脂肪间充质干细胞条件培养基制备温敏凝胶外用治疗皮肤烫伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (30): 4852-4859.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.017

• 药物控释材料 drug delivery materials • 上一篇下一篇

脂肪间充质干细胞条件培养基制备温敏凝胶外用治疗皮肤烫伤

刘培¹，胡振生¹，马玲¹，王换换²，李栋²

山东大学齐鲁医院，¹整形美容科，²低温医学研究室，山东省济南市 250012

收稿日期:2017-05-12 出版日期:2017-10-28 发布日期:2017-11-07
通讯作者: 李栋，博士，副教授，山东大学齐鲁医院低温医学研究室，山东省济南市 250012
作者简介:刘培，女，1982年生，山东省聊城市人，汉族，2010年山东大学毕业，博士，主治医师，主要从事烧伤整形的临床研究。
基金资助:
中华医学会欧莱雅项目(H2015121409)

Therapeutic effect of adipose derived mesenchymal stem cell conditioned medium thermosensitive hydrogel on skin scald

Liu Pei¹, Hu Zhen-sheng¹, Ma Ling¹, Wang Huan-huan², Li Dong²

¹Department of Burn & Plastic Surgery, ²Cyromedicine Lab, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2017-05-12 Online:2017-10-28 Published:2017-11-07
Contact: Li Dong, M.D., Associate professor, Cyromedicine Lab, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China
About author:Liu Pei, M.D., Attending physician, Department of Burn & Plastic Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China
Supported by:
CMA-LOREAL China Hair Grant, No. H2015121409

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

温敏水凝胶：温敏水凝胶多由胶原、壳聚糖和甘露醇等组成，混合干细胞或其分泌物后，对烫伤、软骨损伤等疾病具有良好临床应用前景。温敏凝胶的凝固机制是通过热诱导将质子从壳聚糖转移到甘油磷酸上，减少带正电荷的氨基间的斥力，形成壳聚糖链间的强相互作用，提高脂肪间充质干细胞条件培养基及其中的生物活性物质的黏附性，并延长因子释放保留时间，制备简便，安全可靠。

条件培养基：在细胞培养过程中，会分泌活性物质到培养液中，其中细胞因子是主要的活性物质之一，这种含有细胞分泌物的培养液就叫做条件培养液。利用条件培养液可有效提高细胞或组织体外培养的成功率，而且不同来源的条件培养液有不同的促进或抑制作用。

背景：有研究显示脂肪干细胞参与烫伤后皮肤组织的修复，但利用脂肪干细胞分泌物制备水凝胶，并治疗皮肤烫伤的研究尚未见报道。

目的：分析人脂肪干细胞条件培养基水凝胶外用治疗小鼠皮肤烫伤模型的疗效。

方法：采用酶解联合贴壁培养法，从脂肪组织培养获得脂肪干细胞并进行鉴定。取稳定增殖期细胞，收集其条件培养基，加入壳聚糖、甘露醇、β-甘油磷酸钠和透明质酸等制备温敏水凝胶，同时用新鲜脂肪干细胞完全培养基制备水凝胶。24只C57BL/6小鼠背部脱毛后用95 ℃铝块烫伤10 s快速建立3度皮肤烫伤模型，右侧以脂肪干细胞条件培养基水凝胶每天涂抹2次；左侧使用脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶每天涂抹2次，连续涂抹7 d，观察愈合时间与愈合进程，计算愈合率，在烫伤后第4，14，28天取材进行苏木精-伊红染色观察组织病理学变化。

结果与结论：①人脂肪间充质干细胞为成纤维状，增殖旺盛，平均倍增时间为55 h，可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，高表达CD29、CD44、CD90和CD105，低表达CD31和CD34，证明其符合间充质干细胞的标准；②用人脂肪间充质干细胞条件培养基制备的温敏水凝胶在4-20 ℃呈现为清凉透明的黏稠液体，放入37 ℃ 15 min变为半固态凝胶；③95 ℃铝块烫伤小鼠表皮、真皮及皮下脂肪和肌肉组织的正常结构完全破坏，符合严重的3度烫伤标准，伤口面积均大致为3 cm²；④在修复过程中发现，与新鲜培养基水凝胶对照组相比，脂肪干细胞条件培养基水凝胶组创口愈合时间短，伤口整洁，瘢痕增生少，创面组织结构恢复好；⑤脂肪干细胞条件培养基水凝胶组炎症浸润深度、炎症浸润细胞密度、肉芽组织厚度、成纤维细胞密度、新生血管密度和表皮厚度等指标显著好于新鲜培养基水凝胶组，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑥以上结果表明，人脂肪间充质干细胞条件培养基水凝胶可有效促进烫伤皮肤伤口愈合，提高再生皮肤质量。

ORCID: 0000-0002-6496-4605(李栋)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 缓释材料, 皮肤烫伤, 脂肪间充质干细胞, 条件培养基, 温敏水凝胶

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that adipose derived mesenchymal stem cells are involved in the skin repair after scald, but the hydrogel made of the excreta by adipose derived mesenchymal stem cells is rarely reported in the treatment of skin scald.

