卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0968

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (29): 4687-4691.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0968

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卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定

俞晓毓¹，吴迪^1，2，王净²，李菲¹，白绪乐^1，2，赵枫姝¹，窦骏¹

¹东南大学医学院病原生物学与免疫学系，江苏省南京市 210009；²东南大学附属中大医院妇产科，江苏省南京市 210009

出版日期:2018-10-18 发布日期:2018-10-18
通讯作者: 窦骏，教授，博士生导师，东南大学医学院病原微生物学与免疫学系，江苏省南京市210009
作者简介:俞晓毓，女，1992年生，江苏省盱眙县人，汉族，东南大学在读硕士，主要从事肿瘤干细胞研究。并列第一作者：吴迪，女，1987年生，江苏省淮安市人，汉族，东南大学在读博士，主要从事肿瘤干细胞疫苗研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81202372，81572887)

Isolation and biological identification of tumor stem cells from ovarian cancer ID8 cell lines

Yu Xiao-yu¹, Wu Di^{1, 2}, Wang Jing², Li Fei¹, Bai Xu-le^{1, 2}, Zhao Feng-shu¹, Dou Jun¹

¹Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China; ²Department of Gynecology & Obstetrics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Online:2018-10-18 Published:2018-10-18
Contact: Dou Jun, Professor, Doctoral supervisor, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China
About author:Yu Xiao-yu, Master candidate, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China. Wu Di, Doctorate candidate, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China; Department of Gynecology & Obstetrics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China. Yu Xiao-yu and Wu Di contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81202372, 81572887

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肿瘤干细胞或癌干细胞(cancer stem cell，CSC)：是指肿瘤组织中极小部分能够自我更新、无限分化并具有耐受放化疗等特点的肿瘤细胞，与干细胞的基本特性十分相似，被认为是肿瘤形成、进展、复发和耐药的根源。传统的手术辅助放化疗的治疗方法并不能有效地杀灭CSC，可导致CSC残余富集。因此，有效靶向CSC的治疗将是消灭肿瘤、防止复发的关键。
无血清培养基：是由基础培养基DMEM/F12和添加的组分组成。其中基础培养基DMEM/F12(1∶1)为含有一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等，为细胞生存提供最基本的支持；而添加的组分包括重组表皮生长因子、重组碱性成纤维生长因子、牛血清白蛋白及重组胰岛素等，这些组分对细胞增殖、保持干细胞活性和防止细胞分化以及促进细胞新陈代谢等起到至关重要的作用。

摘要
背景：肿瘤干细胞在肿瘤发生和发展中起着至关重要的作用，但鼠卵巢癌细胞系ID8中是否存在肿瘤干细胞仍未见报道。
目的：分选小鼠源性卵巢癌细胞系ID8的肿瘤干样细胞，鉴定其生物学特性。
方法：应用无血清培养基培养ID8细胞，将获得悬浮球细胞传代扩增。体外采用CCK8法、平板克隆、Transwell小室侵袭及体外药敏实验观察悬浮球细胞与常规培养的ID8细胞在生物学功能上的差异。应用定量PCR以及Western blot检测悬浮球细胞和非悬浮球细胞的肿瘤干细胞标志ALDH1的表达水平，并通过小鼠致瘤实验观察其成瘤能力。
结果与结论：小鼠卵巢癌ID8细胞能在无血清培养基中形成可稳定传代的悬浮球细胞，与非悬浮球细胞相比，具有较强的增殖、自我更新、侵袭、耐药及致瘤的能力，并高表达肿瘤干细胞标志ALDH1。说明无血清培养法可以有效的富集具有卵巢癌干样细胞特征的ID8悬浮球细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4459-1618(俞晓毓)

关键词: 卵巢肿瘤, 肿瘤干细胞, ID8细胞, 无血清培养, 悬浮球细胞, 干性, 分离, 鉴定, ALDH1

Abstract:

