龟板软膏调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路修复大鼠急性皮肤创面

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1772

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (29): 4668-4674.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1772

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

龟板软膏调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路修复大鼠急性皮肤创面

申倩，胡佩欣，钟淑贤，杨亚兰，张赛霞，李春

广州中医药大学，广东省广州市 510006

修回日期:2019-03-15 出版日期:2019-10-18 发布日期:2019-10-18
通讯作者: 李春，硕士，副教授，硕士生导师，广州中医药大学，广东省广州市 510006
作者简介:申倩，1994年生，广东省梅州市人，广州中医药大学硕士研究生，主要从事皮肤损伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81403201)，项目负责人：李春

Tortoise shell ointment for acute skin wound in rats via Wnt/beta-catenin signal pathway in hair follicle stem cells Tortoise shell ointment for acute skin wound in rats via Wnt/beta-catenin signal pathway in hair follicle stem cells

Shen Qian, Hu Peixin, Zhong Shuxian, Yang Yalan, Zhang Saixia, Li Chun

Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Revised:2019-03-15 Online:2019-10-18 Published:2019-10-18
Contact: Li Chun, Master, Associate professor, Master’s supervisor, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Shen Qian, Master candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81403201 (to LC)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
毛囊干细胞：位于真皮层皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘隆突部，具有自我更新和分化的能力，它不仅可以维持正常皮肤中毛囊的再生，对恢复皮肤组织完整性和功能性中也起到关键的作用。毛囊干细胞在体内多处于静息状态，当皮肤受损时，毛囊干细胞被活化后从隆突部迁移出，快速募集至创面中心，通过增殖、迁移、分化形成表皮各层细胞和皮肤附属器，参与受损部位的修复。
Wnt/β-catenin信号通路：是一类高度保守的信号通路，广泛存在于多细胞真核生物中，是皮肤发育过程中出现最早的分子信号，调控毛囊的生长发育和毛囊干细胞的迁移分化。β-catenin作为细胞内信号传导蛋白，是Wnt信号通路激活的一种重要的上皮细胞表面黏附分子，能够进入细胞核内传递Wnt信号，进一步激活靶基因开始转录，启动细胞增殖周期。

摘要
背景：龟板散由龟板、黄连和冰片组成，是治疗皮肤疮疡的有效方剂。中药单体机制明确，龟板的有效单体十四酸甾醇酯可以激活并调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。
目的：探讨龟板软膏对大鼠急性皮肤创面的修复效果，以及其作用是否通过调控毛囊干细胞的Wnt/β-catenin信号通路实现。
方法：取龟板散各组分中的有效单体十四酸甾醇酯(S8)、盐酸小檗碱及右旋龙脑制备龟板软膏。构建SD大鼠急性皮肤创面模型并随机分为3个药物组：龟板软膏组、S8组和空白对照组，连续给药10 d。造模后连续 3 d注射BrdU(50 mg/kg)标记增殖细胞。分别于修复第3，5，7及10天计算创面愈合率，苏木精-伊红染色和Masson染色观察创面病理学变化，Western blot法和免疫荧光检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、LEF1、C-myc及毛囊干细胞的表面标志物CD34和Integrin β1的表达情况。实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为20190218001。
结果与结论：①修复第5，7，10天，龟板软膏组的创面愈合率均高于其他组(P < 0.05)；②龟板软膏组新生表皮与真皮连接紧密，新生皮肤附属器较S8组和空白对照组多，胶原纤维致密，修复效果优于其他组；③龟板软膏组和S8组Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、LEF1、C-myc及毛囊干细胞的表面标志物CD34、Integrin β1的阳性表达量均高于空白对照组，β-catenin、CD34和Integrin β1的阳性表达均上调，LEF1和C-myc的表达呈先上调后下降变化，差异有统计学意义(P < 0.05)；④龟板软膏组中BrdU标记的增殖细胞数量较其他组多，且同时表达CD34阳性和LEF1阳性；⑤结果提示：龟板软膏可能通过调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，加快大鼠急性皮肤创面的修复，龟板软膏由S8、盐酸小檗碱及右旋龙脑3种有效单体组成，具有稳定性和安全性，其对急性皮肤创面的促愈合效果优于单一有效单体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-8274-6054(申倩)

