低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌对心肌的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0752

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1344-1349.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0752

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低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌对心肌的保护作用

高宇平¹，林媛媛¹，李学文¹，范春辉²，杨帆³，郝大洁⁴，葛文佳⁵

山西大医院，¹心血管内科，²设备科，⁴介入治疗中心，⁵科教处，山西省太原市 030032；³太原市中心医院急诊科，山西省太原市 030009

修回日期:2017-10-20 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 高宇平，博士，主任医师，山西大医院心血管内科，山西省太原市 030032
作者简介:高宇平，1970年生，山西省临县人，汉族，2014年山西医科大学毕业，博士，主任医师，主要从事冠心病介入治疗、心血管疾病干细胞治疗研究。
基金资助:
山西省重点研发计划(国际合作)项目(2014081050-2)

Cardioprotection by hypoxia-induced rat adipose-derived stem cells through paracrine mechanisms

Gao Yu-ping¹, Lin Yuan-yuan¹, Li Xue-wen¹, Fan Chun-hui², Yang Fan³, Hao Da-jie⁴, Ge Wen-jia⁵

¹Department of Cardiovascular Medicine, ²Department of Equipments,⁴Interventional Therapy Center, ⁵Office of Academic Affairs, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China; ³Department of Emergency, Taiyuan Central Hospital, Taiyuan 030009, Shanxi Province, China

Revised:2017-10-20 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Gao Yu-ping, Department of Cardiovascular Medicine, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
About author:Gao Yu-ping, M.D., Chief physician, Department of Cardiovascular Medicine, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
Supported by:
the Shanxi Provincial Key Research & Development Project (International Cooperation), No. 2014081050-2

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
低氧培养：当细胞或器官中的氧气低于空气中的氧气水平时的培养状态。人体内部不同部位的细胞所需的氧气水平是不一样的，不论哪一器官或组织所需要的氧气含量均低于空气中的氧气含量。
干细胞的旁分泌作用：干细胞可以分泌多种细胞因子和生长因子，促进周围细胞的存活，发挥旁分泌作用。这种旁分泌功能影响移植干细胞自身及所在组织器官结构和功能修复，是干细胞改善靶器官功能、抗凋亡、抗炎等疗效的重要机制之一。

摘要
背景：研究表明，脂肪组织来源干细胞能够有效改善心肌梗死后心功能，是一个非常有前景的心肌细胞再生来源。目前大部分研究是在正常氧体积分数下探讨脂肪干细胞介导的心肌保护作用。
目的：观察低氧环境培养条件下脂肪干细胞的旁分泌及抗凋亡等保护作用。
方法：分离、培养大鼠脂肪细胞以及乳鼠心肌细胞，在正常氧体积分数下和低氧体积分数下(10%)共培养大鼠脂肪干细胞及过氧化氢损伤的乳鼠心肌细胞，通过酶联免疫吸附法检测细胞沉淀中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)以及培养基上清中血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平，Western blot 检测细胞沉淀中凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。
结果与结论：①过氧化氢损伤乳鼠心肌细胞后，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平下降；②在低氧状态下，损伤的心肌细胞与脂肪干细胞共培养能够使还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值升高，促进脂肪干细胞旁分泌细胞因子，而且使凋亡蛋白Bax表达下降，Bcl-2表达上升；③结果表明，低氧状态促进脂肪干细胞旁分泌作用增强，从而起到抗凋亡、保护心肌的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1768-6574(高宇平)

