甘精胰岛素干预2型糖尿病大鼠骨折愈合进程及骨钙素的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.36.003

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
甘精胰岛素：属于长效胰岛素类似物。胰岛素类似物是通过DNA重组技术对人胰岛素不同氨基酸位点进行修饰产生的，这样不影响生理作用和与胰岛素受体结合的能力，但是与胰岛素样生长因子1受体结合能力有差异。体外细胞实验研究表明，甘精胰岛素相比人胰岛素有更强的胰岛素样生长因子1受体结合能力及促有丝分裂潜力。
骨钙素：为钙结合蛋白，由成骨细胞分泌，是反映成骨细胞活性的特异而敏感的指标，其血清含量能反映全部骨形成及骨转换的情况。研究2型糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨钙素表达的情况，反映成骨细胞功能及骨折早期骨形成、骨折愈合后期骨痂重建情况。

摘要
背景：目前胰岛素类似物广泛应用于临床糖尿病的治疗，其中不同分子结构的甘精胰岛素相比人胰岛具有较高的胰岛素样生长因子1受体亲和力，两者对2型糖尿病骨折愈合进程的影响是否相同还待进一步研究。
目的：观察甘精胰岛素及人胰岛素对2型糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨钙素表达及骨痂形成的影响及其差异，探讨甘精胰岛素影响糖尿病骨折愈合进程的机制。
方法：64只SD大鼠随机分为人胰岛素组、甘精胰岛素组、糖尿病组、骨折对照组。前3组大鼠给予高糖高脂饮食1个月，予小剂量链脲佐菌素腹腔注射2次，制作2型糖尿病模型。4组大鼠均造成右胫骨骨折模型。人胰岛素组予预混人胰岛素干预治疗，甘精胰岛素组予甘精胰岛素干预治疗。于1，2，4，6周拍摄各组大鼠右胫骨X射线，显微镜下观察骨痂形成以及成骨细胞数量，ELISA法检测血清骨钙素水平。
结果与结论：①X射线结果显示，人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨折愈合程度优于糖尿病组；②光镜观察结果显示，人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨痂内成骨细胞增殖数量明显多于糖尿病组；③各组骨钙素水平均呈上升趋势，人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组明显高于糖尿病组(P < 0.05)；人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨钙素水平相比差异无显著性意义(P > 0.05)；④综上，甘精胰岛素干预治疗2型糖尿病大鼠胫骨骨折可以增加其血清骨钙素水平，加快骨痂形成，促进骨折愈合进程，在此次实验条件下其作用与人胰岛素无明显差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3685-2593(辛兵)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 胰岛素, 胰岛素类似物, 甘精胰岛素, 2型糖尿病, 骨折, 骨钙素

Abstract:

BACKGROUND: Insulin analogues have been extensively applied in the treatment of diabetes mellitus. Insulin glargine has a higher affinity for insulin like growth factor 1 receptor compared with human insulin. Further research is needed to ensure whether insulin and its analogues exert same effects on fracture healing in type 2 diabetes mellitus.
OBJECTIVE: To observe the osteocalcin expression and callus formation in the healing of fracture in type 2 diabetic rats induced by human insulin and insulin glargine, to observe the difference between two treatment methods, and to explore the related mechanisms.
METHODS: Sixty-four Sprague-Dawley rats were randomly assigned into human insulin group (group A), insulin glargine group (group B), diabetes mellitus group (group C) and control group (group D). Rats in the groups A, B and C were fed with high-sugar and high-fat diet for 4 weeks followed by intraperitoneal injection of small-dosage streptozotocin twice, to establish the rat models of type 2 diabetes mellitus. After the right tibia of each rat was broken, insulin glargine and Novolin 30R were used in the groups A and B, respectively. Fracture healing was observed on X-ray, callus formation and number of osteoblasts were observed by microscope, and serum level of osteocalcin was measured by ELISA method at 1, 2, 4, and 6 weeks after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray results revealed better fracture healing in the groups A, B and D than the group C. Osteoblast proliferation in callus was significantly better in the groups A, B and D than in the group C. Serum level of osteocalcin in each group was on the rise, which was significantly higher in the groups A, B and D than the group C (P < 0.05), but had no significant difference among groups A, B and D (P > 0.05). In summary, insulin glargine can increase the serum level of osteocalcin, accelerate the callus formation, and improve the healing of fracture in type 2 diabetic rats. Furthermore, there is no significant difference in the therapeutic efficacy between insulin glargine and human insulin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Insulin, Diabetes Mellitus, Type 2, Tibial Fractures, Osteocalcin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

