人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0463

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1350-1356.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0463

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人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析

任浩¹，董静²，刘力伟²，陈照林²，潘劲劲²，陈曦²，宋海燕²，张骏飞²，陈从新²，刘波²

¹安徽医科大学解放军临床学院，安徽省合肥市 230032；²解放军第一○五医院感染病科，安徽省合肥市 230031

修回日期:2017-11-25 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 刘波，副主任医师，副教授，硕士生导师，解放军第一○五医院感染病科，安徽省合肥市 230031
作者简介:任浩，男，1992年生，安徽省含山县人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事病毒性肝炎及终末期肝病方面的研究。
基金资助:
南京军区科技创新基金资助项目(15MS048)

Risk factors for hepatocellular carcinoma in hepatitis B cirrhosis patients given treatment with human umbilical cord mesenchymal stem cell

Ren Hao¹, Dong Jing², Liu Li-wei², Chen Zhao-lin², Pan Jin-jin², Chen Xi², Song Hai-yan², Zhang Jun-fei², Chen Cong-xin², Liu Bo

¹Clinical College of PLA of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; ²Department of Infection, the 105th Hospital of PLA, Hefei 230031, Anhui Province, China

Revised:2017-11-25 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Liu Bo, Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Infection, No. 105 Hospital of PLA, Hefei 230031, Anhui Province, China
About author:Ren Hao, Master candidate, Clinical College of PLA of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China
Supported by:
the Science and Technology Innovation Foundation of Nanjing Military Region of PLA, No. 15MS048

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人脐带间充质干细胞改善肝功能方面的作用：人脐带间充质干细胞来源于胎儿脐带组织，具有多种生物功能，在肝细胞生长因子和成纤维生长因子4的诱导下，能生成有功能的肝细胞样细胞，输入体内后能分泌大量的促肝细胞生长因子，具有修复受损肝细胞、改善肝脏微环境和恢复肝细胞功能的作用；还具有显著的免疫调节、抗炎性反应等作用。
终末期肝病：临床治疗效果差，病死率高，肝移植是目前最有效的治疗方法，但因供体肝缺乏，其实施受到限制。随着近些年免疫疗法的兴起，间充质干细胞为终末期肝病治疗提供了新方向，因其多向分化潜能，而成为研究的热点，大量实验证明间充质干细胞对于改善终末期肝病患者的肝功能具有良好的作用。

摘要
背景：随着间充质干细胞治疗的不断发展，相关文献报道干细胞治疗可能会导致肿瘤的发生发展。
目的：了解人脐带间充质干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的潜在风险。
方法：收集2011年1月至2013年12月在解放军第一○五医院感染病科住院治疗的乙型肝炎肝硬化患者，随访36个月，终点为确诊肝细胞癌。对可能影响肝细胞癌发生的相关危险因素进行单因素Logistic和多因素非条件Logistic回归分析。
结果与结论：①386例患者完成随访，其中171例接受人脐带间充质干细胞治疗的患者为观察组，215例仅接受常规内科综合治疗的患者为对照组；②随访12个月时，观察组肝细胞癌的发病率明显高于对照组(P < 0.05)，随访36个月时，观察组肝细胞癌的发生率为11.7%，对照组为9.8%(P > 0.05)；③单因素Logistic回归分析显示观察组和对照组内肝细胞癌患者在年龄、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3%)、高尔基体糖蛋白73(GP73)等方面均显著高于非肝细胞癌患者(P < 0.05)，多因素非条件Logistic回归分析显示仅甲胎蛋白异质体比率是人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的独立危险因素；④结果表明，人脐带间充质干细胞治疗不会导致乙型肝炎肝硬化患者3年内肝细胞癌总发病率的上升，但可能会引起肝细胞癌发病时间的提前；甲胎蛋白异质体比率可作为人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的早期预测指标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0756-4357(刘波)