OBJECTIVE: To analyze the therapeutic effect of human adipose derived mesenchymal stem cell conditioned medium hydrogel in a mouse model of skin scald.

METHODS: Adipose derived mesenchymal stem cells were obtained from adipose tissues by enzyme digestion combined with adherent culture method. Morphological and flow cytometry were used to identify phenotype and induce differentiation. Secondly, the stable proliferative phase cells were harvested to obtain the conditioned medium, and chitosan, mannitol, beta-glycerol phosphate sodium and hyaluronic acid were added to prepare the thermosensitive hydrogel. Then the 95 ℃ aluminum block was used to rapidly establish a model of degree III skin scald on the left (experimental group) and right (control group) sides of the back of 24 C57BL/6 mice. In the experimental group, adipose derived stem cell conditioned medium hydrogel was applied twice a day on the right side of the mouse back, and in the control group, fresh medium hydrogel was applied twice a day on the left side of the mouse back. The treatment period lasted for 7 days. Healing time and healing process were observed to calculate the healing rate. Histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin staining at paraffin sections at 4, 14, 28 days after skin scald.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The human adipose derived mesenchymal stem cells had fibroblast-like morphology and proliferated vigorously, and the average doubling time was 55 hours. These cells could be induced to differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. High expression of CD29, CD44, CD90 and CD105 were observed on these cells with low expression of CD31 and CD34, which met the standard of mesenchymal stem cells. (2) The thermosensitive hydrogel prepared by the conditioned medium was cool and transparent viscous liquid at 4-20 ℃, and was changed into semi-solid gel at 37 ℃ after 15 minutes. (3) The normal structures of the epidermis, dermis, subcutaneous fat and muscle tissue of 95 ℃ aluminum block scalded mice were completely destroyed, which met the standards of degree III burns. The wound area was roughly 3 cm². (4) In the repair process, shorter wound healing time, less scar and better dermis structure were observed in the experimental group compared with the control group. (5) Inflammatory infiltration, thickness of granulation tissue, epidermal thickness, fibroblasts and vascular density were significantly improved in the experimental group as compared with the control group (P < 0.05). To conclude, human adipose derived mesenchymal stem cells conditioned medium hydrogel can promote the wound healing and promote the quality of regenerated skin after skin scald.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Culture Media, Conditioned, Hydrogel, Skin, Wounds and Injuries, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

刘培，胡振生，马玲，王换换，李栋. 脂肪间充质干细胞条件培养基制备温敏凝胶外用治疗皮肤烫伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(30): 4852-4859.

Liu Pei, Hu Zhen-sheng, Ma Ling, Wang Huan-huan, Li Dong.

Therapeutic effect of adipose derived mesenchymal stem cell conditioned medium thermosensitive hydrogel on skin scald

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(30): 4852-4859.

图/表（结果） 7

2.1 人脂肪间充质干细胞基本生物学特征脂肪组织消化得到的单个核细胞培养2 d后就有少量成纤维状细胞贴壁(图1A)，经过约10 d培养后这些细胞汇合成片，传代两三次后能获得长梭形的形态均一的细胞(图1B)，平均倍增时间为55 h。

在适当的分化条件诱导下，所获得的贴壁细胞可以向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。向成骨细胞诱导分化后，细胞渐渐聚集生长，诱导14 d后大部分细胞出现钙化胞外基质，茜素红S染色阳性(图1C)，碱性磷酸酶染色阳性(图1D)；向脂肪细胞诱导分化1周后，细胞开始变得宽大，细胞内出现脂肪颗粒(图1E)，14 d后> 75%的细胞内油红O染色阳性(图1F)，软骨的成功诱导则以出现甲苯胺蓝胶原染色阳性(图1G)和Ⅱ型胶原免疫组化阳性结果(图1H)为准。