郑柏，辛兵，黄栋，刘永涛，刘国栋，孙柏寒，袁峰，何玉泽. 甘精胰岛素干预2型糖尿病大鼠骨折愈合进程及骨钙素的表达[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(36): 5752-5756.

Zheng Bai1, Xin Bing2, Huang Dong2, Liu Yong-tao2, Liu Guo-dong1, Sun Bai-han1, Yuan Feng2, He Yu-ze2. Effects of insulin glargine on fracture healing and osteocalcin expression in type 2 diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(36): 5752-5756.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 64只大鼠随机分为4组，其中48只建立2型糖尿病大鼠模型，造模过程中2只大鼠血糖不达标，1只大鼠甘精胰岛素干预治疗过程中血糖自行恢复正常，予以排除，实验过程中及时补足。4组大鼠均制作右胫骨骨折模型，无感染死亡，均纳入实验分析，每组16只。

2.2 X射线观察结果

第1周：各组骨折线明显，治疗组骨膜增厚较糖尿病组明显。

第2周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组可见少量稀疏连续骨痂影，糖尿病组末见骨痂影。

第4周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组可见稀松连续骨痂影，骨密度增强，糖尿病组少许稀松骨痂影。

第6周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组可见连续骨痂影，骨密度增强，骨折线模糊。糖尿病组稀松连续骨痂影，骨折线可见(图1)。

2.3 苏木精-伊红染色观察结果

第1周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组可见成骨细胞数目增多，纤维性骨痂形成，骨折对照组成骨细胞数量低于人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组，未见纤维骨痂形成。

第2周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨折断端可见纤维骨痂及软骨痂，新生血管形成，糖尿病组纤维骨痂稀松，软骨痂形成明显少于其余各组。

第4周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨折断端可见大量软骨骨痂形成，纤维母细胞数量减少。糖尿病组纤维骨痂，纤维母细胞无明显减少。

第6周：人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨折断端可见大量软骨骨痂，骨性骨痂形成，纤维骨痂消失。糖尿病组可见稀松软骨骨痂，骨性骨痂形成(图2)。

2.4 血清骨钙素及血糖水平各组大鼠骨折后血清骨钙素水平呈上升趋势，在第2周达高峰，第4周出现回落，第6周继续回落。通过方差齐性检验，各组骨钙素质量浓度方差齐。人胰岛素组、甘精胰岛素组予胰岛素干预治疗后随机血糖水平维持在8-16 mmol/L；糖尿病组未予干预治疗，血糖水平较高，波动在22-33 mmol/L；骨折对照组随机血糖水平保持在3.5-6.5 mmol/L。因为血糖对骨钙素的表达有影响^[3]，以大鼠平均血糖水平作为协变量，采用协方差分析结果显示，各时间点，不同组别骨钙素质量浓度差异有显著性意义(P < 0.05)；对各组骨钙素质量浓度进行两两比较，发现糖尿病组低于其余3组(P < 0.05)，但人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组3组间差异无显著意义(P > 0.05)，见表1，2。

参考文献

[1] Kurtzhals P, Schäffer L, Sørensen A, et al. Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use. Diabetes. 2000;49(6): 999-1005.

[2] 林心君,王麒又,辛金钟,等. 高成模率和高稳定性的糖尿病大鼠模型制备——高脂高糖膳食+STZ体重联合体表面积法构建糖尿病大鼠模型[J].中国老年学杂志, 2013,33(9): 2051-2054.

[3] 唐立群,宫明智,刘中浩,等. 糖尿病大鼠骨折愈合过程中骨钙素的变化[J]. 中华实验外科杂志, 2006, 23(4):617-618.

