C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损模型的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (36): 5793-5798.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.010

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C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损模型的建立

罗道文1，黄馗1，王雷1，罗世洪1，饶鹏程1，肖金刚1，2

西南医科大学附属口腔医院，1口颌面修复重建和再生实验室，2口腔颌面外科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2017-07-26 出版日期:2017-12-28 发布日期:2018-01-04
通讯作者: 肖金刚，博士，教授，主任医师，硕士研究生导师，西南医科大学附属口腔医院，四川省泸州市 646000
作者简介:罗道文，男，1992年生，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事口腔颌面外科临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(813671125)；四川省科技厅项目(2014JY0044)；四川省教育厅项目(10-ZB030)；四川省卫生厅项目(80170)；泸州医学院重点项目(201207)；泸州市人民政府-西南医科大学科技战略合作项目(2015LZCYD-S05(2/12))

Establishment of a C57 mouse model of osteoporosis with calvarial critical-size defects

Luo Dao-wen1, Huang Kui1, Wang Lei1, Luo Shi-hong1, Rao Peng-cheng1, Xiao Jin-gang1, 2

1Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2017-07-26 Online:2017-12-28 Published:2018-01-04
Contact: Xiao Jin-gang, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Luo Dao-wen, Studying for master’s degree, Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 813671125; the Program of Science & Technology Department of Sichuan Province, No. 2014JY0044; the Project of Education Department of Sichuan Province, No. 10-ZB030; the Project of Health Department of Sichuan Province, No. 80170; the Key Project of Luzhou Medical College, No. 201207; the Luzhou Municipal Government-Southwest Medical University Science and Technology Strategic Cooperation Project, No. 2015LZCYD-S05(2/12)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨极量缺损：又称之为临界骨缺损(Critical size defect，CSD)，是指动物依靠自身修复能力不能恢复的最小骨缺损。其目的是减少因动物的年龄、种系、骨缺损所在部位不同等因素对骨缺损愈合的影响，排除自身混杂因素的干扰，从而使建立的骨缺损模型更加地可靠。Gupta等研究确定小鼠颅骨极量缺损为4 mm。
微计算机断层扫描技术(micro computed tomography，Micro-CT)：又称微型CT、显微CT，是一种非破坏性的3D成像技术，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。它与普通临床的CT最大的差别在于分辨率极高，可以达到微米(μm)级别，目前国内一家自主研发Micro-CT的公司已经将分辨率提高到0.5 μm，具有良好的“显微”作用。Micro-CT可用于医学、药学、生物、考古、材料、电子、地质学等领域的研究。

摘要
背景：双侧卵巢切除法就被作为研究绝经后骨质疏松的动物模型建立的最常用方法之一，目前对于C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损的模型尚未有明确的研究。
目的：建立骨质疏松症伴颅骨极量缺损的C57小鼠动物模型。
方法：选用8周龄C57雌性小鼠36只随机分为2组，一组行双侧卵巢切除术建立骨质疏松组(模型组)，另一组切除双侧卵巢附近与卵巢质量接近的脂肪组织建立对照组(对照组)；造模后6周分别取2组小鼠股骨进行Micro-CT扫描和苏木精-伊红染色，确定模型组小鼠骨质疏松症建立成功；然后取模型组和对照组小鼠各6只，在颅顶对称制造2个直径为4 mm的圆形骨缺损，造模后8周行Micro-CT扫描评价颅骨缺损区骨愈合状况。
结果与结论：①造模后6周，模型组较对照组小鼠骨体积分数、骨表面积体积比、骨小梁厚度，骨小梁数量及骨小梁分离度、骨密度显著下降(P < 0.05)，骨小梁结构疏松或断裂，骨髓腔变大；②骨缺损造模后8周，两组小鼠颅骨Micro-CT示骨缺损均未自然修复；③结果表明，骨质疏松伴颅骨极量缺损的C57小鼠模型建立成功。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5239-2462(罗道文)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 骨质疏松, 卵巢切除术, 颅骨极量缺损, 动物模型, C57小鼠, Micro-CT, 股骨组织切片, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bilateral ovariectomy is a most commonly used method to establish an animal model of postmenopausal osteoporosis. Up to now, little is reported on the C57 mouse model of osteoporosis with calvarial critical-size defects.
OBJECTIVE: To establish the C57 mouse model of osteoporosis with calvarial critical-size defects.
METHODS: Thirty-six C57 mice aged 8 weeks were randomly divided into two groups: the mice in model group received bilateral ovariectomy, and the same weight of fat tissues around the ovaries of the other mice were cut as control group. At 6 weeks after modeling, the mouse femur was removed for micro-CT scan and hematoxylin-eosin staining to testify whether there is a success or failure in animal modeling. Afterwards, six mice were respectively selected from each group, and two round calvarial defects with a diameter of 4 mm were symmetrically made on the parietal bone. The defect healing was evaluated by micro-CT scan at 8 weeks after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: At 6 weeks after modeling, the bone volume fraction, bone surface to volume ratio, trabecular thickness, trabecular number, trabecular spacing and bone mineral density in the modeling group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). In the model group, there were loosen or fractured trabeculae, and enlarged medullary cavity. At 8 weeks after bone defects, showed no significant micro-CT changes in the defect region in both two groups. These findings implicate a success in establishing the C57 mouse model of osteoporosis with calvarial critical-size defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoporosis, Ovariectomy, Skull, Tissue Engineering

