改良型富血小板纤维蛋白在兔颅骨诱导成骨中的组织学观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.14.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (14): 2208-2214.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.14.013

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改良型富血小板纤维蛋白在兔颅骨诱导成骨中的组织学观察

焦志立^1，2，谢晓玲²，付冬梅³，赵峰²，孙勇^1，2

¹西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；²解放军成都军区机关医院•成都军区口腔种植与修复临床医学专科中心，四川省成都市 610041；³资阳市雁江区人民医院口腔科，四川省资阳市 641300

收稿日期:2016-12-30 出版日期:2017-05-18 发布日期:2017-06-10
通讯作者: 孙勇，教授，西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；解放军成都军区机关医院?成都军区口腔种植与修复临床医学专科中心，四川省成都市 610041
作者简介:焦志立，女，1990年生，四川省都江堰市人，汉族，西南医科大学口腔医学院在读硕士，医师，主要从事富血小板纤维蛋白、种植义齿、软组织、骨增量的研究。
基金资助:
全军“十二五”科研面上课题(CWS11J024)

Histological observation on rabbit skull osteoinduction by advanced platelet-rich fibrin

Jiao Zhi-li ^{1, 2,} Xie Xiao-ling ², Fu Dong-mei ³, Zhao Feng², Sun Yong ^{1, 2}

¹ School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Chengdu Military Authorities Hospital of PLA & Oral Implantatory and Prosthodontics Center of Chengdu Military Region, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ³Department of Stomatology, People’s Hospital of Yanjiang District, Ziyang 641300, Sichuan Province, China

Received:2016-12-30 Online:2017-05-18 Published:2017-06-10
Contact: Sun Yong, Professor, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Chengdu Military Authorities Hospital of PLA & Oral Implantatory and Prosthodontics Center of Chengdu Military Region, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Jiao Zhi-li, Studying for master’s degree, Physician, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Chengdu Military Authorities Hospital of PLA & Oral Implantatory and Prosthodontics Center of Chengdu Military Region, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the General Twelfth Five-Year Research Project of Chinese PLA, No. CWS11J024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
改良型富血小板纤维蛋白：是一种在富血小板纤维蛋白基础上进行改进的自体来源血液材料，其仍使用富血小板纤维蛋白离心机，通过调整转速及时间来获得不同的细胞分布和更多的生长因子，以及更佳的软硬组织愈合效果，目前国内外对其研究报道较少。
PRF：即富血小板纤维蛋白，是platelet-rich fibrin的简写。在2001年由法国科学家Choukroun等人发现，是继富血小板血浆后第二代血小板浓缩制品，被定义为一个自体的白细胞和富血小板纤维生物材料。

背景：前期实验验证了富血小板纤维蛋白具有成骨的效果，并且选定了人与兔改良型富血小板纤维蛋白膜结构最相似时的转速和离心时间。
目的：观察改良型富血小板纤维蛋白在诱导成骨中的组织学变化。
方法：随机将30只日本大耳兔分为2组各15只，在兔颅顶骨制造圆形全层骨缺损来构建动物模型，改良型富血小板纤维蛋白组填入改良型富血小板纤维蛋白膜，空白组不填任何材料，于建模后当天、2周、4周、8周、12周处死动物，大体观察造模区成骨情况，苏木精-伊红染色、masson三色染色、免疫组织化学观察造模区组织学变化。
结果与结论：①空白组骨缺损在实验结束时不能自行愈合；②建模后当天、4周、8周、12周2组标本的大体观察、组织学检查，均显示改良型富血小板纤维蛋白组的成骨速度、量及成熟度，皆明显优于空白组，差异具有统计学意义；③结果说明，制备的骨缺损实验期内不能自行愈合，符合临界性骨缺损的标准；改良型富血小板纤维蛋白能促进新骨形成，随着时间的延长，成骨数量更多，质量更佳；改良型富血小板纤维蛋白促使破骨细胞与成骨细胞协同作用，促进新骨生成。

ORCID: 0000-0001-5176-8325(焦志立)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 改良型富血小板纤维蛋白, 临界性骨缺损, 组织工程, 骨再生, RANKL, 骨保护素, 骨诱导, 骨替代材料

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have proved platelet-rich fibrin (PRF) with osteoinduction ability, and the centrifugal speed and time to prepare rabbit advanced PRF (A-PRF) with the most similar structure to that of human PRF have been determined.
OBJECTIVE: To observe the histological changes during A-PRF-induced osteogenesis.
METHODS: Thirty Japanese white rabbits were randomly divided into A-PRF and blank control groups (n=15 per group). The full-thickness defect models were established on the rabbit parietal bone, followed by implanted with A-PRF or nothing, respectively. The model rabbits were killed immediately, at 2, 4, 8 and 12 weeks after modeling, to grossly observe the bone formation, and the histological changes in the defect region were observed through hematoxylin-eosin staining, Masson staining and immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: Unhealed defects were observed in the blank control group. Gross and histological observations showed that the speed, amount and maturity of bone formation in the A-PRF group were significantly better than those in the blank control group immediately, 4, 8 and 12 weeks after modeling (P < 0.05). Our findings suggest that the rabbit skull bone defect is successfully established. A-PRF can induce osteogenesis, and more mature newly born bones appear with time. Additionally, osteoclasts can act with osteoblasts synergically under the A-PRF induction to promote the bone formation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bicompatible Materials, Bone Regeneration, Osteoprotegerin, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

焦志立，谢晓玲，付冬梅，赵峰，孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白在兔颅骨诱导成骨中的组织学观察[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(14): 2208-2214.

