两种方法建立兔腰椎间盘退变模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
髓核抽吸法建立椎间盘退变模型：用16 G注射针头在椎间隙平行终板方向刺入5.0-6.0 mm，持续负压吸引10 s。髓核抽吸法作为目前较成熟的造模方法，诱导椎间盘退变效果明确，退变程度缓和。
纤维环薄层切除法建立椎间盘退变模型：显微镜辅助下用单刃刀在纤维环表面切除1 mm×2 mm范围，约占纤维环层厚的1/2(约1 mm)，避免切透纤维环造成髓核溢出。纤维环薄层切除法直接使纤维环结构受到不完全破裂，造成髓核内环境变化，髓核内蛋白多糖水分丢失，明确导致椎间盘发生退变，进一步佐证了人类纤维环结构的老化、结构不完整造成的椎间盘退变假说。

摘要
背景：国内外学者对椎间盘退变动物模型的建立做了大量工作，通过改变椎间盘力学特性、纤维环损伤、酶化学法等多种建模方式模拟椎间盘退变的病理表现。
目的：通过髓核抽吸法和纤维环薄层切除法建立椎间盘退变模型，比较两种方法的造模效果。
方法：取6月龄新西兰大白兔20只，通过手术暴露L3-4、L4-5及L5-6椎间盘，随机使用髓核抽吸法和纤维环薄层切除法对L3-4、L4-5椎间盘进行干预：①髓核抽吸组——利用16 G针头在椎间盘纤维环穿刺并负压抽吸10 s；②纤维环薄层切除组——在显微镜下辅助下，在兔椎间盘纤维环上切除1 mm×2 mm范围的约1/2层纤维环组织(避免切透全层)。于造模第1，3，5，9，13周进行核磁共振、X射线检查及椎间盘Masson染色病理学观察。
结果与结论：①X射线检查：纤维环薄层切除组椎间隙高度自术后第1周起便发生不同程度降低；髓核抽吸组椎间隙在术后1周及3周轻微降低，自第5周起发生较明显降低；纤维环薄层切除组术后第3，5，9周椎间隙高度指数百分比高于髓核抽吸组(P < 0.05)；②核磁共振检查：两种方法均诱导相应椎间盘发生退变，各组随时间推移椎间盘退变程度逐渐加重，并于9周后均达到4级退变；髓核抽吸组术后1，3，5周的椎间盘退变程度重于纤维环薄层切除组(P < 0.05)；③病理学观察：随时间推移，两组椎间盘髓核及纤维环退变程度逐渐加重；④结果表明：髓核抽吸法和纤维环薄层切除法均能诱导椎间盘退变，纤维环薄层切除法在5周内造成的椎间盘退变程度较髓核抽吸法轻，纤维环薄层切除法在纤维环上所造成的标示部位可作为纤维环修补研究的靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8143-522X(艾尔肯•阿木冬)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 椎间盘退变, 动物模型, 髓核抽吸法, 纤维薄层切除法

Abstract:

Abstract
BACKGROUND: Scholars around the world have attributed to establish the animal models of intervertebral disc degeneration (IVD) to imitate the IVD pathological manifestations by changing mechanical properties of the intervertebral disc, annulus fibrosus injury, and enzymatic method.
OBJECTIVE: To establish the IVD model by nucleus aspiration and partial annulus incision, and to compare the
modeling effects of the two methods.
METHODS: Twenty 6-month-old New Zealand white rabbits were selected, in which the IVD models were then induced by nucleus aspiration (group A) or partial annulus resection (group B) of surgically exposed L3-4, L4-5: group A, subjected to annulus puncture with a 16-gauge needle and 10-second negative pressure sunction; group B, about 1/2 part of the annulus (1 mm×2 mm) was cut under microscope, careful not to make a full-thickness incision. MRI, X-ray examinations and Masson staining were performed at 1, 3, 5, 9, and 13 weeks after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray examination: in the group B, the intervetebral space height began to decline in varying degrees at the 1st week postoperatively; in the group A, the intervetebral space height was decreased slightly at postoperative 1 and 3 weeks, and this reduction became obvious since the 5th week. The percentage of intervetebral space height in the group B was significantly higher than that in the group A at 3, 5 and 9 weeks postoperatively (P < 0.05). MRI examination: the IVD could be induced by these two methods, and became severer with time, which was classified as grade 4 according to the modified Thompson grading criteria at the 9th week. The IVD degree in the group A was significantly severer than that in the group B at postoperative 1, 3 and 5 weeks (P < 0.05). Masson staining showed that the IVD degree became severe with time in both two groups (P < 0.05). Both two methods can induce the IVD. Besides, the IVD degree caused by the partial annulus incision is slighter than that of the nucleus aspiration within 5 weeks, and the incision site is a potential target of annulus repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Interveterbral Disk Degeneration, Magnetic Resonance Imaging, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孟祥玉，巴穆登，艾尔肯•阿木冬. 两种方法建立兔腰椎间盘退变模型[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(4): 564-573.

