雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0498

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2087-2092.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0498

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化

毛杰^1，2，周翊飞^1，2，吴晓玲^1，2，余京泓^1，2，党海霞²，徐晓梅^1，2

¹西南医科大学附属口腔医院正畸科，四川省泸州市 646000；²西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室，四川省泸州市 646000

修回日期:2018-03-13 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 徐晓梅，博士，副教授，西南医科大学附属口腔医院正畸科，四川省泸州市 646000；西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:毛杰，男，1993年生，四川省筠连县人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事错牙合畸形防治方面的研究。
基金资助:
四川省科技厅科技计划项目(2015JY0119)；四川省教育厅项目(重点项目：16ZA0188)；四川省科技厅-泸州市-泸州医学院联合项目(LZ-LY-59)

Estrogen regulates osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells via Wnt/beta-catenin signaling pathway

Mao Jie^{1, 2}, Zhou Yi-fei^{1, 2}, Wu Xiao-ling^{1, 2}, Yu Jing-hong^{1, 2}, Dang Hai-xia², Xu Xiao-mei ^{1, 2}

¹Department of Orthodontics, Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Laboratory of Oral and Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Revised:2018-03-13 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Xu Xiao-mei, M.D., Associate professor, Department of Orthodontics, Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Laboratory of Oral and Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Mao Jie, Master candidate, Physician, Department of Orthodontics, Stomatology Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Laboratory of Oral and Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Plan Program of Sichuan Province Science and Technology Department, No. 2015JY0119; the Key Program of Sichuan Province Education Department, No. 16ZA0188; the Joint Project of Sichuan Province Science and Technology Department & Luzhou Municipality & Luzhou Medical University, No. LZ-LY-59

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
干细胞成骨分化：即成体干细胞经历一系列复杂的生物过程分化成熟为骨细胞，它是骨组织形成的基础，也是人体骨代谢的重要组成部分。成骨分化这一重要的多向分化潜能，奠定了干细胞在骨组织损伤再生修复中的重要地位。
Wnt/β-catenin信号通路：是真核生物进化过程中的一条重要的通路，它主要通过调节胞质中β-catenin蛋白含量而实现其传导作用。Wnt/β-catenin信号通路调控干细胞各项代谢活动的分子机制仍然是干细胞研究领域一大热点。探究Wnt/β-catenin信号通路对成骨分化过程的可能作用受到了学者们的广泛关注。

摘要
背景：已有实验发现，雌激素能促进人牙周膜干细胞骨向分化，但雌激素调控人牙周膜干细胞成骨分化的具体机制目前尚未明确。
目的：探讨雌激素通过Wnt/β-catenin信号通路对人牙周膜干细胞骨向分化的调控作用。
方法：采用消化组织块法联合有限稀释克隆法分离培养并纯化得到人牙周膜干细胞，取第3代人牙周膜干细胞随机分为3组：单纯成骨诱导液组(对照组)；含1×10^-⁷ mol/L雌激素成骨诱导液组(雌激素组)；含100 μg/L Wnt3a成骨诱导液组(Wnt3a组)。各组在成骨诱导1，3，5，7 d时检测碱性磷酸酶活性，成骨诱导7 d时采用Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、CyclinD1以及成骨相关蛋白Runx-2、OCN的表达水平。

结果与结论：①各组碱性磷酸酶活性随时间推移均呈上升趋势。雌激素组和Wnt3a组在诱导1，3，5，7 d各时间点碱性磷酸酶表达水平均高于对照组(P < 0.05)；而雌激素组和Wnt3a组表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)；②雌激素组和Wnt3a组β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1的表达水平高于对照组(P < 0.05)，而GSK-3β表达水平低于对照组(P < 0.05)，同时雌激素组和Wnt3a组的成骨中晚期标志物Runx2、OCN表达水平均高于对照组(P < 0.05)。雌激素组和Wnt3a组间Wnt/β-catenin信号通路相关因子和成骨中晚期相关蛋白的表达差异无显著性意义(P > 0.05)；③结果表明，雌激素可促进人牙周膜干细胞的成骨分化，这种促进作用的实现可能与雌激素微环境下活化人牙周膜干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2211-655X(徐晓梅)