[4] Moseley KF. Type 2 diabetes and bone fractures. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2012;19(2): 128-135.

[5] Yamagishi S. Role of advanced glycation end products (AGEs) in osteoporosis in diabetes. Curr Drug Targets. 2011;12(14): 2096-2102.

[6] Graves DT, Kayal RA. Diabetic complications and dysregulated innate immunity. Front Biosci. 2008;13:1227-1239.

[7] Yamaguchi T. [Bone metabolism in dyslipidemia and metabolic syndrome]. Clin Calcium. 2011;21(5): 677-682.

[8] 宫明智,邢德国,刘中浩,等. 糖尿病大鼠骨折后骨形态发生蛋白-2、胰岛素样生长因子-1的变化[J]. 中华创伤杂志, 2007,23(12)：945-948.

[9] Pollak MN, Schernhammer ES, Hankinson SE. Insulin-like growth factors and neoplasia. Nat Rev Cancer. 2004;4(7): 505-518.

[10] Smith U, Gale EA. Does diabetes therapy influence the risk of cancer? Diabetologia.2009;52(9): 1699-1708.

[11] Shukla A, Grisouard J, Ehemann V, et al. Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines. Endocr Relat Cancer. 2009;16(2): 429-441.

[12] Bronsveld HK, ter Braak B, Karlstad Ø, et al. Treatment with insulin (analogues) and breast cancer risk in diabetics; a systematic review and meta-analysis of in vitro, animal and human evidence. Breast Cancer Res. 2015;17: 100.

[13] 李裕明,邓波,李丽华,等.葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[J]. 中华医学杂志, 2009, 89(36): 2583-2585.

[14] Wang Y, Menendez A, Fong C, et al. IGF-I Signaling in Osterix-Expressing Cells Regulates Secondary Ossification Center Formation, Growth Plate Maturation, and Metaphyseal Formation During Postnatal Bone Development. J Bone Miner Res. 2015;30(12): 2239-2248.

[15] Ren G, Ali T, Chen W, et al. The role of selenium in insulin-like growth factor I receptor (IGF-IR) expression and regulation of apoptosis in mouse osteoblasts. Chemosphere. 2016; 144: 2158-2164.

[16] 梁立阳,杜敏联,夏焱,等.胰岛素对长骨成骨细胞的影响及受体后机制的研究[J].中国病理生理杂志,2006,22(11):2251-2255.

[17] 李溪,向盈盈,龚跃昆,等.糖尿病骨折大鼠骨痂组织中成骨细胞增殖和骨钙素表达与骨形态发生蛋白2干预的关系[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(20):3857-3861.

[18] 王德亮,邢德国,王亮,等. 胰岛素样生长因子-1基因转染骨髓间质干细胞移植对糖尿病大鼠骨折愈合的影响[J].中华实验外科杂志,2012, 29(3):518-520.

[19] 王德亮,邢德国,王亮,等.骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓间充质干细胞移植对糖尿病大鼠骨折愈合的影响[J].中华创伤杂志, 2012, 28(11):1042-1045.

[20] Celil AB, Campbell PG. BMP-2 and insulin-like growth factor-I mediate Osterix (Osx) expression in human mesenchymal stem cells via the MAPK and protein kinase D signaling pathways. J Biol Chem. 2005;280(36): 31353-31359.

[21] Bolli GB, Hahn AD, Schmidt R, et al. Plasma exposure to insulin glargine and its metabolites M1 and M2 after subcutaneous injection of therapeutic and supratherapeutic doses of glargine in subjects with type 1 diabetes. Diabetes Care. 2012;35(12): 2626-2630.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年11月至2016年4月在徐州医科大学实验动物中心(SPF级屏障系统)完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 70只清洁级雄性SD大鼠、体质量(180±20)g，8周龄，徐州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)2015-0030。选择64只大鼠根据随机数表法分为4组，即人胰岛素组、甘精胰岛素组、糖尿病组、骨折对照组，每组16只。