Meng Xiang-yu, Ba Mu-deng, Aierken•Amudong. Establishment of a rabbit model of intervertebral disc degeneration using two methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(4): 564-573.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 20只大白兔中，1只因麻醉意外死亡，1只因术中误伤椎间盘旁血管丛导致失血死亡。术后各时间点随机选取1只处死做病理学检查，剩余13只(39个椎间盘)得到完整X射线片及MRI检查，并进入影像学数据统计分析。

2.2 影像学表现

X射线片检查结果：纤维环薄层切除组椎间隙高度自第1周起便发生不同程度降低；髓核抽吸组椎间隙在1周及3周轻微降低，自第5周起发生较明显降低。各期大白兔椎间隙高度指数百分比平均值见表1。

由表1可见，纤维环抽吸法及薄层切除法干预的椎间盘，其椎间隙高度指数百分比均呈现随时间推移下降的趋势，提示椎间隙出现退变；其中纤维环薄层切除组椎间隙高度指数百分比在前3个时间点较髓核抽吸组下降慢。采用随机区组资料方差分析，提示两组椎间隙高度指数百分比在第3，5，9周存在差异(P < 0.05)，根据椎间隙高度指数百分比均数可认为髓核抽吸法较纤维环薄层切除法能更快地造成纤维环高度变化；余时间点两组无统计学差异。

核磁共振检查结果：经放射科医师盲法诊断，Thompson改良评分法见表2，两种方法均诱导相应椎间盘发生退变，各组随时间推移椎间盘退变程度逐渐加重，并于9周后均达到4级退变，无明显变化(图3)。采用Mann-Whitney U检验对同一时间点不同组间椎间盘进行比较，得出两组第1，3，5周椎间盘退变程度存在统计学差异(P < 0.05)，根据评分表可判断髓核抽吸组较纤维环薄层切除组退变程度重；第9，13周后两组椎间盘退变不再变化，无需统计学分析。

2.3 椎间盘Masson染色病理表现见图4。

对椎间盘组织进行Masson染色后，胶原纤维可呈现蓝色，髓核细胞核可呈现深红色或褐色，细胞质呈现红色，该染色可对椎间盘的髓核细胞及纤维环胶原纤维的变化进行观察。

正常椎间盘具有完整的纤维环结构，胶原排列有序，并且结构清晰，与髓核组织的分界清晰。髓核组织胶原表现为均匀分布的疏松网状结构，髓核细胞呈类圆形，可单独分布或少量细胞聚集分布，细胞核小而不规则，细胞质可充满细胞。

髓核抽吸后1周时，被干预椎间盘纤维环无明显变化，3周时纤维环内层形成裂隙，髓核细胞出现轻微排列紊乱。髓核抽吸后5周时，被干预椎间盘纤维环细胞排列明显扭曲，形成较大裂隙，髓核组织细胞排列明显紊乱。第9周时，纤维环结构开始层离，排列明显紊乱，可见巨大裂隙贯穿纤维环，髓核组织局部出现不同程度纤维组织化生。第13周时纤维环重度层离，细胞排列错乱，髓核组织原有髓核细胞大量变性、凋亡，明显呈现纤维化。

纤维环薄层切除法术后1周时，纤维环开窗处缺如，其余部位排列略扭曲，髓核组织局部出现排列紊乱。第3周时，纤维环排列明显扭曲，并可见较大裂隙，髓核细胞。第5周时，纤维环结构出现不同程度的层离，细胞增殖、变性、凋亡增加，髓核组织细胞排列明显紊乱。纤维环开窗术后第9周时，纤维环组织松散，有瘢痕组织形成及骨化生表现，髓核组织纤维化严重，表现与纤维环相近。第13周时，纤维环组织大部分明显骨化，成纤维细胞散在错综排列，髓核组织原有细胞荒芜，呈纤维化生状。

参考文献

引言

材料方法

1.1 设计随机自体对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年1月在新疆医科大学第一附属医院实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：6月龄新西兰大白兔22只，体质量2.3-2.5 kg，雌雄不拘，由新疆医科大学动物中心提供。

主要实验器械及试剂：戊巴比妥钠粉剂(Merck)；硫酸庆大霉素注射液(河南润弘制药股份有限公司)；改良Masson三色染色试剂盒(PanEra)；15°眼科单刃刀，16 G穿刺针，显微外科显微镜，以及相关常规手术器械。