关键词: 人牙周膜干细胞, 雌激素, Wnt3a蛋白, Wnt/β-catenin信号通路, 成骨分化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Estrogen can promote the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs), but the molecular mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To study the regulatory effect of estrogen on the osteogenic differentiation of hPDLSCs via Wnt/β-catenin signaling pathway.
METHODS: The hPDLSCs were isolated and purified by digestion method combined with limited dilution clone method. Three experimental groups were set as follows: osteogenic induction only (control group); 1×10^-⁷ mol/L estrogen with osteogenic induction (estrogen group); and

100 μg/L Wnt3a protein with osteogenic induction (Wnt3a group). Alkaline phosphatase activity was detected at 1, 3, 5, 7 days of osteogenic induction. Western blot was used to detect the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins β-catenin, P-GSK-3β, GSK-3β, CyclinD1 and osteoblast-related proteins Runx2 and OCN after 7 days of osteogenic induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The activity of ALP in all groups increased with time. The expression level of ALP in the estrogen group and Wnt3a group was higher than that in the control group at 1, 3, 5 and 7 days of induction (P < 0.05), while there was no significant difference between the former two groups (P > 0.05). The western blot results showed that the expression levels of β-catenin, P-GSK-3β, CyclinD1, Runx2 and OCN in the estrogen group and Wnt3a group were higher than those in the control group (P < 0.05), while the expression of GSK-3β was lower than that in the control group (P < 0.05). But there were no differences in the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins and mid-late osteogenic markers between estrogen group and Wnt3a group (P > 0.05). To conclude, estrogen can enhance the osteogenic differentiation of hPDLSCs, and the underlying mechanism is likely to activate the Wnt/β-catenin signaling pathway in activated hPDLSCs exposed to estrogen.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Periodontal Ligament, Stem Cells, Estrogens, Cell Differentiation, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

毛杰，周翊飞，吴晓玲，余京泓，党海霞，徐晓梅. 雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2087-2092.

Mao Jie, Zhou Yi-fei, Wu Xiao-ling, Yu Jing-hong, Dang Hai-xia, Xu Xiao-mei. Estrogen regulates osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells via Wnt/beta-catenin signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2087-2092.

图/表（结果） 2

2.1 hPDLSCs的分离培养和纯化 采用消化组织块法培养原代细胞，5-10 d可见组织块周围有原代细胞爬出(图1A)，进一步通过有限稀释克隆法得到纯化的hPDLSCs。纯化后的hPDLSCs形态丰满呈长梭形，胞核聚集在中心，细胞呈放射状、漩涡状生长，2周左右可达80%汇合(图1B)。
2.2 hPDLSCs的鉴定
2.2.1 流式分析hPDLSCs表面抗原表达流式细胞仪检测结果显示第3代hPDLSCs阳性表达间质细胞表面标记物Stro-1(14.21%)、CD146(99.15%)、CD90(99.55%)，阴性表达造血细胞表面标记物CD45(0.15%)、CD31(0.49%)，证实所取得细胞为间充质来源(图2)。

2.2.2 免疫组化染色鉴定结果 第3代hPDLSCs抗波形蛋白(vimentin)染色阳性，细胞胞浆呈均匀棕黄色(图3A)；抗角蛋白(Cytokeratin)染色为阴性(图3B)，证实所取得的细胞为间充质来源而非上皮来源。

2.2.3 细胞多向分化能力 第3代hPDLSCs经过21 d成骨诱导后茜素红染色呈阳性，光镜下可见大量矿化结节的形成(图4A)；第3代hPDLSCs经过21 d成脂诱导后油红O染色呈阳性，光镜下可见脂滴生成(图4B)，证实hPDLSCs具有较强的多向分化潜能。