关键词: 肝细胞癌, 慢性乙型肝炎, 肝硬化, 人脐带间充质干细胞, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: With the continuous development of mesenchymal stem cell therapy, it has been reported that stem cell therapy is likely to cause the occurrence and development of tumors.
OBJECTIVE: To investigate the potential risks of hepatocellular carcinoma (HCC) in patients with hepatitis B cirrhosis after receiving human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) transplantation.
METHODS: The study collected the information of patients with hepatitis B cirrhosis treated with hUC-MSCs, admitted at the Infectious Disease Department of the 105th Hospital of PLA from January 2011 to December 2013. The following investigation lasted 36 months. The follow-up was terminated at the time of diagnostic confirmation. The risk factors that may affect the occurrence of HCC were analyzed by univariate Logistic and multivariate unconditional Logistic regression analyses.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 386 patients were followed up, including 171 patients who received hUC-MSCs transplantation as the observation group and 215 patients only given general internal medicine treatment as the control group. (2) At the follow-up of 12 months, the incidence of HCC in the observation group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). At the follow-up of 36 months, the incidence of HCC was 11.7% in the observation group and 9.8% in the control group (P > 0.05). (3) Univariate Logistic regression analysis showed that the HCC patients had higher age, alpha-fetoprotein (AFP), alpha-fetoprotein variants (AFP-L3), AFP-L3 ratio (AFP-L3%), and Golgi glycoprotein 73 (GP73) than those with no HCC in both control and observation groups (P < 0.05). Multivariate unconditional Logistic regression analysis showed that only APF-L3% was an independent risk factor for HCC in patients with hepatitis B cirrhosis undergoing hUC-MSCs transplantation. Overall, hUC-MSCs transplantation does not increase the HCC incidence in patients with hepatitis B cirrhosis within 3 years, but it may lead to an early onset of HCC. AFP-L3% can be used as an early predictor of HCC in patients with hepatitis B cirrhosis undergoing hUC-MSCs transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Carcinoma, Hepatocellular, Hepatitis B, Chronic, Liver Cirrhosis, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

任浩，董静，刘力伟，陈照林，潘劲劲，陈曦，宋海燕，张骏飞，陈从新，刘波. 人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1350-1356.

Ren Hao, Dong Jing, Liu Li-wei, Chen Zhao-lin, Pan Jin-jin, Chen Xi, Song Hai-yan, Zhang Jun-fei, Chen Cong-xin, Liu Bo. Risk factors for hepatocellular carcinoma in hepatitis B cirrhosis patients given treatment with human umbilical cord mesenchymal stem cell[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1350-1356.

图/表（结果） 2

2.1 研究对象入组流程 见图3。

2.2 一般情况 共筛选出符合条件的乙型肝炎肝硬化386例完成了随访，其中171例接受人脐带间充质干细胞治疗的患者为观察组，215例仅接受常规内科治疗的患者为对照组。两组患者的一般情况、各项指标的基线水平基本一致，见表1。

随访至6个月时观察组有7例、对照组有2例患者发生了肝细胞癌(P < 0.05)；12个月时观察组有14例、对照组有6例患者发生了肝细胞癌(P < 0.05)；24个月时观察组有17例、对照组有16例患者发生了肝细胞癌(P > 0.05)；36个月时观察组有20例、对照组有21例患者发生了肝细胞癌(P > 0.05)，见图4。

两组内的肝细胞癌患者与非肝细胞癌患者比较，性别、各项生化指标的基线水平以及MELD评分等均与肝细胞癌的发生无关，而在年龄、AFP、AFP-L3、AFP-L3%、GP73等指标上差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 肝细胞癌组与非肝细胞癌组发生肝细胞癌危险因素的单因素Logistic回归分析比较 单因素分析结果显示：肝细胞癌组患者在接受人脐带间充质干细胞移植治疗前其年龄、AFP、AFP-L3、AFP-L3%、GP73基线水平明显高于非肝细胞癌组，差异有显著性意义(P < 0.05，表2)。

2.4 肝细胞癌组与非肝细胞癌组发生肝细胞癌危险因素的多因素非条件Logistic回归分析比较 多因素Logistic回归分析结果显示，AFP-L3%是患者发生肝细胞癌的独立危险因素(P < 0.05，表3)。