关键词: 旁分泌, 心肌细胞, 干细胞, 脂肪干细胞, 共培养, 低氧状态, 心肌梗死, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) represent one of the promising cell sources for myocardial regeneration due to their easy accessibility and efficacy in the improvement of cardiac function following myocardial infarction. However, previously reported studies on the underlying mechanism of ADSCs-mediated cardioprotective effect mainly focused on the ADSCs cultured at room air.
OBJECTIVE: To test the paracrine actions and anti-apoptotic effect of ADSCs under hypoxic conditions.
METHODS: After isolation and culture, neonatal rat myocardial cells were injured by hydrogen peroxide and co-cultured with rat ADSCs under normoxia and hypoxia (10% O2) conditions. Ratio of reduced glutathione to oxidized glutathione (GSH/GSSG) in the cell pellet and levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), and basic fibroblast growth factor (bFGF) were tested by ELISA. Expression of apoptotic proteins Bax and Bcl-2 were determined by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: GSH/GSSG, VEGF, IGF-1, and bFGF were decreased in neonatal rat myocardial cells injured by hydrogen peroxide. ADSCs significantly attenuated hydrogen peroxide-induced myocardial apoptosis by increasing the ratio of GSH/GSSG and the secretion of VEGF, IGF-1 and bFGF. ADSCs also down-regulated Bax expression and up-regulated Bcl-2 expression. To conclude, hypoxic conditions can enhance the anti-apoptosis and cardioprotective effects of ADSCs through the paracrine mechanism.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Myocytes, Cardiac, Coculture Techniques, Cell Hypoxia, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

高宇平，林媛媛，李学文，范春辉，杨帆，郝大洁，葛文佳. 低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌对心肌的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1344-1349.

Gao Yu-ping, Lin Yuan-yuan, Li Xue-wen, Fan Chun-hui, Yang Fan, Hao Da-jie, Ge Wen-jia. Cardioprotection by hypoxia-induced rat adipose-derived stem cells through paracrine mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1344-1349.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪干细胞及心肌细胞的形态 图1是不同分组处理下脂肪干细胞及心肌细胞的形态，传代后的脂肪干细胞形态比较均一，呈长梭形，漩涡样生长，大鼠乳鼠心肌细胞伪足相互接触交织成密集的网，形成放射状排列的细胞簇，经过100 μmol/L过氧化氢处理后心肌细胞死亡明显，而在低氧状态下与脂肪干细胞共培养后，心肌细胞死亡较前有所减少。

2.2 细胞沉淀中还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽水平 由图2A可见过氧化氢损伤心肌细胞后，心肌细胞中还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值明显下降(P < 0.05)，正常氧体积分数时，脂肪干细胞与心肌细胞共培养不能产生抗氧化作用(P > 0.05)；而在低氧状态下，损伤心肌细胞与脂肪干细胞共培养可以使还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值增加(P < 0.05，图2B)。

2.3 培养基上清中细胞因子水平

2.3.1 培养基上清中血管内皮生长因子水平 图3A中乳鼠心肌细胞与脂肪干细胞共培养后血管内皮生长因子水平明显上升，同时，损伤的乳鼠心肌细胞与脂肪干细胞共培养后培养基上清中血管内皮生长因子水平也明显上升(P < 0.001)，说明脂肪干细胞对损伤的心肌细胞有一定的保护作用。由图3B可以看出，低氧状态下共培养细胞的培养基上清中血管内皮生长因子水平明显高于损伤心肌细胞(P < 0.001)。

2.3.2 培养基上清中胰岛素样生长因子水平 图4A可见，过氧化氢处理心肌细胞后胰岛素样生长因子水平降低，损伤心肌细胞与脂肪干细胞共培养后，胰岛素样生长因子水平上升，但统计结果显示差异无显著性意义。图4B可见，在低氧状态下，与损伤的乳鼠心肌细胞组相比，共培养组培养基上清中胰岛素样生长因子水平明显上升(P < 0.01)，说明脂肪干细胞在低氧状态下可以促进胰岛素样生长因子的分泌。

2.3.3 培养基上清中碱性成纤维细胞生长因子水平 图5A可见正常乳鼠心肌细胞与脂肪干细胞共培养后碱性成纤维细胞生长因子水平明显上升，在过氧化氢处理心肌细胞后，几乎没有碱性成纤维细胞生长因子的表达。当损伤心肌细胞与脂肪干细胞共培养后，碱性成纤维细胞生长因子水平明显上升(P < 0.05)，提示脂肪干细胞促进碱性成纤维细胞生长因子的分泌。图5B可见低氧状态下共培养组培养基中碱性成纤维细胞生长因子水平明显增加(P < 0.001)。