BACKGROUND: Tumor stem cells play an important role in the initiation and development of tumor. However there is no report on whether tumor stem cells exist in mouse ovarian cancer cell line ID8.
OBJECTIVE: To sort tumor stem-like cells from murine ID8 ovarian cancer cell line and to investigate its biological characteristics.
METHODS: ID8 cells were cultured in the serum-free medium to derive tumor spheres. Cell counting kit 8, plate colony formation, Transwell assays and chemosensitivity testing were adopted to analyze the biological differences between suspending sphere cells and conventional cultured ID8 cells. Real-time PCR and western blot assays were performed to examine the expression of ALDH1. A mouse model of tumorigenicity was used to observe the tumorigenesis in vivo.
RESULTS AND CONCLUSION: Ovarian ID8 cells grew into stable suspending tumor spheres in the serum-free medium. Compared with conventional ID8 cells, suspending sphere cells had stronger abilities of proliferation, self-renewal, invasion, drug resistance and tumorigenesis. Moreover, ALDH1 expression in suspending spheres cells was higher than that in conventional cultured ID8 cells. These findings indicate that serum-free medium culture can effectively enrich ID8 suspending sphere cells which have the properties of ovarian cancer stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neoplastic Stem Cells, Culture Media, Serum-Free, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

俞晓毓，吴迪，王净，李菲，白绪乐，赵枫姝，窦骏 . 卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4687-4691.

Yu Xiao-yu, Wu Di, Wang Jing, Li Fei, Bai Xu-le, Zhao Feng-shu, Dou Jun. Isolation and biological identification of tumor stem cells from ovarian cancer ID8 cell lines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4687-4691.

图/表（结果） 1

2.1 细胞形态 倒置显微镜下可见，ID8细胞在含血清的培养基中呈梭形单层贴壁生长(图1)，而在含有细胞因子的无血清培养基中，部分ID8细胞悬浮增生，呈球形或者椭圆形，悬浮球内的细胞结合紧密、球体饱满且球内细胞折光性好(图1)。表明ID8细胞在无血清培养条件下能够存活并增殖形成具有自我更新能力的肿瘤细胞球。

2.2 细胞增殖和克隆形成能力 CCK8检测ID8细胞和悬浮球细胞增殖结果显示，从培养第4天开始，悬浮球细胞组的吸光度值明显高于常规培养的ID8细胞组(图2A)，表明相对于ID8细胞，悬浮球细胞具有较强的增殖能力。同时，在平板克隆实验中，2组细胞经14 d培养后，计数大于50个细胞的克隆，发现悬浮球形成的克隆数为(51.3±4.2)个，而ID8细胞为(26.3±8.4)个，差异有显著性意义(P=0.009 8)(图2B), 说明悬浮球具有更强的自我更新能力。

2.3 Transwell小室侵袭能力 经24 h侵袭，在倒置显微镜下计数ID8细胞组和悬浮球细胞组穿过微孔膜的细胞数分别为(58.0±7.1)，(96.4±18.8)个。结果表明，相对于ID8细胞组，悬浮球细胞组穿过微孔膜细胞数量明显增多(P=0.002 7；图3)，显示出悬浮球细胞具有更强的侵袭能力。

2.4 耐受化疗药物的能力 体外顺铂作用48 h后，ID8细胞组的细胞凋亡率为(68.1±5.8)%，而悬浮球细胞组凋亡率为(31.7±3.2)%，悬浮球组细胞的凋亡细胞量明显少于ID8细胞组(P=0.000 7；图4)，显示出悬浮球细胞更强的耐药性。

2.5 肿瘤干性标志ALDH1表达水平 定量PCR检测结果发现，在ID8细胞和悬浮球细胞中ALDH1 mRNA的表达水平，差异有显著性意义(P=0.000 4；图5A)。同时，Western blot 检测ALDH1在悬浮球细胞中表达的半定量结果为0.58±0.05，而ID8细胞中ALDH1的表达量仅为0.14±0.04，差异有显著性意义(P=0.003；图5B)。

2.6 小鼠体内致瘤能力 小鼠体内成瘤实验显示，与ID8细胞组相比，ID8悬浮球细胞组瘤组织增长速度较快，瘤体积较大(图6A，B)；同时，ID8悬浮球细胞组小鼠的成瘤潜伏期要明显短于ID8细胞组，ID8悬浮球细胞组种瘤后第12-14天在小鼠腹股沟皮下陆续长出肿瘤，而ID8细胞组直到第18天开始才陆续长出瘤体(图6C)。表明悬浮球细胞具有更强的致瘤能力。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞生物学特性和动物实验。