罗道文，黄馗，王雷，罗世洪，饶鹏程，肖金刚. C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损模型的建立[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(36): 5793-5798.

Luo Dao-wen1, Huang Kui1, Wang Lei1, Luo Shi-hong1, Rao Peng-cheng1, Xiao Jin-gang1, 2. Establishment of a C57 mouse model of osteoporosis with calvarial critical-size defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(36): 5793-5798.

图/表（结果） 1

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引言

骨质疏松症是中老年人的一种常见病、多发病，其特征有骨量降低、骨组织微细结构的退变或破坏，骨脆性增加和易发生骨折等^[1]。骨质疏松症患者的骨代谢异常主要表现为破骨细胞功能亢进^[2]、成骨细胞数目及活性降低^[3]，从而有骨折延迟愈合、骨不连、骨缺损等临床症状的出现^[4-5]，这些均是困扰临床工作的医学难题。虽然有学者采用自体骨移植对骨缺损进行修复^[6]，而且对于骨缺损的修复取得了较好的效果，但是自体骨移植修复存在着能够植取的骨量有限、容易引起供骨区畸形等缺点^[7]。也有学者采用异体骨移植的方法修复骨缺损^[8]，虽然异体骨移植不仅取材方便，还能够减少手术的次数，但是异体骨存有抗原性，会引发机体的免疫排斥反应，致使移植骨难以存活，同时还存在着潜在传播疾病的风险以及一系列的并发症如感染、骨折、骨不愈合等等。而且在骨质疏松状态下，骨吸收大于骨的形成导致新骨形成能力减弱，所以骨质疏松症患者伴骨缺损愈合难度相对正常患者而言更大。因此临床上迫切需要研究在骨质疏松状态下新的骨缺损修复方法以促进骨缺损愈合。

近年来，随着组织工程学、生物材料工程学的发展，有许多学者对于骨缺损的修复做了一定的研究^[9-15]，研究过程中颅骨极量缺损的动物模型都起到了不可或缺的作用。Gupta等^[16]研究得出结论认为小鼠颅骨极量缺损的范围为4 mm，小鼠颅骨极量缺损的模型已经得到建立与应用，并且在1969年Saville利用大鼠建立了绝经后骨质疏松症动物模型的模型后^[17]，双侧卵巢切除法就被作为研究绝经后骨质疏松的动物模型建立的最常用方法之一，且小鼠与大鼠的生理特点相似，切除卵巢后能建立绝经后骨质疏松症。目前对于C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损的模型尚未有明确的研究，故此实验的目的就是建立C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损模型，为临床研究骨质疏松症伴骨缺损的修复提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年8月至2016年5月在西南医科大学附属口腔医院口颌面修复重建和再生实验室。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选择8周龄雌性体健C57小鼠36只，普通级，体质量17-20 g，购于西南医科大学基础医学部实验动物中心。动物许可证号：SCXK(川) 2013-17。

1.3.2 主要试剂戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司产品)；多聚甲醛(成都市科龙化工有限公司产品)；EDTA(广东光华科技股份有限公司产品)；苏木精-伊红(HE)(北京索莱宝科技有限公司产品)。

1.3.3 主要仪器电子天平FA200(上海精天天平厂)；小型电钻(Dremel Sty-Lus^TM 1100-01，美国)；钻头(SE-Diamond Burr Set，美国)；光学显微镜(Olympus BX51，日本)；石蜡切片机(Leica，德国)；Micro-CT(Scanco viva40，瑞士)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组采用计算机随机法将动物随机分为骨质疏松症模型组和对照组2组，每组各18只。清洁环境饲养，自由进食、饮水，定期环境消毒。