2.3 碱性磷酸酶活性 各组hPDLSCs成骨诱导1，3，5，7 d检测碱性磷酸酶表达量。结果显示随时间推移，3组碱性磷酸酶的表达量均呈上升趋势。雌激素组和Wnt3a组各时间点碱性磷酸酶的表达量均明显高于对照组(P < 0.05)，而雌激素组和Wnt3a组间各时间点的表达量差异无显著性意义(P > 0.05，表1，图5)。

2.4 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨相关蛋白表达 成骨诱导7 d后采用Western blot检测对照组与实验组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、CyclinD1及成骨相关蛋白Runx-2、OCN表达(图6)，采用Quantity one软件计算各目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值比值，得到各目的蛋白相对表达量(表2，图7)，雌激素组和Wnt3a组相较于对照组各目的蛋白相对表达量差异均有显著性意义(P < 0.05)，而雌激素组和Wnt3a组间各目的蛋白相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

牙周病是口腔三大疾病之一，其最主要的病理学改变为牙槽骨吸收，进而引起牙齿松动脱落^[1]。现如今牙周病的治疗目标已经从控制牙周炎症，减缓阻止牙槽骨吸收转变为使已破坏的牙周组织再生以形成新的结缔组织附着。因此，牙周组织工程技术应运而生。Seo等^[2]于2004年首次从健康离体牙周膜组织中分离出人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)。独特的组织学来源使得hPDLSCs成为牙周组织工程首选的种子细胞，其具有较强的自我更新和多向分化能力，在牙周组织的再生修复中具有重要作用^[3]。

雌激素是调节人体骨代谢和维持内环境稳态的重要物质^[4-5]。研究已经证实雌激素缺乏与绝经后骨质疏松的直接相关性^[6]，作为骨代谢最旺盛的牙槽骨，研究也发现体内雌激素缺乏可引起牙槽骨的骨代谢加快而导致颌骨的骨密度降低^[7]。雌激素可通过与细胞表面的特异性受体结合后直接作用于成骨细胞和破骨细胞而对成骨过程产生调控作用^[8]。已有实验发现，雌激素能促进hPDLSCs骨向分化^[9-10]。但雌激素调控hPDLSCs成骨分化的具体机制目前尚未明确。hPDLSCs成骨分化是一个极其复杂的生物学过程，受到诸如Wnt/β-catenin通路、MAPK通路、Smads蛋白通路、Notch等信号转导通路的调节^[11-13]。Wnt/β-catenin信号通路已被证明在间充质干细胞增殖、分化、凋亡等过程均产生调控作用^[14-15]，而对于雌激素促hPDLSCs骨向分化作用，Wnt/β-catenin信号通路是否参与调控目前少有研究报道。为此作者设计了该实验，旨在探讨Wnt/β-catenin信号通路是否参与调控雌激素刺激下hPDLSCs成骨分化过程，以期初步阐明雌激素作用下hPDLSCs成骨分化过程的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2017年5至10月在西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室完成。

1.3 材料 α-MEM培养基、胰蛋白酶、青链霉素(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；Ⅰ型胶原酶(Biosharp公司，中国)；免疫组化染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；重组人Wnt3a蛋白、兔β-catenin单克隆抗体、兔GSK-3β单克隆抗体、兔P-GSK-3β多克隆抗体、兔CyclinD1单克隆抗体、鼠RUNX2单克隆抗体、鼠OCN单克隆抗体以及鼠CD90、Stro-1、CD146、CD45、CD31流式抗体(BD公司，美国)；雌激素、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛(Sigma公司，美国)；RIPA裂解液、硝酸纤维素膜、显影定影试剂盒、茜素红染液、油红O染液(碧云天公司，中国)；电泳转膜系统(Bio-Rad公司，美国)；CO₂孵箱(Heraeus公司，德国)；流式细胞仪(BD公司，美国)；倒置相差显微镜及照相系统(Olympus公司，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 hPDLSCs的分离培养、纯化和鉴定 该研究通过西南医科大学附属口腔医院伦理委员会审查批准(审批号：20170518002)。原代培养参考以往文献报道的方法^[2^，^12]，收集西南医科大学附属口腔医院颌面外科门诊因正畸减数拔除的牙体牙周均健康的第一或第二前磨牙14颗，牙齿拔出后立即用高浓度PBS溶液沿根冠向冲洗3遍后30 min内转入超净工作台继续操作，再次用高浓度PBS溶液冲洗后冠根向小心刮取根中1/3区域的牙周膜组织，加入Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃恒温水浴箱内消化45 min后终止消化并离心(转速1 000 r/min，离心5 min)，加入含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基3 mL重悬细胞，接种于培养瓶内，置入CO₂恒温培养箱内培养。每隔2 d或3 d半量换液，待细胞从组织块边缘爬出并生长汇合达80%时，有限稀释克隆法筛选培养 hPDLSCs，待克隆长至1/2后消化，扩大培养。