1.2 时间及地点 于2016年4月至2017年7月在东南大学完成。

1.3 材料

细胞株及动物：ID8细胞由美国堪萨斯大学医学中心ROBY教授惠赠，由作者所在实验室保存及常规培养。清洁级雌性C57 BL/6小鼠，鼠龄8周，体质量约16 g，购自扬州大学动物实验中心。

实验主要试剂及器材：DMEM培养基、胎牛血清、DMEM/F12培养基购自Gibco公司；重组表皮生长因子、重组碱性成纤维生长因子购自Multi Sciences公司；B27、重组胰岛素分别购自Invitrogen公司和Sigma公司；低黏附性六孔板购自Corning公司。Transwell小室、Matrigel基质胶购自BD公司；BSA、CCK8试剂盒购自Progma公司。Prime Script^TM RTMaster Mix 试剂盒购自TaKaRa公司；SYBR qPCR Master Mix试剂盒购自Vazyme公司。顺铂购自齐鲁制药，药品批准文号为H20023461。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Miltenyi公司。CO₂培养箱购自Thermo公司；倒置显微镜购自Olympus公司；酶标仪购自Thermo公司；流式细胞仪购自BD公司；定量PCR仪购自Applied Biosystems公司。SPSS 18.0统计软件购自IBM公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 含血清培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基。无血清培养培养基由DMEM/F12 (1∶1)、B27(1∶50)、重组表皮生长因子(20 μg/L)、重组碱性成纤维生长因子(10 μg/L)、BSA(0.4%)和胰岛素(20 mg/L)组成。将卵巢癌ID8细胞接种于含血清的培养基中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内传代培养。取对数生长的ID8细胞，按2×10⁵/孔的细胞浓度，铺至超低黏附6孔板中，每孔添加无血清培养基2 mL，每3 d半量换液，每7 d传代一次。实验选用第4代的悬浮球细胞^[6]。

1.4.2 CCK-8增殖实验 将常规培养的ID8细胞和悬浮球细胞使用胰酶消化后制成单细胞悬液，以3×10³/孔的细胞浓度接种到96孔板，每孔终体积为100 μL，置于CO₂培养箱中37 ℃培养。每天每组选出3孔，每孔加入10 μL的CCK8溶液，继续于CO₂培养箱中37 ℃培养4 h，以空白对照孔调零，酶标仪上450 nm测定各孔吸光度值，连续测量7 d，比较两者的体外增殖能力。实验重复3次。

1.4.3 平板克隆实验 将2组细胞按3×10²/孔接种于6孔板中，设置3个复孔，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。每隔3 d添加少许含血清的培养基，于培养第14天，弃培养基，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，再用0.1%的结晶紫染色15 min，使用去离子水洗去多余的结晶紫，分别计算2组细胞形成的克隆数。实验重复3次。

1.4.4 Tranwell小室侵袭实验 按1∶3的比例将Matrigel胶与无血清的DMEM混合，包被Transwell小室底部，37 ℃风干30 min。之后使用不含血清的DMEM培养基将两组细胞制备成浓度为2×10⁸ L^-1的细胞悬液，按250 L/孔接种于小室上方，在小室的下方加入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基600 μL，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h。取小室使用4%的多聚甲醛固定，再使用0.1%的结晶紫染色15 min，显微镜下随机挑取5个视野，计算穿模细胞数。实验重复3次。

1.4.5 化疗药物敏感实验 将2组细胞制备成细胞悬液，按5×10⁵/孔的细胞浓度接种于6孔板中，6-8 h后待细胞贴壁时，每孔加入25 mg/L的顺铂，于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养48 h后，收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行操作，并在30 min内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次^[7]。

1.4.6 定量PCR检测CSC标志乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)的mRNA表达情况 2组细胞分别收集1×10⁶个，采用Trizol法提取总RNA，并根据Vazyme反转录及qPCR试剂盒说明书进行操作，结果使用2^-ΔΔCT法进行分析，实验重复3次^[7]。ALDH1上游引物5'-CTG AGC TCA AGA CAG TCG CA-3'；下游引物5'-TCT GTT GGA TTA AGC CAC ATG TTT-3'；β-actin上游引物5'-GCC CTG AGG CTC TTT TCC A-3'；下游引物5'-TTA CGG ATG TCA ACG TCA-3'。引物由南京斯普金生物有限公司合成。

