胞分化，沉默β-连环蛋白导致骨形态发生蛋白9诱导的骨钙素和骨桥蛋白表达减少，体内干细胞植入实验显示，骨形态发生蛋白9和Wnt3A刺激的牙尖乳头干细胞表现出更成熟和高度钙化的骨小梁形成。然而，牙尖乳头干细胞中β-catenin的敲除显著抑制了体内BMP9/Wnt3A诱导的异位骨形成。这些结果强烈表明β-catenin可能在骨形态发生蛋白9诱导的骨/软骨信号传导中起重要作用，骨形态发生蛋白9和Wnt3A可能协同诱导牙尖乳头干细胞的成骨/成牙细胞分化。

2.2.3 丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(mitogen activated protein kinases，MAPKs) MAPKs信号通路是细胞将细胞外信号转导至细胞内引起细胞应答的一类重要信号转导系统。骨形态发生蛋白9和转化生长因子β在间充质干细胞诱导成骨细胞转化过程中具有协同作用。Li等^[6⁵^]研究了TGF-SMAD与BMP-MAPK的相互作用，骨形态发生蛋白9单独诱导间充质干细胞分化为成骨细胞，并增强p38细胞外受体激酶和JNK(另一个重要的MAPKs成员)的磷酸化。

JNK是转化生长因子β家族的一员，并且已经被证实能在SMAD独立途径中被转化生长因子β快速激活。单纯转化生长因子β并不能诱导成骨分化，但能增强骨形态发生蛋白9的成骨诱导作用。他们用JNK激酶阻滞剂处理细胞后，碱性磷酸酶水平没有变化，而骨桥蛋白和Ⅰ型胶原的表达显著降低。由于碱性磷酸酶与早期成骨分化相对应，Ⅰ型胶原和骨桥蛋白代表晚期分化，因此提示BMP9-JNK通路可促进晚期成骨。在此过程中，SMAD的激活导致MAPK通路中JNK通路的激活，骨形态发生蛋白9通过MAKP途径诱导间充质干细胞分化成骨，而转化生长因子β通过SMAD-JNK途径促进骨形态发生蛋白9的增强。其实验结果提示，除了经典的BMP9-Smad1/4/5/9途径外，这种诱导作用可能与骨形态发生蛋白9激活MAPK途径有关。BMP9-JNK通路是最重要的诱导通路，在间充质干细胞晚期成骨分化中起着重要作用。Wang等^[6⁶^]通过腺病毒表达小干扰RNA (siRNA)靶向JNK(AdR-si-JNK)抑制JNK，可显著降低骨形态发生蛋白9诱导的早期和晚期成骨标志物的基因和蛋白表达，如Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素，并且发现在骨形态发生蛋白9刺激的成骨分化过程中，JNK与SMAD2/3通路相互作用，JNK在体外和体内对骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化具有积极的作用。

2.2.4 Hh信号通路 Hedgehog(Hh)信号最初在果蝇中被发现，其包括3个成员：Sonic hedgehog(Shh), Indian hedgehog(Ihh)和Deser thedgehog(Dhh)^[6⁷^]。Hh信号在生长发育过程中对一些器官的生长、干细胞的发育和自我更新起着重要的调节作用。研究表明，Hh信号可能是骨内生长平衡的关键调节信号^[⁶⁸^]。Hh-Ptch1信号是一种高度保守的途径，其活性对脊椎动物和昆虫体内多种生命活动和细胞形态发生起着重要作用^[⁶⁹^]。Ptch是Hh的一个12通道跨膜受体，并且在脊椎动物中已经鉴定出2个Ptch1和Ptch2基因。Ohba等^[7⁰^]研究了通过Hh-Ptch1信号传导调节小鼠出生后的骨稳态。研究表明Ptch1缺陷型(Ptch1+/-)小鼠中显示出高骨量。在细胞培养诱导骨分化中，Ptch1+/-细胞显示出更强的成骨分化作用，并且增强与Runt相关转录因子2(Runx2)的反应性。此外，Hh信号传导抑制剂环巴胺的全身给药降低了成年小鼠的骨量。这些研究表明了Hh-Ptch1信号传导通路在出生后的骨稳态中起关键的作用。Li等^[7¹^]研究了Hh信号在骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化中的参与过程，骨形态发生蛋白9对间充质干细胞中的Hh信号有影响，这直接导致了Hh信号分子表达的改变。Hh信号抑制剂环巴胺能有效降低骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞早期和晚期的成骨分化，而Hh信号激动剂普莫沙胺能促进间充质干细胞分化。此外，环巴胺可抑制骨形态发生蛋白9诱导的SMAD1/5/8转录活性，并破坏骨形态发生蛋白9诱导的关键成骨转录因子的表达。用普莫沙胺治疗可促进骨形态发生蛋白9诱导的Smad1/5/8的转录活性，并增强骨形态发生蛋白9诱导的关键成骨转录因子的激活。