流式细胞仪检测结果显示，所获得的贴壁细胞CD31和CD34表达极低，CD29、CD44、CD90和CD105表达阳性(图1I)。这些结果证明所获得的贴壁细胞符合脂肪间充质干细胞的标准。

2.2 制备的脂肪干细胞条件培养基水凝胶的理化性质在4-20 ℃条件下，脂肪干细胞条件培养基水凝胶为清亮透明的黏稠液体(图1J，pH=6.5)，而当放入37 ℃ 15 min后，变为半固态凝胶状(图1J，pH=7.2)。表明脂肪干细胞条件培养基水凝胶可以在生理条件下凝胶化。

2.3 小鼠皮肤烫伤造模及病理学检测结果构建C57BL/6小鼠烫伤模型后立即取小鼠烫伤区域皮肤行苏木精-伊红染色，结果示小鼠表皮、真皮及皮下脂肪和肌肉组织的结构完全破坏，符合严重的3度烫伤标准(图2A)，各组造模小鼠的伤口面积均大致为3 cm²，在修复实验过程中，发现脂肪干细胞条件培养基水凝胶组创口(右侧)愈合时间明显短于脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶组(左侧)，且伤口恢复更为整洁，瘢痕增生较少(图2B-D)。第4，14天两组的伤口愈合速率和总体伤口愈合时间见表1，逐日统计结果见图2E，可见脂肪干细胞条件培养基水凝胶组的愈合快于脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。

取局部皮肤组织行苏木精-伊红染色，与脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶组相比，在相同时间点脂肪干细胞条件培养基水凝胶组创面表皮层和真皮层组织结构恢复得更好，组织完整，细胞排列更加有序(图3)。为了研究脂肪干细胞条件培养基水凝胶对急性期伤口炎症浸润和再上皮化的影响，测量第4天炎症浸润的相关指标，如炎症浸润深度和炎症浸润细胞密度，以及上皮舌的长度(图3A，D，表2)；为了研究脂肪干细胞条件培养基水凝胶对烫伤愈合过程中血管新生和肉芽组织形成的影响，测量第14天相关参数，包括肉芽组织厚度、肉芽组织内成纤维细胞和新生血管的密度(图3B，E，表3)；为了评估烫伤皮肤再生的总体结构修复情况，测量第28天有关损伤修复的指标，如表皮的厚度、真皮的厚度、表皮覆盖程度与真皮分化程度(图3C，F，表4)。

参考文献

[1]Mandapalli PK, Labala S, Jose A, et al. Layer-by-Layer Thin Films for Co-Delivery of TGF-β siRNA and Epidermal Growth Factor to Improve Excisional Wound Healing. AAPS Pharm Sci Tech. 2017;18(3):809-820.

[2]Nakamichi M, Akishima-Fukasawa Y, Fujisawa C, et al. Basic Fibroblast Growth Factor Induces Angiogenic Properties of Fibrocytes to Stimulate Vascular Formation during Wound Healing. Am J Pathol. 2016;186(12): 3203-3216.

[3]Lord MS, Ellis AL, Farrugia BL, et al. Perlecan and vascular endothelial growth factor-encoding DNA-loaded chitosan scaffolds promote angiogenesis and wound healing. J Control Release. 2017;250:48-61.

[4]丁韧,汤学明.创伤愈合的细胞生物学进展[J].创伤外科杂志, 2000,2(1):59.

[5]王红梅,郭光华,曾小平,等.骨髓间充质干细胞靶向治疗大鼠烫伤创面愈合[J].中国细胞生物学学报,2010,32(1):69-72.

[6]Lopez-Santalla M, Menta R, Mancheño-Corvo P, et al. Adipose-derived mesenchymal stromal cells modulate experimental autoimmune arthritis by inducing an early regulatory innate cell signature. Immun Inflamm Dis. 2016;4(2):213-224.

[7]De Jesus MM, Santiago JS, Trinidad CV, et al. Autologous Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells for the Treatment of Psoriasis Vulgaris and Psoriatic Arthritis: A Case Report. Cell Transplant. 2016;25(11):2063-2069.

[8]Riester SM, Denbeigh JM, Lin Y, et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 2017;6(3):910-922.

[9]Panés J, García-Olmo D, Van Assche G, et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 2016;388(10051):1281-1290.

[10]Staff NP, Madigan NN, Morris J, et al. Safety of intrathecal autologous adipose-derived mesenchymal stromal cells in patients with ALS. Neurology. 2016;87(21):2230-2234.