1.4.2 hPDLSCs鉴定

流式鉴定：取第3代hPDLSCs，0.25%胰蛋白酶消化后常规离心制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹并将其分装至EP管中使每管体积为500 μL，分别加入STRO-1、CD146、CD90、CD31、CD45流式抗体，4 ℃避光孵育30 min后流式细胞仪上机检测上述表面标记物的表达。

免疫组化染色检测：取第3代hPDLSCs，0.25%胰蛋白酶消化后按密度1×10⁵/孔接种于24孔板，镜下观察细胞长至70%左右汇合时，40 g/L多聚甲醛固定10 min，按照免疫组化染色试剂盒说明书进行操作。体积分数为3%去离子双氧水中浸泡15 min，山羊血清封闭15 min，加入用PBS按浓度为1︰150稀释后的波形蛋白(Vimentin)、角蛋白(Cytokeratin)一抗，对照组一抗则用等量的PBS作为阴性对照。4 ℃孵育过夜取出后室温放置30 min，加入PBS漂洗2遍后加入按浓度为1︰200稀释的辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育30 min，DAB显色、苏木精复染、无水乙醇脱水，置于镜下观察并采集图像。

多向分化能力鉴定：取第3代hPDLSCs，0.25%胰蛋白酶消化后按照密度2×10⁵/孔接种于6孔板中，镜下观察细胞达到80%左右汇合时每孔加入3 mL成骨诱导液(含10 mmol/L β-甘油磷酸钠、1×10^-⁸ mol/L地塞米松、50 ng/L维生素C、体积分数为10%胎牛血清的α-MEM基础培养基)开始诱导培养。常规3 d换液1次，成骨诱导21 d后进行茜素红染色观察矿化结节形成情况，置于镜下观察并采集图像。

取第3代hPDLSCs，0.25%胰蛋白酶消化后按照密度2×10⁵/孔接种于6孔板中，镜下观察细胞达到100%左右汇合时每孔加入3 mL成脂诱导液(含10 mmol/L 吲哚美辛、5 mmol/L IBMX、20 μg/L胰岛素、1×10^-⁴mol/L地塞米松、体积分数为10%胎牛血清的α-MEM基础培养基)开始诱导培养。常规3 d换液1次，成脂诱导21 d后进行油红O染色观察脂滴形成情况，置于镜下观察并采集图像。

1.4.3 碱性磷酸酶活性检测 取细胞生长状态良好的第3代hPDLSCs消化离心制成细胞悬液，按2×10³/孔的密度接种于96孔板并将细胞随机分为3组(1个对照组和2个实验组)，每组设3个复孔，置于37 ℃ CO₂恒温培养箱继续培养，待细胞扩增至80%时对照组加入成骨诱导液，2个实验组分别加入含1×10^-⁷ mol/L雌激素的成骨诱导液(雌激素组)，含100 μg/L Wnt3a的成骨诱导液(Wnt3a组)，雌激素和Wnt3a的工作浓度参考以往文献中的常用剂量^[9^，^16]，常规2 d或3 d换液1次，各组分别于成骨诱导培养1，3，5，7 d 后停止培养，PBS反复冲洗后按碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行操作，酶标仪检测各孔520 nm波长处的吸光度值(A值)，取平均值进行统计分析。

