负载重组人骨形态发生蛋白2磷酸钙骨水泥与纤维蛋白胶复合材料促进骨质疏松性骨折的愈合

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1665

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

磷酸钙骨水泥：是一种塑形准确、生物相容性好、易降解吸收的骨修复材料，可被注射到骨折部位，具有传导性成骨作用，可与骨形成较严密的连接，且固化后可形成大量的微孔结构，可作为药物缓释载体。已有研究证实，磷酸钙骨水泥可作为骨形态发生蛋白的载体，缓慢释放骨形态发生蛋白，促进新骨生长。

纤维蛋白胶：是一种具有良好黏结作用和可注射性的低抗原生物大分子材料，易于降解，可塑性良好，可促进组织再生，已被证实可负载多种生长因子发挥缓释作用。有研究将纤维蛋白胶引入磷酸钙骨水泥中，发现其克服了磷酸钙骨水泥脆性较大的不足，同时又保留了磷酸钙骨水泥良好的骨传导作用。

背景：骨形态发生蛋白2是目前研究最广泛与诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一，但是单纯骨形态发生蛋白植入后会被组织液稀释及蛋白酶分解，不能保持持久的药物浓度，难以发挥有效的骨诱导作用。

目的：实验以磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料作为骨形态发生蛋白2的载体，观察其对骨质疏松性骨折的修复效果。

方法：取54只雌性SD大鼠，切除双侧卵巢制作骨质疏松模型，3个月后制作股骨中段骨折模型，随机分成3组，每组18只，克氏针内固定组骨折断端不注射任何材料；复合材料组骨折断端注射0.5 mL磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，载生长因子复合材料组骨折断端注射0.5 mL负载重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料。骨折后4，12周，进行股骨骨折标本X射线检查、Micro-CT检测、生物力学三点弯曲实验及病理观察。

结果与结论：①载生长因子复合材料组骨折愈合评分高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；②载生长因子复合材料组骨折后4，12周的骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，骨小梁分离度均低于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；③载生长因子复合材料组骨折后4，12周的最大载荷、刚度均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，骨折后4周的弹性模量高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；④克氏针内固定组骨折后4周主要可见纤维软骨骨痂，骨折后12周骨痂重塑为板状骨，硬骨痂含量较少；复合材料组、载生长因子复合材料组骨折后4周可见明显的纤维性骨痂与软骨性骨痂，载生长因子复合材料组硬骨痂含量较复合材料组多，骨折后12周硬骨痂重塑为板状骨；⑤结果说明，负载重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，可促进骨质疏松性骨折的愈合，提高骨强度。

ORCID: 0000-0003-3150-1855(李浩亮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨质疏松性骨折, 磷酸钙骨水泥, 纤维蛋白胶, 复合材料, 重组人骨形态发生蛋白2, 骨折愈合, 生物力学

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 is a most widely studied and osteogenic-inducing bone morphogenetic protein. However, simple bone morphogenetic protein can be diluted by tissue fluid and decomposed by protease after implantation, so it is difficult to maintain sustained drug concentration or play an effective role in bone induction.

OBJECTIVE: To observe the effect of repairing osteoporotic fracture through calcium phosphate cement/fibrin glue composite as the carrier of bone morphogenetic protein 2.

METHODS: Fifty-four female Sprague-Dawley rats were selected to remove bilateral ovaries for making osteoporosis models. Three months later, the middle femoral fracture models were made, and then randomized into three groups, with 18 rats in each group. Kirschner wire fixation group was injected nothing. The fracture end was injected with 0.5 mL calcium phosphate cement/fibrin glue (composite group) or calcium phosphate cement/fibrin glue loaded with recombinant human bone morphogenetic protein 2 (loaded group). At 4 and 12 weeks after fracture, X-ray examination, micro-CT examination, biomechanical three-point bending test and pathological observation were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The fracture healing score in the loaded group was higher than that in the other two groups (P < 0.05). (2) The bone volume fraction, trabecular thickness and number of trabeculae at 4 and 12 weeks in the loaded group were higher than those in the other two groups (P < 0.05), and the trabecular segregation was lower than that in the other two groups (P < 0.05). (3) The maximum load and stiffness at 4 and 12 weeks in the loaded group were higher than those in the other two groups (P < 0.05), and the elastic modulus at 4 weeks after fracture was higher than that in the other two groups (P < 0.05). (4) Fibrocartilage callus was mainly seen at 4 weeks after fracture in the Kirschner wire fixation group, and the callus was reconstructed into lamellar bone at 12 weeks after fracture with less callus content. Obvious fibrocartilage callus appeared at 4 weeks after fracture in the composite and loaded groups, and the callus was reconstituted into a plate-like bone at 12 weeks. (5) These results imply that the calcium phosphate cement/fibrin glue composite loaded with recombinant human bone morphogenetic protein 2 can promote the healing of osteoporotic fracture and improve bone strength.