关键词: 龟板软膏, 十四酸甾醇酯, 盐酸小檗碱, 右旋龙脑, Wnt/β-catenin信号通路, 毛囊干细胞, 急性皮肤创面

Abstract:

BACKGROUND: Traditional prescription Guiban San composed of tortoise shell, coptis chinensis and borneol is used for treating skin injury. As per the clear mechanism of traditional Chinese medicine monomer, the effective monomer cholesterol myristate of tortoise shell can activate and regulate the Wnt/β-catenin signal pathway in hair follicle stem cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of tortoise shell ointment on acute skin wound in rats and the mechanism whether is by regulating Wnt/β-catenin signal pathway in hair follicle stem cells.
METHODS: Tortoise shell ointment was prepared with cholesterol myristate, berberine and borneol--the effective monomers from components of Guiban San. Acute skin wound model was made in Sprague-Dawley rats and rat models were then randomly divided into three groups: tortoise shell ointment group, cholesterol myristate (S8) group and control group. Medication in each group was administered continuously for 10 days. BrdU (50 mg/kg) for proliferative cell labeling was administered for 3 consecutive days. The healing rate of the wound was analyzed in different groups at 3, 5, 7, and 10 days after repair. Hematoxylin-eosin staining and Masson staining were conducted for histopathological observations. The expression of β-catenin, LEF1, C-myc in Wnt/β-catenin signal pathway and CD34, Integrin β1 in hair follicle stem cells were detected by western blot and immunofluorescence. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Guangzhou University of Chinese Medicine with an approval No. 20190218001.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At days 5, 7, and 10 after repair, the wound healing rate in the tortoise shell ointment group was significantly higher than that in the other groups (P < 0.05). (2) Compared with the S8 and control groups, tortoise shell ointment group showed better repair effect with more neoformative hair follicles and denser collagen fibers. (3) The expressions of β-catenin, LEF1, C-myc, CD34, Integrin β1 in the tortoise shell ointment and S8 group were higher than those in the control group. The positive expression of β-catenin, CD34 and Integrin β1 were increased during wound healing. LEF1 and C-myc were increased during the prophase and metaphase of wound healing but decreased during the later stage. The difference was statistically significant among three groups (P < 0.05). The number of BrdU-labeled proliferative cells in the tortoise shell ointment group was higher than that in the S8 and control groups, with concurrent positive expressions of CD34 and LEF1. To conclude, tortoise shell ointment may stably and safely promote the repair of acute skin wound in rats via regulating Wnt/β-catenin signal pathway in hair follicle stem cells, and the healing effect is superior to any single effective monomer.

Key words: tortoise shell ointment, cholesterol myristate, berberine, borneol, Wnt/β-catenin signal pathway, hair follicle stem cells, acute skin injury

中图分类号:

申倩，胡佩欣，钟淑贤，杨亚兰，张赛霞，李春. 龟板软膏调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路修复大鼠急性皮肤创面[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4668-4674.

Shen Qian, Hu Peixin, Zhong Shuxian, Yang Yalan, Zhang Saixia, Li Chun. Tortoise shell ointment for acute skin wound in rats via Wnt/beta-catenin signal pathway in hair follicle stem cells Tortoise shell ointment for acute skin wound in rats via Wnt/beta-catenin signal pathway in hair follicle stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4668-4674.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 3组96只大鼠全部进入结果分析，无脱落。

2.2 不同时间点创面愈合情况及愈合率比较 随着治疗时间的增加，各组创面愈合情况好转。如图2所示，第5天，除空白对照组以外，龟板软膏组和S8组出现脱痂现象，龟板软膏组创面明显收缩；第7天，龟板软膏组和S8组创面修复明显好转；第10天，龟板软膏组创面完全修复，接近正常皮肤，愈合情况优于S8组和空白对照组。如表1所示，龟板软膏组第5，7，10天的创面愈合率高于其他两组，龟板软膏组和S8组不同时间点的愈合率均高于空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 组织病理学检查结果