1.4.2 骨质疏松症模型的建立模型组小鼠采用电子天平称质量后，采用1%的戊巴比妥钠按20 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，全麻起效后，将小鼠俯卧位固定于手术操作台上，在小鼠背部两侧肋缘下10 mm，脊柱两侧5 mm处为中心，10 mm为半径常规备皮，消毒、铺巾，无菌条件下于小鼠背部两侧肋缘下10 mm，脊柱两侧5 mm分别做一长约 5 mm的皮肤切口，依次切开皮肤层、筋膜层、肌肉层和腹膜进入腹腔，在切口视野中寻找到乳白色发亮的脂肪团，该部位是寻找卵巢的重要解剖标志，在脂肪团中找到粉红色呈桑葚状的小鼠卵巢，结扎并完整切除(如图1)，彻底止血，分层缝合肌肉、筋膜、皮肤；对照组保留卵巢而在其周围切除与卵巢质量接近的脂肪组织，其余操作同模型组。手术后均给予2组小鼠4×10⁴U青霉素腹腔注射^[18]，防止术后感染，并且将两组小鼠在相同条件下饲养。

1.4.3 股骨Micro-CT分析在手术6周后，模型组及对照组小鼠各取12只采用颈椎脱臼法处死，无菌条件下取小鼠左侧股骨，剔除筋膜及肌肉，迅速用新鲜配制的40 g/L多聚甲醛固定液进行固定，4 ℃固定24 h后取出利用Micro-CT机扫描股骨干骺端(n=6)，观察骨密度变化。扫描条件为55 kVp、109 μA、分辨率10.5 μm，曝光时间200 ms，扫描的层数1 200层。

1.4.4 股骨组织学分析经固定后的小鼠股骨经PBS充分清洗后，放入4 ℃ 10%EDTA(pH 8.0)的溶液中，脱钙 20 d，脱钙完全后，用常规用乙醇梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，连续纵行组织切片，厚5 μm，苏木精-伊红染色(n=6)，在光学显微镜下观察模型组及对照组小鼠骨组织结构，以确定骨质疏松症建立成功。

1.4.5 骨缺损模型的建立术后6周，确定骨质疏松症模型建立成功后，将模型组及对照组各取6只小鼠用电子天平分别称质量后，采用1%的戊巴比妥钠按20 mg/kg剂量腹腔注射麻醉，全麻起效后，常规颅骨术区备皮、消毒、铺巾，在严格无菌条件下，在颅顶正中线做一长约15 mm的纵行切口，依次切开皮肤、皮下组织至骨膜层，充分暴露额骨和颅骨，切开并掀起颅骨表面骨膜并予以切除，用电钻分别在颅顶区颅骨上左右对称制造两个不相连的直径为 4 mm的圆形骨缺损，去骨过程中间断用力钻磨并用生理盐水持续喷注冷却钻头及颅骨，防止产热过多，损伤颅脑组织，形成的骨缺损周围无锐利骨尖残留，边界清楚，缺损处硬脑膜完整(如图2)，彻底止血后，对位缝合，术后护理同卵巢切除术后一致。

1.4.6 颅骨Micro-CT扫描观察小鼠颅骨极量缺损手术8周后，将模型组及对照组共12只小鼠采用电子天平称质量后，使用20 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，待小鼠处于麻醉状态后，小鼠取俯卧位，用透明胶带固定小鼠，采用Micro-CT对小鼠颅骨进行活体扫描，扫描条件：55 kVp、109 μA、分辨率10.5 μm、曝光时间200 ms，扫描的层数1 200层，扫描完毕后利用Micro-CT内置软件对小鼠整个颅骨进行三维重建。

1.5 主要观察指标 ①小鼠骨体积分数(BV/TV)、骨表面积体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb、Th)，骨小梁数量(Tb.N)及骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨密度(BMD)；②骨组织切片苏木精-伊红染色结果；③小鼠骨缺损术后颅骨Micro-CT三维重建结果。

1.6 统计学分析所得数据采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，计算结果以x(_)±s形式表示，检验水准α= 0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨质疏松症是一种以破骨细胞增加、成骨细胞减少为特征的疾病，容易出现骨折愈合延迟、骨再生能力下降及骨缺损等表现，这在绝经后的女性身上更容易发生，因为绝经后女性的雌激素的减少导致破骨细胞活性增强，成骨细胞不足，骨的吸收大于新骨的形成，常导致此类患者骨量的流失^[19]。骨量的流失可使骨脆性增加而易发生骨折或骨质缺损。成骨细胞的不足导致骨新生的速度减慢，而新生骨痂的减少将使骨质疏松症患者的骨缺损修复相对于正常患者而言更加地困难。故临床上迫切需要研究骨质疏松症状态下骨缺损修复方法，以促进此类患者骨缺损愈合。为此，对于骨质疏松症状态极量骨缺损修复研究而建立骨质疏松症极量骨缺损的动物实验模型将是必要的前提，但是目前对于此类C57小鼠模型尚无明确的研究。故本实验主要利用C57小鼠去卵巢的方法建立小鼠骨质疏松模型，并在此基础上建立颅骨极量骨缺损模型，以利于该疾病的实验研究。