2.3 骨形态发生蛋白9成骨调控因子

2.3.1 Runt相关转录因子(Runt Related Transcription Factor，RUNX)1、RUNX2、RUNX3 RUNX家族在胚胎的发育过程中对细胞的生长和各种分化起着重要的作用，一般来说，RUNX2是骨骼形成所必需的，RUNX3是胃肠和神经系统发育所必需的，RUNX1是一个调节造血干细胞和骨髓造血的关键转录因子^[7²^]，然而，越来越多的证据表明RUNX1、RUNX2、RUNX3均参与了骨骼的分化与发育。最近的研究表明RUNX1在成骨细胞、成软骨细胞成熟中是必不可少的。Ji等^[7³^]研究了RUNX1在骨形态发生蛋白9诱导的C3H10T1/2细胞系和小鼠多系细胞系(C2C12 and MEFs)成骨中的作用，表明了骨形态发生蛋白9促进了RUNX1在C3H10T1/2、C2C12和MEFs中的内源性表达。此外，RUNX1可能是BMP9/SMAD信号的直接目标。骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化通过RUNX1的过度表达而增强，而通过敲除RUNX1在C3H10T1/2，C2C12和MEFs中抑制。并且，进一步的机制研究表明，RUNX1可能影响骨形态发生蛋白9诱导的SMAD1/5/8的磷酸化，但不影响p38的磷酸化。

Sharff等^[7⁴^]发现了多毛/增强的分裂相关阻遏蛋白(Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif 1 Hey1，也被称为HESR1、HRT1、CHF2和HERP2)是HERP家族的转录因子，是间充质干细胞对骨形态发生蛋白9反应最显著上调的靶点之一，抑制Hey1的表达可降低骨形态发生蛋白9在体外和体内的诱导成骨分化。间充质干细胞Hey1的过度表达则增加了体外骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化，增强了体内骨形态发生蛋白9对骨基质的矿化作用。并且进一步证明，Hey1和RUNX2在骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化中起协同作用，RUNX2的外源性表达可部分挽救Hey1基因敲除表型，Hey1通过与RUNX2的相互作用，可能在调节骨形态发生蛋白9诱导的成骨细胞系分化中发挥重要作用。Wang等^[7⁵^]发现骨形态发生蛋白9上调了间充质干细胞中RUNX3的内源性表达。RUNX3的过度表达和敲除均增加了碱性磷酸酶的水平，碱性磷酸酶是骨形态发生蛋白9诱导早期成骨分化的标志物。然而，由于RUNX3的过度表达，矿化基质(骨形态发生蛋白9诱导的晚期成骨分化的标志物)的水平随之增加，反之则被RUNX3的敲除所抑制。骨形态发生蛋白9诱导的成骨关键转录因子ID3、DLX5和RUNX2的表达因RUNX3的过度表达而进一步增加，并且因RUNX3的敲除而降低。骨形态发生蛋白9诱导的Smad1/5/8磷酸化随RUNX3的过度表达而增加，随RUNX3的敲除而降低。