1.3.2 试剂及仪器链脲佐菌素，美国Sigma公司提供；0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4.2；高糖高脂大鼠饲料，上海斯莱克实验动物有限责任公司；预混人胰岛素(诺和灵30R)，丹麦诺和诺德公司；胰岛素类似物(甘精胰岛素)，赛诺菲安万特；血糖仪，强生公司；骨钙素ELISA检测试剂盒，上海西唐生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 2型糖尿病模型制作人胰岛素组、甘精胰岛素组、糖尿病组大鼠予高脂高糖饮食4周后，予大鼠空腹时腹腔注射2次链脲佐菌素25 mg/(kg•m²)，间隔2 d。链脲佐菌素剂量：大鼠体质量≤200 g，按25 mg/kg计算链脲佐菌素量；>200 g按162.45 mg/m² [体表面积=大鼠体型系数(0.09)×体质量2/3]计算链脲佐菌素量；二者相加即为1次链脲佐菌素的注射剂量。链脲佐菌素配置：在避光冰浴条件下， 0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，现用现配，浓度为0.25%。骨折对照组：大鼠腹腔内注射等容量生理盐水。

1.4.2 成模标准尾静脉采血，2次空腹血糖≥ 11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L^[2]。实验过程中血糖不达标大鼠以及低血糖死亡大鼠，随时补足替换。

1.4.3 骨折模型制作 4组大鼠均在6%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉下无菌手术，用压钳造成右胫骨中上1/3处横形骨折，无菌生理盐水冲洗，逐层缝合关闭切口，微夹板外固定。

1.4.4 糖尿病干预治疗人胰岛素组诺和灵30R 10 U/(kg•d)皮下注射；甘精胰岛素组甘精胰岛素 10 U/(kg•d)皮下注射；糖尿病组、骨折对照组不予治疗。饮食：各组每天予相同普通大鼠饲料定量饮食22 g/只，水不限。

1.5 主要观察指标分别于骨折后第1，2，4，6周每组随机取4只大鼠，拍摄右胫骨X射线，摄片条件：电压40 kV、曝光时间50 ms、电流强度10 mA、距离90 cm。将大鼠全身麻醉后，从门静脉采血约4 mL，以3 000 r/min离心 15 min，取上清液-80 ℃保存待测；切开骨折处取局部骨痂组织，体积分数10%甲醛固定24 h，用15%EDTA脱钙，4 ℃冰箱脱钙3周，每周换1次脱钙液；以细针刺入为脱钙终点。梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，切片厚5 μm，常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察骨细胞增殖分化情况；ELISA法检测血清骨钙素，使用酶标仪在450 nm处测吸光度(A)值，以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，通过绘制标准曲线求出标本中骨钙素浓度；监测空腹及随机血糖。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0进行统计分析，计量资料采用x(_)±s表示，组内比较采取单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采取协方差分析(COANOVA)。检验水准：α=0.05，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前关于糖尿病影响骨折愈合的机制已有了大量的研究。长期高血糖可通过增加局部炎症反应、糖基化终末产物AGEs形成、活性氧自由基ROS大量形成，以及增加肿瘤坏死因子α，降低骨形成细胞因子表达等途径，影响骨细胞增殖分化成熟，影响骨胶原的合成，骨痂的形成，从而影响骨折的愈合的过程以及后期骨重建过程^[4-8]。临床上主要通过降糖药物、外源性胰岛素及其类似物来控制血糖，干预糖尿病对骨折愈合的影响。胰岛素可能与胰岛素受体和胰岛素样生长因子1受体相结合, 介导MAPK与PI3K-AKT通路信号传导，发挥一定的促细胞增殖作用^[9]。

甘精胰岛素是通过DNA重组技术对人胰岛素不同氨基酸位点进行修饰产生的，这样不影响生理作用和与胰岛素受体结合的能力，但是与胰岛素样生长因子1受体结合能力有差异，体外细胞实验研究表明，甘精胰岛素相比人胰岛素有更强的胰岛素样生长因子1受体结合能力及促有丝分裂潜力^[1]。Smith等^[10]研究发现，体外甘精胰岛素与胰岛素样生长因子1受体的结合力增加了90倍。而Shukla等^[11-12]通过胰岛素类似物作用于多种乳腺癌细胞株的体外研究表明，胰岛素类似物促进了细胞增殖，其中以甘精胰岛素作用尤为明显，认为可能通过MAPK与PI3K/AKT途径发挥作用。