2.5 AFP-L3%在预测肝细胞癌中的价值 为评价AFP-L3%在接受人脐带间充质干细胞移植的患者中发生肝细胞癌的预测价值，将AFP-L3%检测值分为≥ 10%和< 10%，诊断实验评价见表4；以AFP-L3%≥ 10%作为肝细胞癌的诊断标准，则AFP-L3%诊断肝细胞癌在观察组灵敏度为40%，特异度为98.68%，对照组灵敏度为42.8%，特异度为98.45%。AFP-L3%诊断肝细胞癌的ROC曲线下面积分别为0.956和0.971，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计回顾性对照试验。

1.2 时间及地点 于2011年1月至2013年12月在解放军第一○五医院感染科完成。

1.3 对象 选取2011年1月至2013年12月期间，在解放军第一○五医院感染科住院接受人脐带间充质干细胞治疗的乙型肝炎肝硬化患者171例为观察组，同期住院的仅接受常规内科综合治疗的乙型肝炎肝硬化患者215例为对照组。肝硬化的诊断依据中华医学会肝病学分会和感染病学分会修订的2015版《慢性乙型肝炎防治指南》标准^[11]。

纳入标准：①年龄大于18周岁，小于75周岁，男女不限；②所有患者均给予抗病毒药物治疗，HBV-DNA检测阴性(小于500 copies/mL)；③在进行血生物化学检测前两周内未服用强力降酶药物；④所有患者后期随访36个月。

排除标准：①合并其他病毒感染所致的肝脏疾病，如：甲肝病毒(HAV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)、戊肝病毒(HEV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)等；②既往有其他肝脏疾病史(酒精性肝病、自身免疫性肝病、脂肪肝、代谢性肝病、中毒性肝病)的患者；③合并有其他严重器官病变(心肺功能不全或衰竭、肾衰竭)、风湿免疫系统疾病以及代谢性疾病如糖尿病、甲亢等患者；④合并原发性或转移性肝细胞癌及其他器官系统的肿瘤患者；⑤怀孕或哺乳。

随访过程中发生肝细胞癌的患者为肝细胞癌组，而未发生肝细胞癌的患者为非肝细胞癌组。该研究经中国人民解放军第一○五医院伦理委员会批准，并在中国临床试验中心注册。

1.4 方法

1.4.1 实验室检测 ①常规检测血常规、血生化指标、凝血功能等；②采用ELISA法检测病毒标记物(上海科华生物工程有限公司)；③血清甲胎蛋白(AFP)测定：采用化学发光微粒子免疫检测法检测甲胎蛋白水平，试剂为雅培公司提供的试剂盒；④血清甲胎蛋白异质体(AFP-L3)测定：采用北京热景生物技术股份有限公司提供的试剂盒，分离采用微量离心柱法，罗氏Cobas 601全自动生化免疫分析仪，AFP-L3(%)=(AFP-L3)×2.5/AFP×100%；⑤血清高尔基体糖蛋白73(GP73)测定：采用北京热景生物技术有限公司提供的试剂盒，以ELISA法检测血清高尔基体糖蛋白73水平；⑥MELD评分参照文献[12]：R=9.6×ln(肌酐mg/dL)+ 3.8×ln(胆红素mg/dL)+11.2×ln(INR)+6.4×(病因：酒精性为0，其他为1)，结果取整数。

1.4.2 人脐带间充质干细胞的分离和培养 脐带来源于解放军第一○五医院产科健康剖宫产的足月胎儿，均经家属同意并签署知情同意书。胰蛋白酶、胶原酶、胶原蛋白以及DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；表皮生长因子、地塞米松、血小板衍生生长因子、青霉素、链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)、人血清白蛋白购自 Peprotech公司。CO₂培养箱购自美国THMRO公司。脐带间充质干细胞的分离采用贴壁法，在解放军第第一○五医院细胞中心实验室制备。取脐带组织，放入备好的含青霉素和链霉素的无菌磷酸盐缓冲液中冲洗2次，将脐带剪成1 mm²左右的碎块，放入含体积分数为10%胎牛血清、体积分数为5%马血清、青霉素和链霉素的低糖细胞培养基(DMEM)中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂温箱中培养，每隔3 d换液1次将未贴壁细胞洗去，10 d后培养基中有成纤维样细胞集落形成，用胰蛋白酶消化，按1︰3比例传代，最后得到高纯度的脐带间充质干细胞(图1)。