2.3.2 多毛/增强的分裂相关阻遏蛋白(hairy/ enhancer-of-split related with YRPW motif 1，Hey1) 也被称为CHF2、HRT1、HERP2或HESR1，是基本螺旋-环-螺旋家族的成员。Hey1首先被证明为典型的Notch信号的下游效应器，目前进一步的研究表明，Hey1也由独立于Notch的转化生长因子β/骨形态发生蛋白信号诱导成骨分化^[7⁶^]。许多研究表明，Hey1负责各种器官的发育，包括骨骼、神经、心脏、肌肉和血管组织，并且大量证据表明Hey1在成骨诱导分化中具有调节作用。Xiao等^[7⁷^]通过含有抗坏血酸、地塞米松和β-磷酸甘油酯的培养基来刺激成骨细胞/成牙细胞分化介质，可以上调成牙细胞系细胞(OLC)中Hey1的表达。此外，稳定的Hey1过度表达时细胞在诱导分化培养基刺激下表达较高水平的牙本质唾液磷蛋白(DSPP)，并表现出较高的矿化能力。此外，RNA干扰介导的Hey1基因敲除下调了分化介质刺激的破骨细胞样细胞中牙本质涎磷蛋白的表达水平。Sharff等^[7⁴^]进行了基因表达谱分析，确定了Hey1是骨形态发生蛋白9刺激的间充质干细胞中最显著上调的早期靶点之一。在骨形态发生蛋白9诱导的成骨分化的早期，Hey1表达上调。同时，染色质免疫沉淀分析表明，Hey1可能是骨形态发生蛋白9诱导的SMAD信号通路的直接靶点。

此外还存在许多别的骨形态发生蛋白9成骨调控因子，如环氧化酶2是人体在应激后迅速产生的一种诱导酶，其能够催化前列腺素(PGs)合成，并参与炎症反应。目前研究表明，环氧化酶2对骨髓间充质干细胞的成骨分化和骨折的愈合至关重要^[⁷⁸^]。Wang等^[⁷⁸^]证明环氧化酶2在间充质干细胞中作为骨形态发生蛋白9的靶向上调。环氧化酶2抑制剂(NS-398)和通过siRNAs敲除环氧化酶2均能有效地降低骨髓基质细胞骨形态发生蛋白9诱导的碱性磷酸酶的活性。NS-398还下调了骨形态发生蛋白9诱导的骨桥蛋白和骨钙素表达，矿化基质也下调。体内研究同样表明，环氧化酶2的敲除可减弱骨形态发生蛋白9诱导的异位骨形成。

肾母细胞瘤过表达蛋白(Nephroblastomao verexpressed，NOV or CCN3)是Notch信号通路的非典型分泌配体，是肾母细胞瘤过表达蛋白家族的成员，其广泛表达于肌肉骨骼系统、神经系统等。它在骨骼的发育和骨折愈合过程中都有很高的表达水平。Su等^[⁷⁹^]采用过表达肾母细胞瘤过表达蛋白3腺病毒(adCCN3)和小干扰肾母细胞瘤过表达蛋白3腺病毒(adsiCCN3)分别上调和下调MEFs中的肾母细胞瘤过表达蛋白3水平，发现肾母细胞瘤过表达蛋白3主要通过抑制骨形态发生蛋白信号和与DLL1的相互抑制作用来抑制MEF的成骨分化，从而抑制Hey1的表达。

局灶黏附激酶(FAK)是一种定位于局灶黏附的胞质酪氨酸激酶，通过调节肌动蛋白细胞骨架的重塑，促进整合素介导的细胞扩散和迁移过程。Yuan等^[6³^]证明了脂肪源性干细胞可以通过局灶性黏附激酶(FAK)和骨形态发生蛋白9信号进行成骨分化，这两种信号都可能影响WNT-β-catenin信号，WNT-β-catenin信号与脂肪源性干细胞成骨分化密切相关。