[11]Chen YW, Scutaru TT, Ghetu N, et al. The Effects of Adipose-Derived Stem Cell-Differentiated Adipocytes on Skin Burn Wound Healing in Rats. J Burn Care Res. 2017; 38(1):1-10.

[12]闫飞,王曌华,刘艳玲,等.脐带间充质干细胞促进烫伤创面愈合的作用机制[J].中国生物制品学杂志,2016,29(10): 1047-1051.

[13]Fang F, Huang RL, Zheng Y, et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cells inhibit the proliferative and profibrotic phenotype of hypertrophic scar fibroblasts and keloid fibroblasts through paracrine signaling. J Dermatol Sci. 2016;83(2):95-105.

[14]Qu Y, Zhang Q, Cai X, et al. Exosomes derived from miR-181-5p-modified adipose-derived mesenchymal stem cells prevent liver fibrosis via autophagy activation. J Cell Mol Med. 2017 Apr 6. [Epub ahead of print]

[15]Hu L, Wang J, Zhou X, et al. Exosomes derived from human adipose mensenchymal stem cells accelerates cutaneous wound healing via optimizing the characteristics of fibroblasts. Sci Rep. 2016;6:32993.

[16]Zhang J, La X, Fan L, et al. Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cell transplantation in rat burn models. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(5):5129-5136.

[17]吴在德,吴肇汉. 外科学[M]. 7版.北京:人民卫生出版社,2008.

[18]褚锋,刘建国,唐帆,等.小鼠Ⅲ度烧伤模型的复制及皮肤病理形态改变的动态观察[J].中国实验动物学报, 2009,17(3): 213-215.

[19]Zhang K, Pei Y, Gan Z, et al. Local Administration of Thiamine Ameliorates Ongoing Pain in a Rat Model of Second-Degree Burn. J Burn Care Res. 2017 Feb 7. [Epub ahead of print]

[20]Lavertu M, Filion D, Buschmann MD. Heat-induced transfer of protons from chitosan to glycerol phosphate produces chitosan precipitation and gelation. Biomacromolecules. 2008;9(2):640-650.

[21]Niranjan R, Koushik C, Saravanan S, et al. A novel injectable temperature-sensitive zinc doped chitosan/β-glycerophosphate hydrogel for bone tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2013;54:24-29.

[22]Dhivya S, Saravanan S, Sastry TP, et al. Nanohydroxyapatite-reinforced chitosan composite hydrogel for bone tissue repair in vitro and in vivo. J Nanobiotechnology. 2015;13:40.

[23]Cheng YH, Yang SH, Su WY, et al. Thermosensitive chitosan-gelatin-glycerol phosphate hydrogels as a cell carrier for nucleus pulposus regeneration: an in vitro study. Tissue Eng Part A. 2010;16(2):695-703.

[24]Kiyozumi T, Kanatani Y, Ishihara M, et al. Medium (DMEM/F12)-containing chitosan hydrogel as adhesive and dressing in autologous skin grafts and accelerator in the healing process. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2006;79(1):129-136.

[25]Kiyozumi T, Kanatani Y, Ishihara M, et al. The effect of chitosan hydrogel containing DMEM/F12 medium on full-thickness skin defects after deep dermal burn. Burns. 2007;33(5):642-648.

[26]Hu MS, Maan ZN, Wu JC, et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 2014;42(7):1494-1507.

[27]Ud-Din S, Volk SW, Bayat A. Regenerative healing, scar-free healing and scar formation across the species: current concepts and future perspectives. Exp Dermatol. 2014;23(9):615-619.

[28]Dahiya P. Burns as a model of SIRS. Front Biosci (Landmark Ed). 2009;14:4962-4967.

[29]Silva L, Garcia L, Oliveira B, et al. Acute respiratory distress syndrome in burn patients: incidence and risk factor analysis. Ann Burns Fire Disasters. 2016;29(3): 178-182.

[30]Kim A, Lang T, Xue M, et al. The Role of Th-17 Cells and γδ T-Cells in Modulating the Systemic Inflammatory Response to Severe Burn Injury. Int J Mol Sci. 2017;18(4): E758.

[31]Cao F, Liu T, Xu Y, et al. Culture and properties of adipose-derived mesenchymal stem cells: characteristics in vitro and immunosuppression in vivo. Int J Clin Exp Pathol. 2015;8(7):7694-7709.