取培养至第3代的人脐带间充质干细胞，制成细胞浓度为1×10⁹ L^-1的细胞悬液，然后加入荧光标记的鼠抗人PE-CD29、FITC-CD34、PE-CD44和FITC-CD45抗体，用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达(图2)。同时取培养基上清液行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体和HIV病毒等标记物检测，并进行细菌、真菌培养、支原体和内毒素检测。间充质干细胞纯度达99%，且各项检测合格后，继续传代备用。

1.4.3 治疗方法 观察组患者在内科综合治疗基础上，经股动脉插管行肝动脉移植，移植人脐带间充质干细胞数量>1×10⁸，移植1次，对照组仅接受内科综合治疗。

1.5 主要观察指标 所有患者在第1年每3个月、1年后每半年进行一次随访，观察并发症及肝细胞癌的发生情况。同时测定治疗过程中患者AFP、AFP-L3、GP73、血常规、凝血功能、肝脏生化、HBV-DNA等指标并计算AFP-L3%，完善腹部超声，对于疑似病例进行肝脏影像学甚至肝穿检查。

肝细胞癌的诊断：肝细胞癌的诊断依据文献[13-14]。进行回顾性分析时如出现两者不符，以文献[14]为准。

研究终点：终点为肝细胞癌的发生。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0统计学软件，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，计数资料采用χ²检验，等级资料采用Wilcoxon秩和检验，先进行单因素分析以确定有显著意义的因素，再进行多因素非条件Logistic回归分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

目前肝脏移植是治疗各种终末期肝病最有效的方法，但因为供者来源缺乏，治疗费用高昂，手术方式复杂等因素，而限制了其在临床的广泛应用。间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化能力的细胞。人脐带间充质干细胞因其低免疫原性而成为近年来研究的热点。尽管目前对于人脐带间充质干细胞治疗肝硬化以及肝功能衰竭的具体机制尚不明确，但一些实验研究证明人脐带间充质干细胞对终末期肝病的治疗、改善患者肝脏功能方面表现出了一定的疗效^[15-16]。研究表明，间充质干细胞在肿瘤的发生过程中扮演着双重角色，Qiao等^[17]发现间充质干细胞能抑制恶性表型的H7402和HepG2人肝癌细胞系。而Yan等^[18]发现与肝癌相关的间充质干细胞可以促进肝癌细胞的生长及转移。张杭杰等^[19]发现间充质干细胞在肝癌发生的不同阶段对肿瘤的作用不同，在肝癌形成前具有抑制肿瘤发生的作用，而在肝癌形成后则有促进肿瘤发展的作用。因此，人脐带间充质干细胞在体内环境的影响下自身是否会向肿瘤组织分化以及其与肝癌细胞发生发展的关系，是其在大规模临床应用前必须首先考虑的问题。寻找一种有效的方法来预测应用人脐带间充质干细胞治疗后患者发生肝细胞癌的可能性，选择出适合该项治疗的患者，既可改善这部分患者的肝脏功能，并且可以降低因使用人脐带间充质干细胞治疗而带来发生肝细胞癌的风险。

血清AFP水平长期以来被作为肝癌早期诊断的血清学指标，它与肝细胞癌的发生高度相关，一些临床病例证明血清AFP的升高可早于肝癌影像学约38个月^[20]。近年来的研究发现甲胎蛋白异质体与原发性肝癌的发生密切相关，可作为新一代的肿瘤标志物，是重要的肝癌诊断因子^[21]。AFP-L3%的测定有助于鉴别肝脏良、恶性疾病。良性慢性肝病患者AFP-L3%很低，而肝细胞癌患者AFP-L3%很高。另一方面，AFP-L3%升高的患者，其肝细胞癌的发生率也明显高于AFP升高的患者^[22]。GP73是高尔基Ⅱ型跨膜蛋白，Block等^[23]首次发现GP73在肝癌中升高尤为明显，提示其可能成为肝癌的一个新的血清标志物，并且对于诊断早期肝癌GP73可能优于AFP。MELD评分系统是应用血清胆红素、国际标准化比值和血清肌酐指标来评价终末期肝病的系统。在评价肝病严重程度、肝脏储备功能、判断预后方面有重要的临床价值^[24]。因此，该研究将年龄、血常规、凝血功能、肝脏生物化学等指标以及AFP、AFP-L3、AFP-L3%、GP73、MELD评分系统等纳入肝细胞癌发生的危险因素。