2.3.1 苏木精-伊红染色结果 如图3所示，根据不同时间点描述各组典型表现如下。第3天，各组均出现大量炎性细胞浸润。第5天，龟板软膏组表皮增厚，炎症细胞浸润减少；空白对照组仍有炎性浸润，开始出现表皮组织。第7天，龟板软膏组创面基本愈合，表皮与真皮连接紧密，皮肤附属器增多；S8组见较厚表皮组织覆盖；空白对照组仍有炎性浸润，表皮组织较薄。第10天，龟板软膏组和S8组表皮修复接近正常表皮，表皮分层明显，结构致密；空白对照组仍有少许结痂覆盖。

2.3.2 Masson染色结果 如图4所示，根据不同时间点描述各组典型表现如下。第3天，各组胶原纤维生成较少。第5天，各组胶原纤维厚薄不一，龟板软膏组胶原纤维数量较其他组多。第7天，龟板软膏组和S8组胶原纤维排列致密；空白对照组较稀疏。第10天，龟板软膏组较其他组更趋向正常皮肤组织胶原纤维的特性。

2.4 不同时间点各组皮肤创面β-catenin、LEF1、C-myc、CD34、Integrin β1蛋白表达水平 Western blot结果如图5所示，同一时间点龟板软膏组和S8组的β-catenin、LEF1、C-myc、CD34、Integrin β1表达水平均大于空白对照组。创面在修复过程中，龟板软膏组和S8组β-catenin、CD34和Integrin β1的表达水平均呈上升趋势，LEF1和C-myc的表达水平呈“抛物线式”变化，在修复的早中期上调，在修复后期下降。各组差异均具有统计学意义(P < 0.05)。

2.5 各组皮肤创面β-catenin、LEF1、C-myc、CD34、Integrin β1的免疫荧光表达 第3天各组免疫荧光表达如图6所示，β-catenin主要表达于表皮棘层和基底层，LEF1和C-myc主要表达于基底层，龟板软膏组和S8组的β-catenin、LEF1、C-myc、CD34和Integrin β1的阳性表达均强于空白对照组。

如图7所示，龟板软膏组BrdU标记的增殖细胞数量较S8组和空白对照组多，且同时表达CD34、LEF1阳性。第5，7和10天，龟板软膏组和S8组β-catenin、LEF1、C-myc、CD34和Integrin β1的阳性表达强度与第3天的结果类似，均大于空白对照组，结果未显示。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组，对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年4月至11月在广州中医药大学进行。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠96只，体质量(200±20) g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(粤)2018-0085。动物在广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室统一饲养，饲养环境温度、湿度、光照按照SPF级饲养条件实施。实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为20190218001。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 十四酸甾醇酯(TCI，日本)，盐酸小檗碱(Macklin，中国)，右旋龙脑(源叶生物，中国)，京万红软膏(达仁堂，中国)，BrdU(Sigma，美国)，I抗BrdU(Abcam，英国)，LEF1(Santa cruz，美国)，Integrin β1(Cst，美国)，β-actin、β-catenin、CD34、C-myc(均购自Abclonal，中国)，免疫荧光Ⅱ抗FITC山羊抗鼠、Cy3(均购自Abclonal，中国)，Alexa Fluor® 647(Abcam，英国)。全自动化学发光图像分析仪(天能，中国)，超高分辨率激光共聚焦扫描显微镜(蔡司，德国)，多功能染色机(徕卡，德国)，低温离心机(Labogene，丹麦)，病理图像分析系统(Olympus，日本)。

1.4 方法

1.4.1 药物制备 根据前期课题组研究及预实验结果，龟板软膏遵循龟板散组方成分，按照1.5∶2∶1.5的比例取S8 (1 g/L)^[11]、盐酸小檗碱(1.35 g/L)和右旋龙脑(1 g/L)加入凡士林和液体石蜡(8∶2)基质中，将3种有效单体加热混合调匀，制成软膏。

1.4.2 药物质量控制

稳定性试验：①耐热试验：将龟板软膏放置于55 ℃ 6 h，无分层现象；②耐寒试验：将龟板软膏放置于-15 ℃ 24 h，无分层现象；③离心试验：将适量软膏放入离心管中，10 000 r/min离心30 min，无分层及硬化现象。