2.4 细胞沉淀中Bax和Bcl-2蛋白表达 图6为不同氧体积分数下脂肪干细胞与损伤的乳鼠心肌细胞共培养时Bax和Bcl-2蛋白的表达。正常氧体积分数下，过氧化氢损伤的心肌细胞与脂肪干细胞共培养后，Bax蛋白表达下降(P < 0.05)，Bcl-2蛋白表达上升(P < 0.001)。与正常氧体积分数下培养相比，在低氧状态下，损伤心肌细胞与脂肪干细胞共培养之后，Bax的表达有所下降，Bcl-2的表达明显上升，可以看到在共培养体系中，脂肪干细胞对心肌细胞的凋亡有保护作用，而低氧状态能够增强脂肪干细胞抗凋亡作用。

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引言

急性心肌梗死是心脏性猝死的重要原因，目前的药物或介入等临床治疗手段在一定程度上可以挽救濒死的心肌细胞，但不能使坏死的心肌得到有效的修复，从而形成瘢痕组织、室壁瘤等，使心肌重塑最终导致心力衰竭^[1]。近年来的研究证明干细胞治疗可以显著改善心室重构和提高心功能，包括骨髓间充质干细胞、脂肪源性干细胞、胚胎干细胞等^[2-5]。虽然一些研究提示骨髓间充质干细胞可以在体外诱导环境下和体内移植后能够分化为心肌细胞和血管细胞，实现一定程度上的心肌再生^[6-7]。然而骨髓间充质干细胞在体内的低存活率和低分化率以及取材不方便等问题阻碍了其治疗缺血性心脏病的进展^[8]。国际脂肪疗法及科学联邦委员会指出脂肪来源干细胞是理想的生物细胞之一^[9]。脂肪来源干细胞是来源于脂肪组织的具有自我复制和多向分化潜能的细胞。由于脂肪来源干细胞具有易获取、易分离培养、来源广泛、较强增殖能力和多向分化潜能等优点，其在组织修复方面的应用前景受到广泛关注，被认为是治疗心脏病的理想干细胞来源^[10-13]。多项研究数据表明脂肪干细胞的旁分泌作用尤为重要^[14-15]，可以分泌多种促血管生成、抗凋亡和免疫调节细胞因子与生长因子，即脂肪干细胞移植治疗心肌梗死可能更依赖于旁分泌作用^[16]。国内研究表明，低氧状态下可促进人脂肪干细胞分泌更多的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子等^[17]。而且低氧环境对干细胞的生物学特性有调控作用^[14^，^18-19]。

实验通过过氧化氢损伤培养的乳鼠心肌细胞，在低氧体积分数下(10%)与脂肪干细胞共培养，通过观察细胞形态学以及细胞因子、凋亡蛋白等指标变化，探讨脂肪间充质干细胞旁分泌介导的心肌保护作用，为干细胞治疗急性心肌梗死提供一定的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年8月在山西医科大学转化医学研究中心完成。

1.3 材料

实验动物：健康雄性Wistar大鼠5只，清洁级，体质量100-120 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供。出生1-3 d的SD乳鼠，雌雄不限，由上海杰思捷实验动物有限公司提供。

实验用主要试剂：F12K培养基、胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶及双抗、HBSS、Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)；DAPI(上海威奥生物科技有限公司)；过氧化氢、防猝灭封固剂(Sigma公司)；BSA(Amresco公司)。Bax(N-20)抗体、Bcl-2抗体(Santa cruz公司)；FITC-山羊抗兔(北京中杉金桥生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司)。

混合气体：购于上海佳杰特种气体有限公司。低氧：体积分数为5%CO₂+体积分数为10%O₂+体积分数为85%N₂；正常氧：空气。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞及过氧化氢损伤的乳鼠心肌细胞共培养 参照文献[20]中脂肪干细胞分离培养方法，采用戊巴比妥麻醉大鼠，取双侧腹股沟处皮下脂肪，用Ⅱ型胶原酶消化，在传代过程中采用差速贴壁法纯化脂肪干细胞，取培养至第3代的脂肪干细胞，离心、孵育、洗涤、再离心，将细胞重悬于含体积分数为3%胎牛血清的PBS中。