Key words: Osteoporotic Fractures, Fracture Healing, Calcium Phosphates, Bone Morphogenetic Proteins;, Biomechanics, Tissue Engineering

中图分类号:

李浩亮，王西彬，左瑞庭. 负载重组人骨形态发生蛋白2磷酸钙骨水泥与纤维蛋白胶复合材料促进骨质疏松性骨折的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(14): 2156-2161.

Li Haoliang, Wang Xibin, Zuo Ruiting. Calcium phosphate cement/fibrin glue composite loaded with recombinant human bone morphogenetic protein 2 promotes osteoporotic fracture healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(14): 2156-2161.

图/表（结果） 5

2.1 骨质疏松造模情况 54只SD大鼠造模前与造模后的骨密度值分别为(243.23±3.09)，(183.49±6.28) mg/cm²，造模后的骨密度值明显低于造模前(P < 0.05)，提示实验骨质疏松造模成功。造模过程中，有6只大鼠造模失败，采用相同方法再次造模，保证实验大鼠数量为54只。

2.2 骨折愈合X射线评估见图1。

X射线片显示，克氏针内固定组、复合材料组、载生长因子复合材料组骨折后4周均可见清晰的骨折线，克氏针内固定组、复合材料组骨痂量较少，载生长因子复合材料组骨痂量较多；至骨折后12周时，3组骨折线较模糊或已消失，骨痂密度已接近周围正常骨皮质。

骨折后4周时，克氏针内固定组、复合材料组骨折愈合评分低于载生长因子复合材料组(P < 0.05)，克氏针内固定组、复合材料组骨折愈合评分比较无差异(P > 0.05)；骨折后12周时，3组骨折愈合评分均较术后4周时明显升高(P < 0.05)，克氏针内固定组、复合材料组骨折愈合评分低于载生长因子复合材料组(P < 0.05)，克氏针内固定组、复合材料组骨折愈合评分比较无差异(P > 0.05)，见图2。

2.3 Micro-CT检测结果骨折后4周时，载生长因子复合材料组骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，骨小梁分离度低于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；克氏针内固定组与复合材料组骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量比较无差异(P > 0.05)。骨折后12周时，3组骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量均较骨折后4周时升高，骨小梁分离度较骨折后4周时降低；载生长因子复合材料组骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，骨小梁分离度低于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；克氏针内固定组与复合材料组骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量比较无差异(P > 0.05)。具体结果见表1。

2.4 生物力学三点弯曲实验结果骨折后4周，载生长因子复合材料组最大载荷、弹性模量、刚度均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；复合材料组最大载荷、弹性模量均高于克氏针内固定组(P < 0.05)，两组刚度比较无统计学差异(P > 0.05)。骨折后12周，各组最大载荷、弹性模量、刚度均较骨折后4周时明显升高；载生长因子复合材料组最大载荷、刚度均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，弹性模量与克氏针内固定组、复合材料组比较无差异(P > 0.05)；克氏针内固定组与复合材料组最大载荷、弹性模量、刚度比较差异均无差异(P > 0.05)。具体结果见表2。

2.5 病理观察结果苏木精-伊红染色显示，克氏针内固定组骨折后4周主要可见纤维软骨骨痂，骨折后12周骨痂重塑为板状骨，硬骨痂含量较少；复合材料组、载生长因子复合材料组骨折后4周可见明显的纤维性骨痂与软骨性骨痂，并且载生长因子复合材料组硬骨痂含量较复合材料组多，骨折后12周硬骨痂重塑为板状骨，见图3。