1.4.7 Western blot分析 2组细胞分别收集1×10⁶个，采用蛋白裂解法提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，之后使用SDS-PAGE电泳，湿转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入ALDH1一抗(兔抗鼠)，4 ℃过夜。再使用荧光标记的二抗(驴抗兔)室温下反应1 h，TBST洗脱后，进行曝光。

1.4.8 小鼠致瘤实验 将8周龄的C57BL/6小鼠随机分成2组，每组6只，右侧腹股沟皮下分别接种5×10⁵个ID8细胞或悬浮球细胞。每天观察小鼠的生存及肿瘤形成情况，每3 d测量一次小鼠肿瘤的大小(肿瘤体积=长径×短径²/2)，12周时，处死种瘤的小鼠，并剥取肿瘤、测量瘤体积，且绘制小鼠成瘤潜伏期及肿瘤生长曲线。

1.5 主要观察指标 ID8细胞形态、增殖、自我更新、侵袭及耐受化疗药物的能力以及细胞中ALDH1的表达情况和在小鼠内的成瘤能力。

1.6 统计学分析 实验采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量数据均以x(_)±s表示，两组差异采用独立样本t 检验分析。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

目前，大量研究已经证实CSC存在于很多的实体瘤中，包括黑素瘤、肺癌、神经系统肿瘤、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌及卵巢癌等^[8-14]，因CSC具有较强的耐药性、促使恶性进展、转移和癌症复发^[15-17]，使CSC在靶向治疗恶性肿瘤研究中有着重要意义，而如何有效地分离肿CSC是研究CSC靶向治疗的基础^[18]。

CSC分选方法主要包括侧群细胞法、磁珠分选法以及无血清培养法^[19]。然而侧群细胞法在Hoechst 33342染色分离过程中，可因染料的毒性而干扰细胞的活性，且SP细胞并不完全等同于CSC，目前发现有些细胞中并不存在SP细胞，所以此方法有一定的局限性^[20]。有些肿瘤细胞包括ID8在内，CSC表面标志亦尚不明确^[21]，而依据特异性标志物分选而获得的CSC数量极少，且成本大，不利于长期实验。无血清培养法最早广泛应用于神经干细胞的分离，目前已在众多实体肿瘤中得以证实^[22-24]。无血清培养法是利用CSC能够在添加特定成分的无血清培养基中存活并且增殖形成致密的悬浮球，而普通的肿瘤细胞则逐渐凋亡^[25]。对于尚未确定特异性标志物的肿瘤，无血清低粘附培养法分离CSC是很实用的选择。

作者通过无血清培养法富集从ID8细胞中成功富集了可稳定传代的ID8悬浮球细胞，并且发现随着悬浮球培养的代数增加，增生而成的悬浮球数量变多而且体积增大。通过CCK8增殖、平板克隆、Transwell小室侵袭实验等，证实了无血清培养法富集的悬浮球细胞比常规培养的ID8细胞具有更强的增殖与自我更新以及侵袭能力。进而，应用化疗药物顺铂分析ID8细胞和悬浮球细胞的化疗敏感性,结果显示悬浮球细胞相对于ID8细胞具有更强的耐药能力。有研究证实，多种肿瘤的CSC高表达ALDH1，其是重复性较高的CSC标志^[26-28]。为更进一步探讨ID8悬浮球细胞的干性基因及其表达，实验通过定量PCR和Western blot检测了ALDH1在悬浮球细胞中的表达情况。结果显示，与ID8细胞相比，悬浮球细胞显著性高表达ALDH1，提示高表达ALDH1的悬浮球细胞可能具有CSC特性，这在小鼠体内成瘤实验中进一步得到了证实。小鼠成瘤实验是鉴定CSC的金标准^[29-30]，结果显示悬浮球细胞具有更强的成瘤能力，表明无血清培养法富集可以成功有效的分离富集小鼠ID8卵巢癌CSC。实验通过无血清培养法成功富集了鼠卵巢癌CSC，为今后靶向抑制卵巢癌CSC的治疗奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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Isolation and biological identification of tumor stem cells from ovarian cancer ID8 cell lines

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