1.4.4 Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨相关蛋白表达 取细胞生长状态良好的第3代hPDLSCs消化离心制成细胞悬液，按5×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，并将细胞随机分为3组(1个对照组和2个实验组)，置于37 ℃ CO₂恒温培养箱继续培养，待细胞扩增至80%时对照组加入成骨诱导液，2个实验组分别加入含1×10^-⁷ mol/L雌激素的成骨诱导液(雌激素组)、含100 μg/L Wnt3a的成骨诱导液(Wnt3a组)，常规2 d或3 d换液1次，培养7 d后，提取各组总蛋白，Western blot检测各组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、CyclinD1以及成骨相关蛋白Runx-2、OCN的表达。结果用Bio Rad凝胶摄像分析，再用Quantity One软件分析条带灰度值，用灰度值表示目的蛋白的表达水平，以各目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH的灰度值得到各目的蛋白的相对表达量，以每组目的蛋白相对表达量统计各组之间的差异性。

1.5 主要观察指标 ①hPDLSCs原代培养及纯化后的细胞形态；②hPDLSCs的鉴定结果；③雌激素和Wnt3a作用后Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关标记物的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件统计分析所得数据，所有数据均以x(_)±s表示，采用独立样本t 检验比较实验组和对照组之间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

慢性牙周炎是以牙槽骨量丧失为特征的细菌感染性疾病，临床表现为牙龈黑三角、牙根暴露甚至牙齿脱落缺失等，严重影响颜面部美观和健康^[17]。传统的牙周治疗手段往往局限于控制牙周疾病的进一步发展，均不能良好地恢复已丧失的骨组织^[18]。近年来，组织工程技术的快速发展，使得牙周组织再生改建成为可能。通过将成体干细胞接种于生物材料之上，体外培养一段时间后再植入到组织缺损部位，即可在该部位实现缺损组织的修复重建。种子细胞、生长因子、细胞支架材料是牙周组织工程三大要素。选择与组织缺损部位来源相同、功能相关的成体干细胞，同时配合选用生物相容性优良的生物材料，创造利于二者结合后继续生长的微环境，便能够最大程度恢复缺损组织的形态和功能^[19-20]。hPDLSCs来源于牙周膜，独特的组织来源决定了它是牙周组织工程首选的种子细胞^[21-22]。实验采用消化组织块法联合有限稀释克隆法成功分离培养得到纯化的hPDLSCs，经流式鉴定细胞表面抗原标记物后证实所获细胞为间充质来源，且表面抗原标记物阳性表达率较高，证实有限稀释克隆法在干细胞纯化中可获得较高的提纯率。免疫组化染色结果显示抗波形蛋白(vimentin)染色阳性，细胞胞浆呈均匀棕黄色；抗角蛋白(Cytokeratin)染色为阴性，证实所取得细胞为间充质来源而非上皮来源。成骨成脂诱导实验证实该细胞具有较强的多向分化潜能。以上实验进一步证实了所获取细胞为间充质干细胞来源，具有成体干细胞的典型特征。实验成功为组织工程研究获取了可靠的种子细胞。