参照文献[21]进行乳鼠心肌细胞分离培养以及过氧化氢损伤处理。采用胰酶、Ⅱ型胶原酶消化乳鼠心肌，培养五六天后，乳鼠心肌细胞以6×10⁸ L^-1细胞浓度接种于6孔板，培养基为含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养24 h后，换成无血清的DMEM培养基，加入100 µmol/L过氧化氢处理4 h，换为正常培养基，继续培养24 h。

参照文献[21]进行乳鼠心肌细胞与脂肪干细胞共培养，将3瓶75 cm²乳鼠心肌细胞分至6个10 cm培养皿中，培养基为含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM；1个10 cm培养皿大鼠脂肪干细胞分至3个10 cm培养皿中，培养基为含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的MEM。培养48 h后，用100 µmol/L过氧化氢处理4个培养皿心肌细胞3 h。取5个6孔板，将损伤的心肌细胞分至16个孔中，未用过氧化氢处理的2个培养皿心肌细胞分至4个孔中；随后接种脂肪干细胞，共培养组的脂肪干细胞接种于小室中(所有培养基均换成心肌细胞培养基)，先在正常氧浓度下过夜培养，使细胞贴壁，再用低氧处理24 h，收集6孔板中的细胞沉淀和培养基上清。

1.4.2 实验分组 ①正常培养：乳鼠心肌细胞组，脂肪干细胞+乳鼠心肌细胞组，损伤的乳鼠心肌细胞组，脂肪干细胞+损伤的乳鼠心肌细胞组；②体积分数为10%O₂培养：损伤的乳鼠心肌细胞组，脂肪干细胞+损伤的乳鼠心肌细胞组。

1.4.3 细胞沉淀中还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽及培养基上清中细胞因子(血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)水平 按照测试盒说明书应用酶联免疫吸附法测定，得到各吸光度值。氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量按照下述公式进行计算：氧化型谷胱甘肽含量(µmol/L)=GSSG测定?值(A2-A1)/GSSG标准?值(A2-A1)×标准品浓度(50 µmol/L)×样品测试前稀释倍数(2倍)。还原型谷胱甘肽(GSH)含量按照下述公式进行计算：GSH含量(µmol/g)=(测定A值-空白A值)/(标准A值-空白A值)×标准管浓度(20 µmol/L)×样本前处理下稀释倍数(2倍)/待测匀浆蛋白浓度(g/L)。

1.4.4 Western blot测定细胞沉淀中Bax和Bcl-2蛋白表达 将需要抽提蛋白的细胞从培养箱中取出，吸去培养液，加入适量预冷的1×PBS洗涤1次，用细胞刮收集细胞于1.5 mL离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，吸去PBS，细胞沉淀用1 mL预冷的PBS洗1次，离心弃上清，细胞沉淀加入适量的含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，4 ℃充分裂解细胞，12 000 r/min离心10 min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱，取蛋白提取液上清(含蛋白30 μg)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭、洗脱后加入一抗室温孵育4 h，洗膜后以相应二抗孵育1 h，并以β-actin多克隆抗体同上操作作为上样对照。ECL化学发光法检测，暗室X射线胶片曝光，采用Image-Pro Plus软件分析照片中蛋白条带积分吸光度值(IOD=平均吸光度×面积)，以靶蛋白/ β-actin的积分吸光度比值反映靶蛋白相对水平。

1.5 主要观察指标 ①脂肪干细胞与心肌细胞共培养形态；②细胞沉淀中谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽及培养基上清中细胞因子水平；③细胞沉淀中Bax和Bcl-2蛋白表达。