皮肤刺激性试验：取健康SD大鼠10只，于给药前1 d剃去背部毛发，在大鼠背部选择面积约9 cm²的皮肤，将大鼠分为健康皮肤组和破损皮肤组，每组5只；破损皮肤组采用针头在消毒皮肤上做“#”字样划痕数条，以出现轻微渗血为度；各组均涂抹1 g龟板软膏，涂药后1，24，48和72 h大体观察，受试皮肤局部未见红斑、水肿等现象，提示龟板软膏对健康皮肤及破损皮肤均无明显刺激性。药物在每次给药前现配现用，保证药物质量。

1.4.3 造模、分组及给药 将大鼠用乙醚吸入进行麻醉，剃去背部毛发，体积分数75%乙醇消毒，于大鼠背部脊柱两侧各标记2个直径约1.2 cm，面积约1.13 cm²的圆形区域(各圆形标记间距≥2 cm)，用无菌手术刀沿圆形标记切除皮肤，创面深达真皮，未及筋膜层，大体观察可见创面表皮完全缺失，真皮部分缺失，创面呈血红色，如图1所示。造模后当天按照50 mg/kg剂量给大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)^[12-13]，连续注射3 d，每日2次，进行大鼠体内增殖细胞标记。

SD大鼠随机分为3个药物组：龟板软膏组、十四酸甾醇酯组(S8组)和空白对照组，按照不同观察时间点将各药物组分为4个亚组：3 d、5 d、7 d和10 d组，每组8只。龟板软膏组予以龟板软膏外涂(厚度为1.0-2.0 mm)，S8组予以S8溶液(1 g/L)，空白对照组予以生理盐水，每日给药2次，连续给药10 d。各组分别于修复第3，5，7，10天取材，进行组织学和分子生物学检测，评估皮肤创面修复效果。

1.5 主要观察指标

1.5.1 计算创面愈合率 采集每组大鼠的创面图像，用ImageJ软件计算创面面积，得出创面愈合率。创面愈合率= (原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.5.2 组织病理学检查 取全层创面组织及少许周围正常组织，40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规脱水、透腊、包埋、切片。进行苏木精-伊红染色及Masson染色，观察创面治疗后的表皮、真皮、皮下组织、皮肤附属器和胶原纤维增生情况。

1.5.3 Western blot法检测 采用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、LEF1、C-myc及毛囊干细胞的表面标志物CD34和Integrin β1蛋白表达水平。提取组织总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，湿转仪转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，滴加Ⅰ抗，4 ℃过夜，TBST洗涤5 min×3次，加入Ⅱ抗，室温孵育1 h，洗膜，ECL试剂显影成像。用ImageJ软件对目的条带进行灰度分析。

1.5.4 免疫荧光检测 采用免疫荧光检测β-catenin、LEF1、C-myc、CD34、Integrin β1蛋白的表达情况。石蜡切片37 ℃过夜，70 ℃烘片2 h，脱蜡至水，抗原修复，0.5% triton透膜15 min，PBS浸泡5 min×3次，5% BSA封闭30 min；滴加Ⅰ抗β-catenin、LEF1、CD34、C-myc和Integrin β1，探讨龟板软膏是否激活并调控毛囊干细胞中Wnt/β-catenin信号通路；采用免疫荧光三重标记法，滴加BrdU、CD34和LEF1，探讨龟板软膏是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进毛囊干细胞增殖；4 ℃过夜，PBST浸泡5 min×3次，加相应荧光Ⅱ抗FITC、Cy3、Alexa Fluor® 647，室温孵育30 min，PBST浸泡5 min×3次，DAPI染核5 min，PBST浸泡5 min×3次，防淬灭封片剂封固，用超高分辨率激光共聚焦扫描显微镜拍摄。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0对数据进行统计分析。计量资料用x(_)±s表示，两组间均数比较，用独立样本t 检验；多组间均数比较，方差齐则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差不齐则采用秩和检验；以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

