1.1 设计 分组对照细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年10月至2016年2月在华北理工大学中医学院实验室完成。
1.3 材料 小鼠胰岛β细胞瘤株(MIN6)购于上海复旦大学细胞库。DMEM培养基(Gibco公司,批号:8115031);无酚红DMEM培养基(Gibco公司,批号:1042204);胎牛血清(GEMINI公司,批号:A97D00E);Penicillin-Streptomycin Solution(HyClone公司,批号:J140056);β-硫基乙醇(MP,批号:R26495);FFA(上海迈坤化工有限公司,批号:20140620);胰酶细胞消化液(biosharp,批号:65047019);双硫腙(DTZ) (EKEAR,批号:EKKS1408);Cell Counting Kit-8试剂(DOJINDO,批号:FJ692);Hank,s液(corning cellgro公司,批号:R21022132);二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司,批号:国药准字H20023370);十子代平方各味中药材(同仁堂药店);Annexin V-FITC&PI细胞凋亡试剂盒(默克密理博MUSE,批号:15-0180);胰岛素分泌试剂盒(Mercodia,批号:23163);AbExcel goat anti-rabbit(HRP,批号:GR101082-1);Anti-MEK1 + MEK2抗体(ABCAM,ab178876),Anti-ERK1+ERK2 antibody(ABCAM,ab184699);倒置显微镜(OLYMPUSix51);M200PRO酶标仪(TECANM200);生物安全柜(Thermo Scientific);CO2培养箱(Thermo Scientific 311);BS224S精密电子天平(SARTORIUS);蛋白分析系统(Bio-Rad V3);流式细胞仪(Merck Millipore MUSE)。
1.4 实验方法
1.4.1 十子代平方溶液制备 十子代平方按照莱菔子、菟丝子、车前子、茺蔚子、枸杞子、决明子、栀子、女贞子、苏子、五味子3∶3∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2比例配方,将上述药物粉碎混合,8倍量加水,煎煮2 h,取药渣,8倍量加水,煎煮1 h。合并药液,离心1 500 r/min 10 min,抽取药物上清液,0.22 μm滤膜进行药物过滤备用。
1.4.2 小鼠胰岛β细胞培养[4] 将细胞置于含有体积分数10%胎牛血清、1%青链霉素、0.4 μL/L β-硫基乙醇的DMEM培养液中,放入37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中进行培养,待细胞长至80%汇聚度时进行消化、传代。MIN6鉴定采用双硫腙染色,染色呈特异性猩红色[5]。
1.4.3 实验分组 细胞实验分为正常组、模型组、二甲双胍组[6](100 mg/L)、十子代平方-高组(200 mg/L)、十子代平方-中组(100 mg/L)、十子代平方-低组(50 mg/L)。其中正常组基础培养,其他组以葡萄糖21 mmol/L+棕榈酸 0.37 mmol/L(高糖高脂)干预细胞12 h造模。
1.4.4 CCK-8检测细胞活性 将生长至80%汇聚度的细胞用0.25%胰酶消化液消化,吹打成均匀的单细胞悬液后以5×103/孔密度植于96孔板中,培养24 h。吸去孔板中培养液,正常对照孔加入100 μL无酚红培养液,其他孔加入100 μL高糖高脂造模剂,设平行孔6孔,12 h后分别给予二甲双胍、十子代平方-高、十子代平方-中、十子代平方-低进行干预。干预24 h后采用倒置显微镜对各组细胞进行40X相差照相细胞计数分析。干预24,48 h时,每孔加入10 μL CCK-8溶液,混匀后继续于培养箱中孵育2 h,然后在450 nm波长测定各孔A值。
1.4.5 ELISA法检测胰岛素分泌刺激实验[7] 同上述方法建立MIN6细胞损伤模型,造模成功后分别给予二甲双胍、十子代平方-高、十子代平方-中、十子代平方-低进行药物干预,并设立正常组和模型组,设平行孔6孔,干预24 h以后以低糖2.8 mmol/L刺激2 h后抽取细胞上清液待检;抽取上清液后的各孔细胞再给予高糖(16.7 mmol/L)刺激2 h后收集细胞上清液,分别进行基础胰岛素分泌和高糖刺激胰岛素分泌检测:分别吸取各组上清液25 μL到相应包被微孔板中,向各孔加入1X酶结合物100 μL,然后将上述包被微孔板置于平板振荡器(800 r/min)于室温温育2 h;将包被微孔板倒置弃去反应液,每孔加入350 μL 1X洗涤缓冲液,弃掉洗涤缓冲液,在吸水纸上轻拍数次去除残留的洗涤缓冲液,重复5次;各孔加入200 μL TMB底物;室温温育15 min;每孔加入50 μL终止液,将包被微孔板置于平板振荡器5 s确保混匀;450 nm下检测A值。
1.4.6 Annexin V-FITC&PI双染法检测细胞凋亡 同上述方法建立MIN6细胞损伤模型,造模12 h后分别给予二甲双胍、十子代平方-高、十子代平方-中、十子代平方-低进行干预,并设立正常组和模型组,24 h后分别进行细胞凋亡检测:hank’s缓冲液清洗细胞3次,0.25%胰酶消化液消化,吹打成均匀的单细胞悬液,取100 μL Muse Annexin V Dead Cell Kit溶液置于1.5 mL无盖EP管中,每管加入 100 μL细胞悬液充分混匀,室温静置20 min后流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.4.7 Western Blotting检测细胞MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2信号表达 将生长至80%汇聚度的细胞用0.25%胰酶消化液消化,吹打成均匀的单细胞悬液后以1.2×106/孔密度植于6孔板中,每孔加入2.5 mL培养液培养24 h。造模成功后分别给予二甲双胍、十子代平方-低、十子代平方-高干预24 h,并设立正常组和模型组。将IP细胞裂解液和PMSF以99∶1的比例配制细胞裂解液,冰上裂解细胞提取蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度,将各组蛋白浓度调至一致。每组取40 μg蛋白量,与蛋白上样缓冲液按比例混合后,100 ℃金属浴5 min。10%聚丙烯酰胺凝胶100 V电泳,300 mA湿转0.5 h,将电转后的PMSF膜用封闭液封闭2 h后,Western洗涤液清洗 10 min×3次,然后将PMSF膜置于一抗[Anti-MEK1+ MEK2antibody、Anti-ERK1+ ERK2 antibody和Anti-Erk1 (pT202/pY204)+Erk2(pT185/ pY187) antibody]中,放入4 ℃冰箱孵育过夜,Western洗涤液清洗10 min×3次,二抗室温孵育1h,Western洗涤液清洗10 min×3次后,ECL化学发光试剂盒显色,Bio-Rad XRS+采集灰度信号,采用Stain free免染技术全蛋白内参。
1.5 主要观察指标 ①MIN6细胞活性及细胞状态;②MIN6细胞凋亡情况;③MIN6细胞基础胰岛素分泌和高糖刺激胰岛素分泌结果;④MIN6细胞MEK1/2 、ERK1/2和p-ERK1/2因子的表达。
1.6 统计学分析 采用国际通用统计软件SPSS 20.0 对实验所有数据进行统计分析,计量资料以x±s统计学处理,多组间的比较,采用单因素方差分析,实验重复6次,以 P < 0.05为有统计学意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程