2.4 骨形态发生蛋白9在骨科相关疾病中的应用 骨关节炎是骨科的常见疾病，在中老年人群中发病率较高。病理学上，骨关节炎主要表现为软骨缺失和关节退行性改变。以往的研究表明，关节内注射间充质干细胞可以修复骨关节炎患者的软骨缺损^[8⁰^]。间充质干细胞能向关节软骨细胞分化是治疗骨关节炎软骨缺损的关键。尽管骨关节炎被认为是由炎症细胞因子介导的炎症，但其机制却还不清楚。Liu等^[8¹^]研究了骨形态发生蛋白9在脂肪源性间充质干细胞软骨分化中的作用。用骨形态发生蛋白9转染脂肪源性间充质干细胞并建立膝关节骨关节炎小鼠模型，在向关节间隙注射过表达骨形态发生蛋白9的脂肪源性间充质干细胞后，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达增加。当脂肪源性间充质干细胞的Notch信号通路被抑制时，脂肪源性间充质干细胞过表达骨形态发生蛋白9修复骨关节炎膝关节软骨的能力减弱。这些结果表明，上调骨形态发生蛋白9蛋白表达可能促进脂肪源性间充质干细胞的软骨分化，通过关节内注射脂肪源性间充质干细胞有助于小鼠骨关节炎的膝关节软骨修复。

骨折愈合过程中包含多种细胞因子的协同作用。骨形态发生蛋白9是骨形成的重要因子。延迟骨折愈合患者的血浆骨形态发生蛋白9浓度比普通骨折愈合患者低^[8²^]。Wang等^[8³^]研究了骨髓间充质干细胞对重组腺病毒骨形态发生蛋白9的成骨潜能，以及重组腺病毒骨形态发生蛋白9在骨质疏松大鼠模型手术性骨折中的早期骨折的修复特性。他们构建了去卵巢大鼠骨质疏松模型，并对大鼠股骨造成开放性股骨骨折，植入含有重组腺病毒骨形态发生蛋白9的明胶海绵。在4周后采集股骨进行显微计算机断层扫描、生物力学、放射学和组织学分析。骨形态发生蛋白9成功地提高了骨髓间充质干细胞中的碱性磷酸酶活性并诱导了成骨化结节的形成。明胶海绵中的骨形态发生蛋白9对骨痂的显微结构参数和生物力学强度有显著影响。此外，它还上调了RUNX2和Ⅰ型胶原的表达水平。明胶海绵中的重组腺病毒骨形态发生蛋白9显著介导股骨骨折骨质疏松大鼠骨痂的形成，并增加骨的质量和强度。骨形态发生蛋白9能增强骨质疏松大鼠骨折愈合过程中骨痂的形成并保持早期的机械强度及稳定性，Yu等^[8⁴^]证明用骨形态发生蛋白9治疗非再生性手指截肢伤口可以刺激关节结构的再生，再生关节包括滑膜腔和衬有关节软骨的骨骼元件。此外，骨形态发生蛋白9诱导的关节再生需要蛋白多糖4 (PRG4)基因。最后，研究证明，连续用骨形态发生蛋白2治疗后，使用骨形态发生蛋白9刺激骨和关节的再生细胞，否则将经历纤维化愈合。Shui等^[8⁵^]发现，与使用脱钙骨基质的骨形成相比，使用Ⅰ型胶原海绵或羟基磷灰石磷酸三钙支架皮下植入骨形态发生蛋白9与组织工程细胞可形成坚固和成熟的松质骨块，提示骨形态发生蛋白9可能是骨折愈合的一个新的治疗靶点。