中药复方疗效的发挥往往是由多个有效成分通过不同途径实现多成分、多靶点的协同作用，从而达到治疗疾病的目的，因此以有效部位成药具有中医药理论基础和特色^[14]。中医药及其有效单体对皮肤组织修复再生的研究越来越受到重视^[15]。此次实验所配制的龟板软膏借鉴龟板散的组方成分和疗效，提取君药龟板、臣药黄连及佐使药冰片中促进皮肤愈合的有效单体进行成分配伍与剂型改良。龟板中的有效单体S8调控Wnt/β-catenin信号通路，促进毛囊干细胞的增殖分化，参与创面修复和皮肤附属器生成^[9]。黄连中的有效单体盐酸小檗碱发挥抗菌、抗感染、抗氧化及抗肿瘤等多种药理作用^[16-18]，具有伤口愈合促进活性，并且没有毒性作用^[19]，研究发现盐酸小檗碱可减轻伤口出血，防止伤口感染，促进皮肤细胞生长^[20]。冰片中的有效单体右旋龙脑具有抑菌镇痛透皮的作用，促进皮肤对药物的吸收，提高其他药物的生物利用度^[21-23]。龟板软膏制备简单，对正常皮肤和破损皮肤均无皮肤刺激性现象，其成分中3种有效单体疗效确切，具有稳定性和安全性。

创面修复过程要经历出血期、炎症期、增殖期和塑形期，涉及多种细胞及细胞外基质协同参与重建和再生。实验结果显示，龟板软膏组能加快急性皮肤创面的修复，其促愈合效果优于单个有效单体S8。龟板软膏组在修复第5，7和10天创面愈合率高于S8组和空白对照组。苏木精-伊红染色观察表明，龟板软膏组能加快急性创面的修复，尤其在创面的增殖期和塑形期，龟板软膏组表皮与真皮连接较其他组紧密，皮肤附属器生成较多，可更快参与到表皮的修复中，缩短愈合时间。胶原纤维是细胞外基质的基本结构，能够调控局部微环境，促进细胞的增殖与分化^[24]。Masson染色结果显示，龟板软膏组胶原纤维生成与其他两组相比较密集，说明龟板软膏能加快胶原纤维的形成，促进组织外基质的重建，提高创面修复的质量。

Wnt/β-catenin经典信号通路影响着皮肤创面的愈合^[25]。β-catenin作为细胞内信号传导蛋白，是Wnt信号通路激活的一种重要的上皮细胞表面黏附分子，能进入细胞核内与LEF1转录因子结合，进一步激活靶基因开始转录^[26-27]。C-myc是编码转录因子的调节基因，调控着细胞增殖周期、细胞分化与凋亡，还控制着毛囊干细胞从G₀到S期的增殖过程^[28-29]。LEF1和C-myc在Wnt/β-catenin信号通路中起着精细的调控作用，表达不足或表达太过都会影响创面修复。此次研究结果显示，龟板软膏可能激活并调控Wnt/β-catenin经典信号通路参与急性皮肤创面的修复，在创面修复的早中期，β-catenin、LEF1和C-myc表达上调，在创面修复后期，LEF1和C-myc表达下调。毛囊干细胞具有修复受损创面、恢复皮肤组织的完整性和功能的重要作用^[30]，毛囊干细胞可增殖、迁移和分化为表皮各层细胞，增强毛囊干细胞的增殖活性是加快皮肤创面愈合的关键。CD34和Integrinβ1是毛囊干细胞的阳性标记物^[31]，实验表明，CD34和Integrinβ1的表达在创面修复过程中呈上升趋势，且龟板软膏组中BrdU标记的增殖细胞较多，同时表达CD34、LEF1阳性，提示龟板软膏可能通过调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，促进毛囊干细胞增殖并参与创面组织重建，加快急性创面的修复。

综上所述，龟板软膏由S8、盐酸小檗碱和右旋龙脑组成，成分机制明确，单体疗效确切，具有稳定性和安全性。龟板软膏能够调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，促进毛囊干细胞增殖，加快大鼠急性皮肤创面的修复，并具有优于单一有效单体的疗效，为基于中药有效单体成分治疗皮肤创面的新药研究提供思路。但此次研究仅证明了龟板软膏对急性创面的修复作用，还需进一步研究龟板软膏是否适用于压疮、糖尿病溃疡等慢性伤口。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

龟板软膏调控毛囊干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路修复大鼠急性皮肤创面

Tortoise shell ointment for acute skin wound in rats via Wnt/beta-catenin signal pathway in hair follicle stem cells Tortoise shell ointment for acute skin wound in rats via Wnt/beta-catenin signal pathway in hair follicle stem cells

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