1.4 实验方法

兔腰椎解剖：预实验随机选取2只大白兔，安乐处死后解剖其腰椎组织，了解腰椎解剖结构。大白兔腰椎节段共有7节，从第1-7腰椎的椎体和椎间盘逐渐增大，每节腰椎横突自同节段椎体头端向头侧发出，与脊柱成锐角，该角度从L₁至L₇逐渐增大，横突长度逐渐增长；腰椎间盘位于横突起点前上方2.0-3.0 mm处；椎间盘的长轴两端头侧 1.5 mm范围内有血管丛发出，血管丛距离椎间盘的宽度由第1-7腰椎椎体逐渐缩短，手术暴露椎间盘时应避免分离该区域，以免血管丛损伤导致大出血^[3]。经测量所得椎间盘长轴长度由L₁-L₇逐渐增加，L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘长轴长度处于11-13 mm范围，因此穿刺针穿刺深度为5.0- 6.0 mm时可保证针头位于髓核中心部位。L₁-L₇椎体椎体椎间盘纤维环厚度数据分析并无递增规律，纤维环右侧边平均厚度为(2.63±0.18) mm，术中切割纤维环时应注意单刃刀的入刀深度，避免全层切割纤维环，造成对髓核组织的影响。

术前准备：术前进行X射线检查，排除脊柱畸形及其他椎间盘疾病。术前1 d禁食水，称体质量并计算麻醉剂量，用剃毛刀剃光术区15 cm×10 cm毛发。术前半小时肌肉注射庆大霉素注射液20-30 mg/kg，术前耳缘静脉缓慢注射1%戊巴比妥钠溶液3.0-4.0 mL/kg，待3-5 min疼痛反应消失后即可手术^[4]。术中可局部注射利多卡因注射液，以减少戊巴比妥钠药量，避免因麻醉深度过深引起麻醉意外死亡及复苏时间过长。

兔椎间盘退变造模方法：麻醉满意后，将20只大白兔取左侧卧位并固定，用碘伏消毒后铺一次性手术单，取背最长肌外侧缘切口，切开皮肤、皮下组织并止血，显露腹外斜肌，延腹外斜肌筋膜边缘切开，减少肌肉组织损伤，暴露背最长肌，钝性剥离背最长肌及腹内斜肌暴露腹横肌，可触及腹横肌与腰椎横突的结合点，游离保护髂腹下神经，延腰椎各横突外缘连线纵行切断腹横肌可见腹膜，钝性游离腹膜及内侧肌肉组织，可见突起的银白色L₄_-5、L₃_-4、L₅_-6椎间盘，保护椎间盘两端组织^[5]。用止血钳夹持“花生米”纱布球钝性清理椎间盘表面的系膜等软组织暴露椎间盘^[6]。采用两种方法随机干预L₄_-5、L₃_-4椎间盘：①采用单纯髓核抽吸法^[7]，用16 G注射针头在椎间隙平行终板方向刺入5.0-6.0 mm，持续负压吸引10 s；②纤维薄层切除法：显微镜辅助下用单刃刀在纤维环表面切除1 mm×2 mm范围，约占纤维环层厚的1/2(约1 mm)，避免切透纤维环造成髓核溢出。用碘伏水、生理盐水冲洗切口，逐层缝合切口，最后用纱布及绷带包扎切口。

术后处理：术后及时臀部肌肉注射庆大霉素20- 30 mg/kg。烘干大白兔毛发，注意保暖，待麻醉复苏后镇痛治疗并送回笼中标准条件喂养。连续3 d于臀部肌肉注射庆大霉素注射液20-30 mg/kg，切口无菌换药，观察切口情况及大白兔后肢运动表现，10-14 d视切口愈合情况拆线。

1.5 主要观察指标

X射线片检查：术后第1，3，5，9，13周，所有大白兔均在1%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉下、右侧卧位进行X射线检查，其影像结果请高年资影像科医师采用Syngo fastView软件对椎间隙高度指数进行测算，图1，并根据椎间隙高度指数百分比对椎间隙的变化进行评估，椎间隙高度指数百分比=术后椎间隙高度指数/术前椎间隙高度指数^[8]。

核磁共振检查：术后第1，3，5，9，13周，所有大白兔均接受核磁检查，所有大白兔均在1%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉下、右侧卧位进行MRI腰椎矢状位扫描，MRI采用Siemens公司1.5T超导型磁共振扫描仪，膝关节线圈通过椎间盘矢状正中切面。采用自旋回波序列，TR为2 950 ms，TE为100 ms，间距3 mm扫描，观察椎间盘的信号改变。结果由放射科高年资医师采用Thompson改良椎间盘退变评分法进行盲法阅片诊断(图2)^[9]。采用软件将术后各阶段术后大白兔的L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘影像资料进行测量分析，判定其退变等级。