Wnt信号通路是生物进化过程中极为保守的一条通路，广泛存在于多细胞真核生物代谢活动中，根据是否依赖于β-catenin蛋白将其分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路。Wnt/β-catenin通路被激活时，GSK-3β被磷酸化而丧失活性，β-catenin蛋白在细胞内聚集，并转移至胞核内与转录因子/淋巴增强因子结合，调节下游靶基因如CyclinD1等的表达，从而调控干细胞的增殖、分化、凋亡等一系列代谢活动^[23-25]。但目前Wnt/β-catenin 信号通路对于hPDLSCs成骨分化过程的作用目前学术界尚存在争议，研究认为Wnt/β-catenin信号通路可促进hPDLSCs成骨分化而抑制成脂分化^[26]，Chen等^[27]发现黄芩素可通过激活Wnt/β-catenin信号通路而促进hPDLSCs成骨分化。但也有学者研究发现糖基化终末产物可通过下调DKK-1表达水平激活Wnt/β-catenin信号通路而抑制hPDLSCs骨向分化^[28]。对此作者认为Wnt/β-catenin信号通路对骨向分化抑制或促进作用的实现可能与细胞所处的代谢微环境、细胞代数、状态等原因有关。Wnt3a蛋白作为Wnt/β-catenin通路激活剂，通过下调GSK-3β的表达水平而激活信号通路产生调控作用^[29]。实验设置单纯成骨诱导液组(对照组)、含1×10^-⁷ mol/L雌激素成骨诱导液组(雌激素组)和含100 μg/L Wnt3a成骨诱导液组(Wnt3a组)。Western blot检测结果显示：加入外源性Wnt3a蛋白作用于hPDLSCs成骨诱导过程后β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1蛋白表达水平相应升高(P < 0.05)，而GSK-3β表达水平降低(P < 0.05)，经典Wnt信号通路被激活。同期检测的成骨各期指标(ALP、Runx2、OCN)均出现显著表达，且明显高于对照组(P < 0.05)。另外实验还发现加入雌激素和Wnt3a两组成骨各期标记物的表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，激活经典Wnt信号通路与加入雌激素得到的促hPDLSCs成骨分化作用水平相当，由此作者推测Wnt/β-catenin信号通路积极参与了hPDLSCs成骨分化。

绝经后妇女常因体内雌激素水平降低而导致全身骨质流失，引发绝经后骨质疏松。部分患者还可能伴发不同程度的牙槽骨骨质疏松症状^[30-31]。雌激素替代疗法目前已较成熟地应用于临床，对于绝经后骨质疏松疗效明显。有研究发现，去卵巢后大鼠骨小梁数量和厚度均出现下降^[32-33]，骨形成相关指标如血清碱性磷酸酶、骨钙素等表达水平也出现降低，给予小剂量雌激素治疗后，骨小梁密度、体积增加，骨质疏松症状得到缓解。研究者们发现雌激素替代疗法还可减轻牙周炎引起的附着丧失和牙槽骨吸收，保留牙槽骨骨量^[34-35]。以上研究均表明雌激素积极地参与了人体的成骨活动。在雌激素与hPDLSCs的研究中，一项体外实验指出生理剂量雌激素的长期作用可维持hPDLSCs的特性^[36]。Pan等^[9]认为雌激素通过与hPDLSCs表面雌激素受体结合可增强骨钙素和碱性磷酸酶的表达及矿化结节的形成。由此可见雌激素或许可调控hPDLSCs成骨分化。该研究中，将雌激素加入成骨诱导液后各时间点均可检测到成骨早期标志物碱性磷酸酶高水平表达，且随时间推移逐渐升高，其表达量远远高于对照组(P < 0.05)，成骨中晚期相关蛋白Runx2、OCN表达水平也高于对照组(P < 0.05)。由此作者认为外源性雌激素可增强hPDLSCs成骨分化能力。同时对经典Wnt信号通路的重要因子β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1和GSK-3β进行检测，发现β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1表达量明显高于对照组(P < 0.05)，而GSK-3β显著低于对照组(P < 0.05)。这提示在雌激素作用的微环境下，hPDLSCs中的Wnt/β-catenin信号通路将会被活化参与其成骨分化过程。

综上所述，雌激素及外源性Wnt3a蛋白可活化hPDLSCs中的Wnt/β-catenin信号通路，促进hPDLSCs成骨分化。雌激素的促hPDLSCs成骨作用可能与Wnt/β-catenin信号通路激活有关，但雌激素作用于Wnt/β-catenin信号通路的作用位点尚有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化

Estrogen regulates osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells via Wnt/beta-catenin signaling pathway

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