[32]Xishan Z, Baoxin H, Xinna Z, et al. Comparison of the effects of human adipose and bone marrow mesenchymal stem cells on T lymphocytes. Cell Biol Int. 2013;37(1): 11-18.

[33]Maria AT, Maumus M, Le Quellec A, et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells in Autoimmune Disorders: State of the Art and Perspectives for Systemic Sclerosis. Clin Rev Allergy Immunol. 2017;52(2):234-259.

[34]Shalaby SM, Sabbah NA, Saber T, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells modulate the immune response in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis model. IUBMB Life. 2016;68(2):106-115.

[35]Manferdini C, Maumus M, Gabusi E, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells exert antiinflammatory effects on chondrocytes and synoviocytes from osteoarthritis patients through prostaglandin E2. Arthritis Rheum. 2013;65(5): 1271-1281.

[36]Liu S, Yuan M, Hou K, et al. Immune characterization of mesenchymal stem cells in human umbilical cord Wharton's jelly and derived cartilage cells. Cell Immunol. 2012;278(1-2): 35-44.

[37]Soleymaninejadian E, Pramanik K, Samadian E. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells: cytokines and factors. Am J Reprod Immunol. 2012;67(1): 1-8.

[38]Masson F. Skin hydration and hyaluronic acid. Ann Dermatol Venereol. 2010;137 Suppl 1:S23-25.

[39]Deitch EA, Gelder F, McDonald JC. Prognostic significance of abnormal neutrophil chemotaxis after thermal injury. J Trauma. 1982;22(3):199-204.

[40]Hacker S, Mittermayr R, Nickl S, et al. Paracrine Factors from Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells Improve Skin Regeneration and Angiogenesis in a Porcine Burn Model. Sci Rep. 2016;6:25168.

[41]Ong HT, Redmond SL, Marano RJ, et al. Paracrine Activity from Adipose-Derived Stem Cells on In Vitro Wound Healing in Human Tympanic Membrane Keratinocytes. Stem Cells Dev. 2017;26(6):405-418.

[42]Zhong Z, Gu H, Peng J, et al. GDNF secreted from adipose-derived stem cells stimulates VEGF-independent angiogenesis. Oncotarget. 2016;7(24):36829-36841.

引言

皮肤烫伤易致残，如何加快愈合时间并提高愈合质量是目前临床难题，近几年随着生物医学技术的进步，发现多种细胞生长因子如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等都可以促进组织细胞修复和伤口愈合^[1-3]。虽然促进组织修复的因子有很多，但是单一因子作用效果有限。应用细胞进行烫伤的修复成为研究热点，细胞不但可以分泌多种细胞因子营养组织，还直接参与伤口纤维和血管化，可促进创面愈合^[4-5]。

皮肤分为表皮、真皮及皮下组织3层，皮下组织中的脂肪不但可以保护上层的细胞，提供缓冲作用，还可以提供间充质干细胞。脂肪间充质干细胞来自中胚层，可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞类型，经过体外扩增可治疗自身免疫性疾病^[6]、银屑病^[7]、骨关节炎^[8]、肛瘘^[9]、肌萎缩侧索硬化症等多种疾病^[10]。虽然有研究显示脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞参与烫伤后皮肤组织的修复^[11-13]，但利用脂肪间充质干细胞分泌物制备水凝胶，并治疗皮肤烫伤的研究尚未见报道。作者推测脂肪间充质干细胞分泌的多种细胞因子、外泌体exosome及小分子物质可促进烫伤过程中表皮和真皮组织的修复，抑制过度炎症反应^[14-15]。

实验制备脂肪间充质干细胞条件培养基，加入壳聚糖、海藻酸钠等构建温敏水凝胶，分析脂肪间充质干细胞条件培养基水凝胶用于治疗皮肤烫伤的可能性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计按照随机分组和相互对照原则设计、样本重复性单因素基础动物实验研究。

1.2 时间及地点实验于2016年1至10月在山东大学齐鲁医院低温医学研究室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6周龄未交配C57BL/6小鼠24只，体质量30-40 g，清洁级，购于山东大学实验动物中心。所有饲养及实验流程符合《山东大学实验动物伦理审查的基本原则》的规定，每只小鼠每天进食约20 g，自由饮水，每天光照12 h/黑暗12 h。