病理组织学检查：术后第1，3，5，9，13周，各随机选取1只大白兔，行X射线及核磁检查后安乐处死，完整截取第2-6腰椎，保护其间的椎间盘组织，用钢锯沿白色的

骨性终板边缘平行于终板方向完整截取椎间盘组织，其中L₂_-₃椎间盘无手术干预，L₃_-₄、L₄_-₅、L₅_-₆椎间盘为相应手术干预的组织；用无菌生理盐水冲洗血迹，体积分数4%甲醛溶液固定24 h，然后用脱钙液4 ℃条件下脱钙3 d，石蜡包埋后行Masson染色。Masson染色流程：对样本进行脱蜡、梯度入水、温热水漂洗等处理；染色：染色前先用蒸馏水湿润玻片30-60 s，①R1核染液染色60 s，倒丢，冲洗液进行30 s冲洗；②R2浆染液染色30-60 s，倒丢，冲洗液冲洗30 s左右；③R3黄色分色液分色6-8 min，弃去分色液，不需冲洗；④直接用R4蓝色复染液染色5 min，倒丢，用无水乙醇冲洗干净；⑤吹干后进行封固、镜检。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理。椎间隙高度指数为计量资料，采用随机区组资料方差分析，α=0.05。术后核磁共振退变评分为计数资料，采用非参数检验Mann-Whitney U 检验，α=0.05。

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讨论

椎间盘退变性疾病是结构学和生物学改变联合引起的病理现象，但目前对于椎间盘退变性疾病的病因、发病机制的研究尚不明确。近年来退变机制及早期修复治疗的方法一直是研究热点^[10]，国内外学者在椎间盘退变动物模型的研究做了大量工作，通过改变椎间盘力学特性，纤维环损伤，酶化学法等多种建模方式模拟椎间盘退变的病理表现^[11]。

通过椎间盘的应力分布改变导致纤维环损伤，影响到了椎间盘的强度和完整性，纤维环穿刺法作为较为成熟的造模方式，能够稳定地诱导椎间盘退变，其机制可能为纤维环的破损使其保水能力下降，造成髓核组织慢性脱水、变性，其退变所需时间为4-8周^[12]。传统纤维环切开法是用尖刀在椎间盘纤维环中央纵行切开一道裂隙，纤维环结构破坏，椎间盘在短期内造成剧烈退变。国外学者Gregory等^[13]认为，考虑到目前椎间盘退变的治疗包括了髓核的生物再生，纤维环残余包含新生髓核组织的能力就变得尤为重要了。临床干预治疗不仅要致力于髓核的再水合和再生，还要把修复和加强纤维环来限制髓核突出作为治疗重点。基于此点的造模方法不仅要有成功诱导退变的能力，还要有明确的纤维环靶点供二期手术修补干预，实验中用显微镜在纤维环上切除1 mm×2 mm范围的约1/2层纤维环组织，便是为二期用成纤维细胞生物补片修补纤维环做准备^[14-15]。

核磁共振成像检查能够清晰地表现椎间盘的图像，Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量下降是椎间盘退变的主要特征，其致使髓核组织内水分丢失，这些变化表现在核磁共振成像上T2信号强度的降低，以及椎间隙狭窄^[16]。Masson染色能显示纤维环Ⅱ型胶原在髓核组织内的表达情况，是常用的病理免疫组织化学染色方法。

实验将髓核抽吸法、纤维环薄层切除法施加于同一只大白兔的2个椎间盘上，以自体对照研究法观察两种方法对相应椎间盘的影响。术后MRI、病理染色及免疫组化染色结果显示，两种方法均造成了不同程度的椎间盘退变，其中髓核抽吸法作为目前较成熟的造模方法，诱导椎间盘退变效果明确，退变程度缓和，大部分大白兔于术后第5周MRI显示T2加权像出现Thompson改良椎间盘退变分级4级退变；纤维环薄层切除法诱导椎间盘退变较髓核抽吸法更缓和，于术后5周前椎间盘退变程度均较髓核抽吸法轻。两种方法在术后第9周后均表现为重度退变，无明显差异。

综上所述，两种方法均能有效建立兔椎间盘退变模型，髓核抽吸法退变模型对椎间盘损伤较小，对人类椎间盘慢性退变过程有较好的比拟性；纤维环薄层切除法直接使纤维环结构受到不完全破裂，造成髓核内环境变化，髓核内蛋白多糖水分丢失，明确导致椎间盘发生退变，进一步佐证了人类纤维环结构的老化、结构不完整造成的椎间盘退变假说。通过此次研究，纤维环开窗法可更缓和地诱导椎间盘退变，其造成的纤维环破裂部位可为二期纤维环修补提供良好靶点，而且可为进一步研究椎间盘退变的临床治疗提供可靠科研平台。

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