对于骨质疏松评价方法很多种，虽然有学者采用骨密度测定法^[20]，即使用双能X线吸收法对小鼠骨密度及骨矿物盐含量进行测定，但是此方法存在不能完全体现骨强度的变化以及无法反映骨结构的缺点^[21]。也有学者采用Micro-CT扫描技术来进行评价^[22]，Micro-CT不仅可以全面、清晰、精确地表现出骨骼的三维解剖结构，得到的三维图像具有成像清晰、分辨率较高等特点，还可以从三维结构对小鼠的松质骨及密质骨的变化进行测定。所以本实验对小鼠股骨干骺端使用Micro-CT扫描，清楚地观察到骨质疏松症组小鼠较对照组小鼠的骨小梁数量、骨密度及骨体积分数等均存在不同程度的降低，差异有统计学意义 (P < 0.05)，这与Li等^[23]、Azuma等^[24]学者发现的结果一致，而出现这些表现的原因是切除卵巢的小鼠，雌激素分泌减少，影响了成骨细胞与破骨细胞的活性，进而打破了骨形成与骨吸收的动态平衡而造成骨吸收大于骨形成，最终导致骨量的丢失^[25]。骨组织病理学显示小鼠双侧卵巢切除6周后较对照组小鼠股骨骨小梁变细、断裂，骨髓腔变大，骨小梁间距变宽，结构变得疏松紊乱，这些均是典型的骨质疏松改变，与Micro-CT扫描结果相一致，证明了骨质疏松模型建立的成功^[26]。

目前常用于建立骨缺损模型的动物和建立骨质疏松症的模型动物主要有大鼠、小鼠、犬、兔等^[27-32]，不同动物建立的模型都有其各自的特点。对于犬这类比较大型的动物，虽然手术操作简单，但是这类动物存在成本费用高，难以得到高样本数量以及实验周期较长等缺点。兔是目前建立骨缺损模型比较常用的动物，但是雌兔达到性成熟需要5到6个月^[33]，建立骨质疏松症及骨缺损模型的时间相比四五周达到性成熟的小鼠而言时间更长^[34]，从而使用小鼠可以极大地缩短实验周期。小鼠具有价格便宜、容易饲养、自身抗感染以及手术耐受性较好等特点。既往已经有研究证明颅骨与颌面区骨成骨方式类似，均以膜内成骨的方式成骨，且在解剖学上颅骨为两层皮质骨中间间隔松质骨，相比其他的部位骨而言，具有血供差，骨髓少，骨再生能力弱等特点，这样相对较小的缺损动物也不能自行修复，所以颅骨经常作为研究骨缺损修复的常用部位^[35-37]，也有学者在小鼠的下颌骨或者股骨上建立极量骨缺损模型的研究^[38-39]，但是在小鼠股骨上或者下颌骨上建立极量骨缺损后，将对小鼠的活动或进食造成影响从而影响小鼠骨缺损的愈合。颅骨区手术操作不仅相对容易，便于控制缺损尺寸，而且对研究对象术后活动影响较小，小鼠麻醉苏醒后，小鼠便可以自由活动以及进食，未对小鼠的日常生活造成太大影响，有利于小鼠术后自身的恢复，故本实验以小鼠的颅骨作为极量缺损作为研究的内容。本实验采用建立直径为4 mm对称的圆形颅骨极量缺损，术后8周经Micro-CT扫描结果显示：两组小鼠颅骨缺损区均未完全修复，且骨缺损面积未见明显减小，表明小鼠依靠自身的修复能力无法修复直径为4 mm的颅骨缺损，与Gupta等^[16]的研究结果基本一致。

综上所述，本实验证明8周龄C57小鼠通过切除双侧卵巢的方法可成功建立骨质疏松症模型，并在此基础上结合颅骨极量缺损可成功建立骨质疏松症伴颅骨极量缺损的C57小鼠动物模型。因此实验研究可以为组织工程骨修复骨质疏松伴骨缺损的实验和修复研究打下坚实的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

C57小鼠骨质疏松症伴颅骨极量缺损模型的建立

Establishment of a C57 mouse model of osteoporosis with calvarial critical-size defects

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