李裕明等^[13]在观察大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究中发现，相同浓度葡萄糖培养基中加入胰骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并改善高糖对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的抑制作用，且参与骨形成的间充质干细胞、成骨细胞等细胞膜均存在胰岛素受体及胰岛素样生长因子1受体^[14-15]。梁立阳等^[16]在胰岛素对长骨成骨细胞增殖和功能的影响实验研究中发现，胰岛素具有生长因子样的作用，可通过其受体酪氨酸蛋白激酶介导的MAPK信号途径参与了促成骨细胞的生长增殖的作用，呈剂量依赖性的方式刺激成骨细胞生长，但高胰岛素状态以及长时间的胰岛素作用后此种增强效应消失。

骨钙素为钙结合蛋白，完全由成骨细胞分泌，是反映成骨细胞活性的特异而敏感的指标，其血清含量能反映全部骨形成，及骨转换的情况。唐立群等^[3]在研究中发现高血糖可导致骨折愈合过程中成骨细胞转化能力减弱，骨钙素表达减少，影响骨折愈合的进程。宫明智等^[8]研究发现糖尿病骨折愈合过程中血清及骨痂组织中骨形态发生蛋白2、胰岛素样生长因子1表达明显减少。而李溪等^[17]的实验证实了糖尿病大鼠骨折后骨钙素生成率降低，骨折愈合延迟，骨折愈合强度下降，使用骨形态发生蛋白2的干预治疗后可以促进骨钙素的生成，促进骨折的愈合。王德亮等^[18-19]通过将胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间质干细胞移植糖尿病大鼠骨折间隙，研究发现其可以促进骨折的愈合进程。

本实验显示，第6周X射线示人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组骨折线已模糊，骨痂切片光镜观察示骨性骨痂大量形成，明显优于糖尿病组。各组大鼠骨折后血清骨钙素水平呈上升趋势，在第2周达高峰，第4周开始回落，甘精胰岛素及人胰岛素干预治疗后血清骨钙素表达增加，明显优于糖尿病组，而人胰岛素组、甘精胰岛素组、骨折对照组3组之间血清骨钙素表达水平差异无显著性意义。实验表明，甘精胰岛素及人胰岛素治疗可以补充胰岛素的不足，良好的控制血糖水平，改善高血糖的不利因素，改善局部微环境，减少由高糖引起的细胞凋亡，逆转高糖对成骨细胞分化的抑制作用，促进2型糖尿病大鼠骨折的愈合过程。

甘精胰岛素与人胰岛素可以提高成骨细胞骨钙素的表达，一方面与其降低血糖水平有关，另一方面胰岛素可以促进骨形态发生蛋白2、胰岛素样生长因子1等细胞因子的表达以及激活自身受体胰岛素受体和胰岛素样生长因子1受体，通过MAPK途径，促进成骨细胞的增殖分化成熟^[20]。而甘精胰岛素与预混人胰岛素对骨折愈合的影响无显著差异可能因为：①体外细胞实验浓度与体内动物实验药物浓度不同，血浆组织液以及组织微环境胰岛素分配不同；②因为甘精胰岛素在体内经过药物代谢，主要作用成分是胰岛素-GlyA21M1^[21]，其与成骨细胞胰岛素受体及胰岛素样生长因子1受体的结合能力可能与人胰岛素无明显差异；③在体内胰岛素样生长因子1与胰岛素竞争与胰岛素样生长因子1受体结合，且胰岛素样生长因子1与胰岛素样生长因子1受体结合能力大于甘精胰岛素以及人胰岛素。

本实验是小样本动物实验，且尚未检测各组大鼠血清及骨痂胰岛素样生长因子1表达水平是否有差异，还需要结合临床进一步研究。总之，甘精胰岛素治疗可以促进成骨细胞增殖分化成熟，促进2型糖尿病骨折的愈合进程，本实验条件下其作用与人胰岛素无显著差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程