1.3.2 主要试剂胎牛血清(美国GIBCO公司)；DMEM/F12=1︰1培养基、高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA(德国Miltenyi Biotec公司)；鼠抗人单克隆抗体10 µL：FITC-CD34，PE-CD44，FITC-CD45，PE-CD73，PE-CD90和PE- CD105(美国BD公司)；地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、IBMX、吲哚美辛、胰岛素、壳聚糖、甘露醇、海藻酸钠(美国Sigma公司)；大分子透明质酸(山东福瑞达药业有限公司)；鼠抗人抗Ⅱ型胶原抗体(美国Abcam公司)；guava easyCyte 6HT流式细胞仪(Millipore， Billerica， MA)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的培养与鉴定常规吸脂术所得脂肪来自山东大学齐鲁医院整形外科，患者知情同意，无菌剪刀将脂肪剪成小粒后无菌生理盐水洗涤3遍，以体积比为1︰5的比例加入0.3%的Ⅰ型胶原酶/PBS消化液中，37 ℃恒温气浴120 r/min恒温振荡30 min；吸弃液面油脂，将消化产物通过100 μm滤网过滤到一个新的50 mL离心管中，以1 500 r/min离心10 min，将细胞沉淀用PBS重悬，以3×10⁹ L^-1的细胞浓度加入脂肪间充质干细胞培养基(含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL的青链霉素、 2 mmol/L谷氨酰胺、2 μg/L成纤维细胞生长因子、2 μg/L表皮生长因子、2 μg/L血管内皮生长因子和2 μg/L血小板衍生因子BB的DMEM/F12=1︰1培养基)，置于通气盖培养瓶中，将培养瓶放入37℃体积分数为5%CO₂培养箱中；以后每周2次全量换液。待细胞生长至60%-80%汇合时，使用0.25%胰蛋白酶/PBS液1︰3传代。第4代以后的细胞用于后续实验。

取第3-5代稳定增殖的贴壁细胞，使用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA消化后计数，将10⁶个细胞悬浮在100 µL含1%牛血清白蛋白的PBS中，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体10 µL：FITC-CD34，PE-CD44，FITC-CD45，PE-CD73，PE-CD90和PE-CD105，在室温标记15 min，PBS洗涤2次，采用Guava easyCyte 6HT流式细胞仪及其自带的Guava Incyte V2.8 (Millipore)软件进行流式细胞术分析。

取第3-5代稳定增殖的成纤维状细胞，置于不同的诱导培养基中，起始培养密度为2×10⁴/cm²，每三四天全量换液1次。成骨方向诱导培养基为含体积分数为10%胎牛血清、0.15 µmol/L地塞米松、0.25 mmol/L抗坏血酸和60 mmol/L β-甘油磷酸钠的α-MEM培养基。成脂方向诱导培养基为含体积分数为10%胎牛血清，0.25 mmol/L IBMX，0.1 mmol/L吲哚美辛，0.15 µmol/L地塞米松和7 mg/L胰岛素的高糖DMEM培养基。软骨方向诱导培养基为含体积分数为10%小牛血清，3 μg/L转化生长因子β1，0.1 μmol/L地塞米松， 5 mmol/L β-甘油磷酸钠，0.2 mmol/L维生素C，2 mg/L胰岛素，30 mg/L丙酮酸钠，0.4 g/L牛血清白蛋白，2 mg/L亚硒酸，2 mg/L亚油酸。细胞在诱导分化14 d后使用40 g/L多聚甲醛固定4 h以上；成骨细胞诱导使用碱性磷酸酶染色，阳性信号为蓝紫色；对于成骨细胞特有的钙沉积，使用1%茜素红S水溶液染色鉴定，钙沉积为红色沉淀；对于脂肪细胞特有的脂肪颗粒，使用0.3%的油红O-60%异丙醇溶液染色，脂肪颗粒染为红色。软骨诱导后甲苯胺蓝染色检测胶原表达，免疫组化检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。

1.4.2 脂肪干细胞条件培养基温敏水凝胶的配制取第5代稳定增殖脂肪干细胞，待细胞贴壁生长融合率达到70%-80%时，全量换液为新鲜的脂肪间充质干细胞培养基，24-36 h后收集培养基，3 000 r/min离心30 min去除细胞碎片，0.22 μm滤膜过滤除菌后备用；将壳聚糖粉末溶解在0.1 mol/L的盐酸溶液中，制成2%的壳聚糖溶液，加入甘露醇粉末使其终浓度为0.25%，加入相对分子质量为(120-140)×10⁴的大分子透明质酸使其终浓度为0.5%-1%，加入海藻酸钠使其终浓度为3%-5%，最后使用1 mol/L的NaOH水溶液调整pH值为6.5，高压蒸汽灭菌备用为A液；将β-甘油磷酸钠粉末溶于三蒸水中配成50%溶液，经0.22 μm滤网过滤除菌为B液；在冰浴条件下将制备的A液和B液按体积比5︰1比例充分混合后，再加入3倍体积的脂肪干细胞条件培养基，即制成脂肪干细胞条件培养基温敏水凝胶，放于4 ℃备用；同时用新鲜脂肪干细胞完全培养基制备水凝胶对照组。此水凝胶在31-37 ℃放置15 min即可形成固态的凝胶状。