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引言

骨质疏松是一种以骨量减少、骨微观结构发生变化、骨强度降低为特征的全身性骨骼疾病，其发病机制尚不明确^[1]。2010年中国流行病学调查显示，70岁以上男性骨质疏松患病率为14.2%-18.9%，女性为40.0%-59.3%^[2-3]。骨质疏松患者骨量减少后，骨强度降低、脆性增加，易发生骨折，其为骨质疏松最常见的严重并发症。国外报道显示，骨质疏松性骨折患者平均每年增加150万，其危害程度已超过糖尿病、脑卒中等疾病，致残率及致死率也较高^[4]。因此加强对骨质疏松性骨折的重视具有重要的社会意义。

研究已证实，骨形态发生蛋白是具有诱导成骨作用的生物活性因子，是骨组织形成过程中最关键的调节因子，可明显增加骨形成量，提高骨折愈合强度和速度^[5-8]。但是，单纯骨形态发生蛋白植入后会被组织液稀释及蛋白酶分解，不能保持持久的药物浓度，其在体内外促进成骨作用的发挥依赖于与适宜的载体系统结合^[9]。在载体方面，磷酸钙骨水泥和纤维蛋白胶构建的复合支架材料具有良好的力学性能，纤维蛋白胶的引入加速了磷酸钙在体内的降解代谢，增强了磷酸钙骨水泥的抗压强度^[10]。国内外采用磷酸钙骨水泥与纤维蛋白胶作为载体用于骨缺损或骨折已有较多的研究^[11-14]，将骨形态发生蛋白2负载于磷酸钙骨水泥或纤维蛋白胶材料也有相关报道，但将骨形态发生蛋白负载于磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料的研究不多。因此，实验以磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料作为骨形态发生蛋白2的载体，观察其对骨质疏松性骨折的修复效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对照观察，动物体内观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年1至12月在河南省中医院完成。

1.3 材料 InAlyzer小动物双能X射线骨密度仪(深圳柏安诺科技有限公司)；磷酸钙骨水泥(上海瑞邦生物材料有限公司)；纤维蛋白胶(广州倍绣生物技术有限公司)；重组人骨形态发生蛋白2(艾美捷科技有限公司)；小动物Micro CT扫描(上海软拓生物科技有限公司)；戊巴比妥钠(湖北鸿运隆生物科技有限公司)；生物力学试验机(HY-1080，上海衡翼精密仪器有限公司)。

实验动物：4月龄雌性SD大鼠54只，清洁级，体质量(220.58±30.14) g，购自郑州大学实验动物中心。将54只大鼠随机分成3组，分别为克氏针内固定组、复合材料组与载生长因子复合材料组，每组18只。实验过程中对大鼠的处置严格依照动物伦理学要求进行。实验方案经郑州大学实验动物中心动物实验伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 制备负载生长因子的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料取重组人骨形态发生蛋白2，称质量后浸泡于纤维蛋白胶溶解液中，4 ℃静置24 h，随后在玻璃匀浆器中研磨为混悬液，再加入生物胶主体中，制备重组人骨形态发生蛋白2/主体胶混悬液；另外制备催化剂溶液。将磷酸钙骨水泥的固相与液相按照10 mg∶1 mL的比例搅拌成膏状，随后注入相同体积的重组人骨形态发生蛋白2/主体胶混悬液与催化剂溶液，人骨形态发生蛋白2/主体胶混悬液与催化剂溶液的体积比为2∶1。复合材料中重组人骨形态发生蛋白2的质量约为0.5 mg^[15]。

1.4.2 制作骨质疏松大鼠模型取上述3组大鼠，注射1%戊巴比妥钠(4 mL/kg)麻醉，以仰卧位固定于手术台上，腹部正中去毛并消毒处理，在无菌条件下切开腹部，逐层分离，暴露输卵管并于其末端寻找卵巢，切除双侧卵巢，缝合皮肤，包扎伤口。术后分笼饲养大鼠3 d，每只大鼠腹腔注射40×10⁴ U青霉素，预防感染。术后动物正常进食水。造模前及造模后3个月，采用小动物双能X射线骨密度仪检测大鼠全身骨密度，每个大鼠均测量3次，最后取平均值，确认造模是否成功。