1.6 统计学分析 所有数据均以x(_)±s来表示，采用SPSS 10.0软件处理，多组间比较采用单因素方差分析，两独立样本的比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近10年来，干细胞治疗被广泛应用于心脏疾病的临床研究。在各种干细胞中，脂肪组织来源干细胞仍然是一个有吸引力的干细胞资源。有几项临床试验研究提出利用脂肪干细胞治疗急性心肌梗死、缺血性心肌病，能够改善左室射血分数、减少梗死面积^[22-23]。但是目前脂肪干细胞对心肌再生的作用机制还没有完全阐明。体外研究显示脂肪干细胞具有多向分化潜能，脂肪干细胞可以分化为成熟的脂肪细胞，在一定条件下可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞^[24]，脂肪干细胞移植可以促进血管新生、改善心肌梗死后心肌重构从而改善心功能。然而，体内实验表明，只有小部分植入的脂肪干细胞在体内可能分化为心肌细胞^[25]。目前的研究认为脂肪干细胞对心肌的诱导作用机制为旁分泌效应^[26]，在脂肪干细胞治疗中旁分泌机制中起着重要的作用^[27]，脂肪干细胞可分泌促血管生成、抗细胞凋亡、免疫调节等生长因子。

低氧状态是一种重要的病理生理现象，近年来有研究提出低氧状态下能够提高脂肪干细胞旁分泌功能，早在2004年Rehman等^[28]发现脂肪干细胞具有促血管化和抗凋亡潜能，且在低氧处理后作用更强，因此移植脂肪干细胞是加强血管生成和心血管保护方面的新型治疗方法。脂肪干细胞旁分泌中最重要的是血管内皮生长因子的表达^[29]，血管内皮生长因子可作用于血管内皮细胞促进其迁移增殖，从而促进血管形成或血管发生，参与到机体众多生理或病理过程。在低氧环境中，血管内皮生长因子mRNA的增加与缺氧诱导因子蛋白含量的增加存在剂量依赖性。Rehman等^[28]发现在正常氧环境下人脂肪干细胞可分泌大量的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子β以及少量的粒细胞巨噬细胞刺激因子或碱性成纤维细胞生长因子，而在低氧环境下血管内皮生长因子蛋白分泌量比正常氧环境下显著提高(约5倍)。为了进一步阐明脂肪干细胞的旁分泌机制，实验建立了过氧化氢诱导的心肌损伤模型，观察低氧体积分数下(10%)脂肪来源干细胞的旁分泌机制及其心肌保护作用。结果表明，过氧化氢损伤心肌细胞后，心肌细胞中还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值明显下降、培养基上清中旁分泌因子血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子水平降低，而且几乎没有碱性成纤维细胞生长因子的表达，而低氧状态下，损伤的乳鼠心肌细胞与脂肪干细胞共培养后，抗氧化作用增加，旁分泌因子血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、碱性成纤维细胞生长因子水平均明显高于损伤心肌细胞。此外，对心肌细胞损伤后凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达进行了测定，结果表明过氧化氢损伤心肌细胞后凋亡增加，脂肪干细胞与损伤的心肌细胞共培养后有抗凋亡作用，而在低氧状态下能够增强脂肪干细胞的抗凋亡作用。

综上所述，过氧化氢诱导的损伤心肌细胞与脂肪干细胞共培养可能使多种细胞因子分泌增加，如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子等，从而参与心脏修复过程，包括心肌细胞凋亡减少，促进血管生成，提高移植细胞的存活率，减少炎症等。低氧状态时(10%氧体积分数)能够增加脂肪干细胞旁分泌作用，促进细胞再生，从而改善心肌重塑，加强对心肌细胞的保护作用。这些数据表明脂肪干细胞可能通过旁分泌机制改善梗死灶微环境来治疗心肌梗死，对脂肪干细胞旁分泌介导心肌再生的研究有利于发展更好的药物治疗策略，提高脂肪干细胞的治疗效果。目前有实验提出低氧培养条件可以诱导脂肪干细胞分泌功能改变，尤其是提高血管内皮生长因子表达^[30]，通过注射低氧处理后含有丰富血管内皮生长因子的脂肪干细胞培养基于受损组织，可为临床提供一种新型的细胞治疗方法。虽然临床应用脂肪干细胞是非常有吸引力的，但目前脂肪干细胞改善心脏功能的主要机制仍有待于进一步完善，寻找最适氧体积分数以及低氧持续时间等，需要应用动物模型进行实验验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低氧诱导大鼠脂肪干细胞旁分泌对心肌的保护作用

Cardioprotection by hypoxia-induced rat adipose-derived stem cells through paracrine mechanisms

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