1.4.3 实验分组 24只C57BL/6小鼠背部两侧制备烫伤模型，左侧烫伤区域使用脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶治疗，为对照组；右侧烫伤区域使用脂肪干细胞条件培养基水凝胶治疗，为实验组。

1.4.4 C57BL/6小鼠3度烫伤模型的建立及脂肪干细胞条件培养基温敏水凝胶治疗小鼠用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，背部皮肤剪毛并使用松香和石蜡局部脱毛，使用恒温95℃的电加热铝块在脱毛部位烫伤10 s^[16]，背部左右两侧均为正方形烫伤区域，大约为3 cm²，伤后小鼠单笼单只饲养，以避免互相舔吸伤口。实验组(右侧)烫伤部位每天均匀涂抹脂肪干细胞条件培养基水凝胶，对照组(左侧)烫伤部位每天均匀涂抹脂肪干细胞新鲜培养基水凝胶，每天早晚各涂抹1次，连续7 d。分别于烫伤后4，14，28 d检测两组伤口愈合情况，计算公式如下：未愈合比例=未愈合面积/原创口面积；愈合率=(原创口面积-未愈合面积)/原创口面积×100%。愈合时间是指创口完全再上皮化的所需时间。然后按预先设定时间麻醉处死(每个时间点6只小鼠)，取背部烫伤区及周边区1.5 cm×1.5 cm大小皮肤，用40 g/L多聚甲醛中性液固定8 h，常规制作5 μm石蜡切片进行苏木精-伊红染色，采用人体烧伤深度标准对小鼠皮肤烫伤深度进行分类^[17]。

1.5 主要观察指标 ①人脂肪间充质干细胞基本生物学特征；②小鼠皮肤烫伤造模及病理学检测结果；③各组小鼠创口愈合率和完全愈合时间；④各组小鼠皮肤病理形态。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，方差齐性采用Levene检验，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

以往小鼠皮肤烫伤模型研究曾经使用混合固体燃料或乙醇涂抹皮肤点燃烧伤建立3度烧伤动物模型^[18-19]，但灼烧温度不恒定且无法测量；实验所采用恒温金属烫伤的方法可以有效地控制烫伤面积和时间，而且刚性的金属可以方便控制接触皮肤的压力。经过多次反复实验，采用该方法建立的皮肤烫伤模型操作简便，可以稳定复制出3度烫伤模型，为下一步研究脂肪干细胞水凝胶在烫伤修复中的作用奠定了基础。

实验制备了由脂肪干细胞条件培养基、胶原，壳聚糖、β-甘油磷酸钠组成的温敏水凝胶，并验证了其在烫伤外涂抹中的作用。温敏凝胶的凝固机制是通过热诱导将质子从壳聚糖转移到甘油磷酸上，减少带正电荷的氨基间的斥力，形成壳聚糖链间的强相互作用^[20-23]。它可以提高脂肪干细胞条件培养基及其中的生物活性物质的黏附性，并延长伤口附近的细胞因子的释放保留时间^[24-25]，而且制备简便。