1.4.3 制作大鼠骨折模型骨质疏松造模3个月后，取上述3组大鼠，注射1%戊巴比妥钠(4 mL/kg)麻醉，以仰卧位固定于手术台上，暴露右侧股骨，于股骨远端外侧做一切口，逐层分离，暴露股骨远端外侧，切开膝关节囊，暴露髁间窝，采用1.0 mm厚度的钢锯锯断股骨中段，建立骨折模型。

1.4.4 实验分组治疗情况骨折造模成功后，采用电钻从骨折端逆行向近端打入1根1 mm的克氏针，将克氏针从髓腔自股骨近侧端穿出软组织，复位骨折后，将打入近端的克氏针顺行插入远端髓腔，截断近端克氏针并保证远端埋入膝关节面下，克氏针内固定组骨折断端不注射任何材料，复合材料组骨折断端注射0.5 mL磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，载生长因子复合材料组骨折断端注射0.5 mL负载重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料。术后分笼饲养大鼠3 d，正常进食水。连续3 d每只大鼠每天注射40×10⁴ U青霉素，预防感染。

1.5 主要观察指标

X射线检查：骨折后4，12周，每个时间点每组选择9只大鼠，拍摄股骨正位X射线片，观察骨痂生成情况。同时进行X射线骨折线愈合评分，评分包括骨折线距离大小、骨折线间骨痂、矿化组织含量3个部分，每部分分为0，1，2分，总分6分，评分越高提示骨折愈合情况越好^[16]。骨折愈合评分由2名医师完成。X射线检查后，取股骨造模处标本，选择一部分进行后续骨形态计量参数检测与生物力学检测；另一部分常规包埋切片，苏木精-伊红染色行组织学观察。

骨形态计量参数检测：骨折后4，12周X射线检查完成后，取股骨造模处标本，剔除周围软组织，40 g/L多聚甲醛固定，保存于体积分数70%乙醇中，进行Micro-CT扫描，扫描方法：旋转180°，步长4°，分辨率为12 µm，曝光 700 ms。选择一骨折线为中心的上下各200层作为感兴趣区，进行图像二值化，分析骨折断端新生骨痂情况，观察指标包括骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量与骨小梁分离度等。

生物力学三点弯曲实验：以PBS浸泡标本30 min，使标本保持湿润，将标本置于生物力学试验机上，上方压力装置定位于骨折中心，加载跨距为10 mm，支点跨距 20 mm，加载速度设为2 mm/min，直至标本断裂，电脑记录载荷变形曲线，计算最大载荷、弹性模量及刚度。

病理观察：取脱钙标本，沿股骨纵轴切片，切片厚度 5 µm，梯度乙醇脱水，二甲苯透明30 min，石蜡包埋，进行常规苏木精-伊红染色。

1.6 统计学分析运用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量数据以x(_)±s形式表达，进行定量数据t 检验，等级数据和方差不齐的计量数据采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨形态发生蛋白由Urist于1965年发现的^[17]，目前已相继分离纯化出40多种骨形态发生蛋白，其中骨形态发生蛋白2的诱导成骨活性最强，也成为目前研究的热点。骨形态发生蛋白2主要具有两方面的生物学效应^[18-19]：募集间充质干细胞，诱导其分化为骨与软骨；与其他生长因子共同参与骨组织的形成。在骨质疏松性骨折中，骨重建速度明显减慢，致使骨折难以愈合，但在局部增加骨形态发生蛋白2的浓度则可促进骨折愈合，其作用机制为：骨形态发生蛋白2诱导间充质干细胞在骨组织形成区增殖、迁移并向成骨方向分化，同时与其他成骨因子一起刺激成骨细胞增殖，加速骨改建^[20-21]。因此，在骨质疏松性骨折处适当增加其局部的骨形态发生蛋白2浓度，将有助于骨质疏松骨折的愈合。但是骨形态发生蛋白的半衰期较短，发挥作用的时间较短，并且由于体液的稀释与酶的降解，使其很难有效发挥生物学效应。选择合适的载体对于骨形态发生蛋白生物效应的发挥至关重要。