经过单因素Logistic回归分析后结果显示，年龄、AFP、AFP-L3、AFP-L3%和GP73水平可作为预测肝细胞癌发生的危险因素，但多因素非条件Logistic回归分析发现，仅AFP-L3%是人脐带间充质干细胞移植后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的独立危险因素。AFP作为诊断肝细胞癌的传统血清学标志物，是目前肝癌筛查或辅助诊断最常用的标志物，但是近些年的一些研究发现，AFP检测对原发性肝癌诊断的灵敏度和特异度均不高，有30%-40%的原发性肝癌患者AFP为阴性^[25]。本研究所选取的病例基本上均为低浓度AFP患者，可能是多因素分析AFP不是发生肝细胞癌危险因素的原因。但AFP升高提示其后期可能存在发生肝细胞癌的风险。AFP并非单一成分，其存在多种异质体，其中与小扁豆凝集素亲和力较强，能够与之结合的称为AFP-L3。它主要来自于肝癌细胞，因此其水平随着肝癌的生长呈线性升高^[26-27]。近年来研究发现，检测甲胎蛋白异质体的水平，可以在高危人群中发现直径2 cm以下的肝细胞癌，且不受血清AFP水平的影响，对AFP低浓度的肝癌特别是小肝癌的早期诊断意义较大，可以比影像学提前9-12个月发现肝癌的存在^[28]。更有一项跟踪研究显示，AFP-L3比影像学可以提前3年半预警肝细胞癌的发生^[29]。在本研究中，观察组内肝细胞癌组发现有8例、对照组内肝细胞癌组有9例其AFP-L3%水平均明显高于非肝细胞癌组；以AFP-L3%≥10%作为肝细胞癌的诊断标准，则AFP-L3%诊断肝细胞癌在观察组灵敏度为40%，特异度为98.68%，对照组灵敏度为42.8%，特异度为98.45%。AFP-L3%诊断肝细胞癌的ROC曲线下面积分别为0.956和0.971。与Toyoda等^[30]同样取AFP-L3%的检测临界值为10%诊断肝细胞癌，其准确度可达94%的结果是一致的。表明AFP-L3%在低浓度AFP的患者中，是一个有效的肝癌预警指标。有文献报道在慢性乙肝患者中，发生肝细胞癌的比例约为4%，而在已经进展为肝硬化的患者中，3-5年的比例可达到6.6%-13.8%^[31-32]。本研究发现，观察组在36个月的随访时间内肝细胞癌的发生率为11.7%，而对照组为9.8%，与其基本相仿，表明人脐带间充质干细胞治疗不会增加乙型肝炎肝硬化患者3年的肝细胞癌总发病率，但在随访的前12个月内，肝细胞癌的发病率明显高于对照组，提示对于影像学尚无证据的有潜在发生肝细胞癌的患者，人脐带间充质干细胞治疗可能会促进癌细胞的生长。研究发现间充质干细胞可以从骨髓等组织器官迁移至肿瘤微环境中，通过高表达多种生长因子，直接促进肿瘤细胞增殖^[33]。

综上所述，初始治疗时AFP-L3%是人脐带间充质干细胞治疗后乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的独立危险因素。AFP-L3%在早期预测乙型肝炎肝硬化患者后期发生肝细胞癌的可能性方面具有良好的作用，可以指导乙型肝炎肝硬化患者的临床治疗，对于这样一部分高危患者不予以人脐带间充质干细胞治疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析

Risk factors for hepatocellular carcinoma in hepatitis B cirrhosis patients given treatment with human umbilical cord mesenchymal stem cell

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