烧烫伤的伤口愈合是一个复杂的生物过程，基本包括3个不同且重叠的阶段：炎症，细胞增殖和重塑^[26-27]。急性炎症阶段一般发生在烧烫伤后的第1天。烧伤引起严重的局部和全身炎症反应，导致多种炎症递质的产生，如干扰素γ，肿瘤坏死因子α、白细胞介素10、白细胞介素6。早期的炎症对于清除创口微生物感染是有利的，但到了增殖和重塑期却会造成修复的延迟和瘢痕组织的过分增殖^[28-30]。脂肪干细胞能分泌一些关键的细胞因子和生长因子，有助于调节炎症和减少细胞死亡，脂肪干细胞产生免疫抑制因子，抑制免疫细胞的增殖，如减少Th0细胞分化为Th1细胞，抑制NKT细胞的活性，减少急性炎症动物模型血清中肿瘤坏死因子α，干扰素γ和白细胞介素4水平^[31-33]。脂肪干细胞分泌的HLA-G和PGE2参与机体的免疫调控过程^[34-37]，水凝胶中的透明质酸也起到了保水和消炎的作用^[38]。实验中炎症浸润的结果表明，脂肪干细胞条件培养基水凝胶比新鲜培养基水凝胶更能限制炎症的扩散。然而，脂肪干细胞条件培养基水凝胶组中炎症细胞密度明显高于新鲜培养基水凝胶组。作者分析认为，中性粒细胞的趋化能力在烧烫伤组织中，特别是在深部烧烫伤组织中明显减弱，从而导致有限的免疫细胞迁移到损伤组织局部^[39]，而脂肪干细胞条件培养基水凝胶可能帮助炎性细胞在局部浸润，同时也能防止过度的炎症反应影响周围组织。

烫伤后创面的血管微循环的建立形成，关系到损伤组织能否得到充足的营养和氧。充足的营养物质和氧，有助于创面快速愈合^[40]。3 d至2周后第二阶段的伤口修复中细胞增殖并生成新的血管，替换受损或坏死的组织。实验发现在第14天，无论是血管密度和成纤维细胞的密度，或是肉芽组织的厚度，在脂肪干细胞条件培养基水凝胶组都显著高于新鲜培养基水凝胶组。这表明脂肪干细胞条件培养基水凝胶能促进肉芽组织的形成。脂肪干细胞条件培养基包含许多已知的递质从而影响创伤修复和微血管重建过程，脂肪干细胞能够分泌促血管生成因子包括血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和肝细胞生长因子等^[41]。通过脂肪间充质干细胞释放的这些因子可以促进微血管内皮细胞的增殖，保持血管的稳定性，从而构成一个长期有效的功能性血管网络^[42]。

总的来说，脂肪干细胞条件培养基水凝胶能促进小鼠皮肤伤口愈合和提高再生皮肤的质量。这可能得益于脂肪干细胞分泌物对炎症进程的抑制，从而保持组织紧凑并促进再上皮化过程，其中促血管生成因子能够促进富含血管的肉芽组织的形成，减轻纤维化或抑制瘢痕组织的形成，从而提高创面愈合率，缩短了愈合时间并提高了愈合质量。虽然小鼠皮肤的愈合特点与人类不尽相同，但是目前很大部分实验使用的是小鼠伤口模型，具有一定的参考意义，为进一步的研究提供了广阔的思路和数据的支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脂肪间充质干细胞条件培养基制备温敏凝胶外用治疗皮肤烫伤

Therapeutic effect of adipose derived mesenchymal stem cell conditioned medium thermosensitive hydrogel on skin scald

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[2]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[3]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[4]	文科, 卢彦青, 侯楠, 马瑞娜, 崔鹏程, 吕蝶, 徐小丽. 生物材料与组织工程技术在鼓膜缺损重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1620-1624.
[5]	宋慧芳, 谈佳音, 康毅, 李斌, 毕志斐, 龙女, 夏仲年, 郭蕊. 低氧预处理增强老年人骨髓间充质干细胞条件培养基对H9C2细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 1-6.
[6]	黄涛, 程志坚, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 翟文静, 周永新. miR-146a调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 70-75.
[7]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[8]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[9]	杨振, 李浩, 付力伟, 高仓健, 姜双鹏, 王福鑫, 苑志国, 孙志强, 查康康, 田广招, 曹福洋, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 3D生物打印负载转化生长因子β3的软骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5445-5452.
[10]	李辰凯, 秦文, 刘纯, 陈文扬, 赵红斌. 3D电喷印法制备凹凸棒石/聚己内酯支架及体外成骨诱导性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5459-5464.
[11]	张峰. 聚醚醚酮和钛网材料修补颅骨缺损远期效果及不良事件的差异：前瞻性、单中心、非随机对照、2年随访临床试验方案[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5501-5505.
[12]	廖思达, 孟昊业, 李俊康, 徐亦驰, 李获, 田萧羽, 冯勇, 汪爱媛, 彭江. 电喷雾法制备海藻酸盐-明胶-脂肪干细胞微球及其修复关节软骨损伤的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4473-4479.
[13]	彭一帆, 王翀, 山院飞, 芦文丽. 可吸收胶原蛋白线用于Ⅰ，Ⅱ类手术切口缝合效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(28): 4587-4592.
[14]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[15]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.