磷酸钙骨水泥是一种塑形准确、生物相容性好、易降解吸收的骨修复材料，可被注射到骨折部位，具有传导性成骨作用，可与骨形成较严密的连接，且固化后可形成大量的微孔结构，可作为药物缓释载体^[22-24]。并且已有研究证实，磷酸钙骨水泥可作为骨形态发生蛋白的载体，缓慢释放骨形态发生蛋白，促进新骨生长^[25-26]。但是磷酸钙骨水泥单独应用存在脆性较大的问题。纤维蛋白胶是一种具有良好黏结作用和可注射性的低抗原生物大分子材料，易于降解，可塑性良好，可促进组织再生，已被证实可负载多种生长因子发挥缓释作用^[27-29]。有研究将纤维蛋白胶引入磷酸钙骨水泥中，发现其克服了磷酸钙骨水泥脆性较大的不足，同时又保留了磷酸钙骨水泥良好的骨传导作用^[30]。因此，实验选择磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料作为重组人骨形态发生蛋白2的载体。

研究通过切除4月龄雌性SD大鼠卵巢来建立骨质疏松性模型，因去卵巢大鼠的代谢状况与绝经后妇女相似，是目前研究骨质疏松最常用的模型^[31]。切除大鼠卵巢3个月后，双能X射线检测骨密度值分别为(243.23±3.09)，(183.49±6.28) mg/cm²，造模后的骨密度值明显低于造模前(P < 0.05)，提示实验骨质疏松造模成功。

骨折愈合受多种生长因子及力学因素影响的复杂过程，主要分为纤维性骨痂、软骨骨痂及骨性骨痂期^[32]；骨折早期主要形成纤维及软骨性骨痂，稳定骨折并逐渐被血管化，后期主要是纤维软骨骨痂矿化形成硬骨痂并被重塑为板状骨痂，因此组织学与形态学的恢复对骨折愈合尤为重要。此次研究X射线检查显示，骨折后4周3组均可见清晰的骨折线，克氏针内固定组、复合材料组骨痂量较少，载生长因子复合材料组骨痂量较多，随着时间的延长，至骨折后12周时，3组骨折线已消失，骨痂已重塑为皮质骨，但是骨折愈合评分显示载生长因子复合材料组骨折愈合最好。为了更加全面的分析负载重组人骨形态发生蛋白2磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料对骨质疏松骨折的修复作用，采用病理组织切片与Micro-CT进一步观察了松质骨骨小梁形态与结构。骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度是评估骨量的重要骨组织学形态参数，可综合反映骨形成状态^[33-34]。Micro-CT检测结果显示，载生长因子复合材料组骨折后4，12周的骨体积分数、骨小梁厚度及骨小梁数量均高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，骨小梁分离度均低于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)；病理切片观察显示骨折后12周，克氏针内固定组骨痂重塑为板状骨，但硬骨痂含量较少，复合材料组、载生长因子复合材料组硬骨痂重塑为板状骨，以上结果提示负载重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，可加速骨小梁成熟速度，促进骨折愈合。张君^[35]研究骨质疏松性骨折模型中，在骨折局部注射慢病毒介导的骨形态发生蛋白2质粒，证实慢病毒介导的骨形态发生蛋白2能促进骨形成，促进骨折部位愈合，对骨质疏松性骨折具有很好的治疗效果，与此次实验结果一致。

修复骨折不仅要恢复骨形态的连续性，更要重建骨的支撑性能，恢复其力学强度。生物力学可直接反映骨质量变化，是全面评估骨质量的可靠指标^[36-37]。三点弯曲实验显示，复合材料组骨折后4周的最大载荷、弹性模量较克氏针内固定组显著升高(P < 0.05)，而骨折后12周时的最大载荷、弹性模量与克氏针内固定组无统计学差异，分析原因可能为：在骨折早期，磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料自身的机械性能提供了一定的力学支撑作用，但后期复合材料降解，至12周时骨的力学性能与克氏针内固定组无差异。而在骨折后4，12周，载生长因子复合材料组最大载荷、刚度始终高于克氏针内固定组、复合材料组(P < 0.05)，分析原因可能为：复合材料的网状微观结构更利于骨形态发生蛋白2的附着及其与靶细胞接触，而复合材料强大的黏着力有利于骨形态发生蛋白2的缓慢释放，因此随着复合材料的逐渐降解，在植入材料周围形成了骨形态发生蛋白2释放浓度梯度，增加了其与靶细胞的作用时间，促进靶细胞的增殖与成骨活性，促进材料的骨爬行替代。结果说明负载重组人骨形态发生蛋白2的磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合材料，可促进骨质疏松性骨折的愈合，并提高其力学强度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程