椎间盘退变性疾病是一系列椎间盘退变所引起的疾病的总称，脊柱融合技术被认为是临床上治疗椎间盘退行性变最有效和最重要的方式之一。自体骨移植是进行脊柱融合的主要手术方法，但自体骨的来源十分有限，而且手术后伴有很多疼痛及供区病变等并发症的发生，骨组织工程是目前的热点，它很好地解决了自体骨量不足和自体骨移植的并发症。Dumont等^[8⁶^]用含有巨噬细胞病毒启动子和骨形态发生蛋白9复制缺陷型5腺病毒转染的人间充质干细胞来治疗16只裸鼠。他们经皮向16只裸鼠的腰椎区域注射由重组腺病毒骨形态发生蛋白9转染的人间充质干细胞，注射后8周对腰骶部脊柱进行计算机断层扫描，并对腰骶部脊柱标本进行组织学检查，计算机断层扫描和组织学分析都清楚地表明，在重组腺病毒骨形态发生蛋白9转导的人间充质干细胞注射部位有大量异位骨，导致脊柱融合成功，没有神经根压迫或局部或全身毒性的证据。

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引言

材料方法

讨论

自从人们在大约20年前发现骨形态发生蛋白9信号级联的分子以来，目前还没有完全了解骨形态发生蛋白9信号如何调节体内骨的形成和维持。骨形态发生蛋白9成骨通路除上述经典通路外还包括转化生长因子β1信号通路、生长激素(GH)/JAK/STAT/IGF1信号通路、胰岛素生长因子2/PI3K/AKT信号通路、类维生素A(RAs)等信号通路。骨形态发生蛋白9调控因子除上述调控因子外还有过氧化物酶体增殖物激活受体γ、表皮生长因子、结缔组织生长因子、缺氧诱导因子1α、富含半胱氨酸的表皮生长因子样蛋白2等。各种配体、信号分子、增效剂和拮抗剂的相互作用使骨形态发生蛋白信号级联十分复杂。骨形态发生蛋白9配体在体内具有明显的表达谱和生物学活性。此外，调控骨形态发生蛋白9信号的骨形态发生蛋白9拮抗剂和增强剂也显示出不同的表达谱。因此，在各种细胞形态的发生过程中，骨形态发生蛋白9的生物活性受到全身各方面各种因素的复杂组合的严格调控。近年来，骨形态发生蛋白9因其对间充质干细胞分化具有强大的诱导成骨作用而受到广泛的研究。然而，其机制和与传统转化因子的相关性仍然需要继续深入研究。

以前的研究表明，骨形态发生蛋白2，4，7和9可以诱导间充质干细胞分化为成骨细胞。其中，骨形态发生蛋白9表现出最强大的诱导效应。它不仅可以诱导异位骨化，而且可以在早期阶段诱导间充质干细胞分化，这表明其在研究和临床应用中具有重要价值。Zhang等^[8⁷^]构建了搭载骨形态发生蛋白9的纳米羟基磷灰石-Ⅰ型胶原蛋白-多壁碳纳米管复合支架，并在支架上接种骨髓间充质干细胞后，发现搭载骨形态发生蛋白9的支架在体外可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并且在体内诱导出更多的骨生成。骨形态发生蛋白9作为在骨形态发生蛋白家族中成骨能力最强的生长因子，已经在各种动物实验中证实了其在解决骨科相关疾病中具有巨大的应用价值，动物实验证明了其在修复骨折、骨缺损和脊柱融合等方面具有十分可观的临床应用前景。然而，骨形态发生蛋白9的临床应用受到许多限制因素的阻碍，如其短半衰期和副作用的可能性。到目前为止，使用重组骨形态发生蛋白9蛋白进行骨折修复仍然是一项复杂且困难的工程，其治疗结果相当有限。区别于骨形态发生蛋白2，4，7等能够诱导成骨的生长因子，骨形态发生蛋白9已经被证明不能被骨形态发生蛋白3及NoggiIn所抑制，这表明了骨形态发生蛋白9在骨形态发生蛋白家族中可能具有特殊的成骨机制。作为目前研究最少的骨形态发生蛋白之一，骨形态发生蛋白9诱导的成骨信号转导的基本介质仍不清楚，值得进一步地研究。目前随着实验技术的飞速发展，包括芯片序列和下一代高通量测序系统的发展，可能有助于进一步了解骨形态发生蛋白9在体内的功能与机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨形态发生蛋白9诱导成骨机制及其临床应用

Bone morphogenetic protein 9: osteogenic induction mechanism and clinical application

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