Jiao Zhi-li, Xie Xiao-ling, Fu Dong-mei, Zhao Feng, Sun Yong. Histological observation on rabbit skull osteoinduction by advanced platelet-rich fibrin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(14): 2208-2214.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 30只实验动物在实验周期内无感染无硬脑膜损伤无死亡，全部进入结果分析。

2.2 建模后动物情况建模后动物生命体征平稳，2-4 h后麻醉苏醒，予以常规进饮进食，饮食及行为行动无异常，建模后1周内创口恢复情况良好，无感染，毛发生长正常。

2.3 大体观察结果改良型富血小板纤维蛋白膜2周开始逐渐与周围组织粘连，4周时开始逐渐液化，量逐渐减少，至8周时难以分辨；4周时开始出现少量类骨膜结构包裹，探诊质地随时间增加韧性增大，并与周围组织逐渐粘连难以分离、去除；骨缺损区边界4周时开始模糊，可见缺损区边缘开始有骨质形成，凹陷逐渐不明显，8周时缺损边缘新骨与周围旧骨基本齐平且表面光滑，移行线隐约可见，12周时新旧骨间移行线不清晰，缺损中心浅凹仍存。空白组：骨缺损区边界一直清晰可辨，凹陷明显，4周时可见类骨膜结构长入，但易与骨面分离，下方脑膜清晰可见，8周时可见软组织长入缺损区，12周实验结束时，可探及硬脑膜及脑组织，骨缺损仍清晰可见，未见明显成骨迹象。

2.4 组织学检查结果

2.4.1 苏木精-伊红染色结果见图1。

改良型富血小板纤维蛋白组：骨组织切片苏木精-伊红染色光镜观察，改良型富血小板纤维蛋白组在建模后当日可见改良型富血小板纤维蛋白膜，富含排列整齐，呈带状规律分布的红细胞、白细胞。建模后2周，术区可见类骨质形成，其周围散在分布部分成骨细胞；4周时出现细小新生骨小梁、骨细胞、幼稚软骨细胞；8周时可见新生骨组织，骨髓和骨髓腔出现，骨进一步成熟，骨小梁变粗大，并出现软骨化骨现象，成熟骨小梁向板层骨转化；建模后12周时，板层骨明显，新生骨小梁内含丰富骨细胞，哈弗氏系统形成。

对照组：建模后当日缺损区未见任何物质；建模后4周内，只见纤维结缔组织生成，未见新骨形成；建模后8周缺损区可见少量游离骨细胞，未见明显新骨形成；建模后12周见边缘有成骨细胞排列，细小骨小梁，未见骨髓腔和骨髓，有少量新骨形成。

2.4.2 Masson三色染色结果图2显示两组均呈现红蓝相间染色结果，但术后当天及术后2，4，8，12周，改良型富血小板纤维蛋白组红染区域大小皆明显大于空白组。

2.4.3 免疫组织化学分析骨保护素免疫组织化学分析见图3；RANKL免疫组织化学分析见图4。

检测结果：阳性表达为浅黄色或棕黄色，位于细胞质中；阴性表达为蓝色，位于细胞核。骨保护素和RANKL的统计学分析，见表1。

因建模后当天、2周、4周空白组基本无新骨形成，成骨现象不活跃，而建模后8周、12周时空白组新骨开始形成。2组的RANKL表达在建模后8，12周对比，差异无显著性意义(P > 0.05)；2组的骨保护素表达在建模后8，12周对比，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9至12月在四川省成都达硕实验动物中心、四川省里来生物科技有限公司完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性日本大耳朵兔30只，5月龄，2.1-2.5 kg，动物使用许可证号：SYXK(川)2014-189，由四川省成都达硕实验动物中心提供饲养及管理，自然昼夜光照条件下，单笼、全价颗粒饲料喂养，术前1周行适应性喂养，以确认动物健康。所有实验中对动物的处置均符合实验动物伦理学要求。

1.3.2 主要仪器设备世新打磨机(strong 90，碧豪斯，中国广州)，种植机(Surgic 4 XT Plus，NSK，日本)，离心机(TDZ4-WS台式低速离心机，湘仪离心机，中国湖南)，Φ5.5/5.9 mm环形中空取骨钻(青岛日和口腔医疗器械有限公司，中国山东)，富血小板纤维蛋白工具盒(Process，Nice，法国)，苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色相关试剂(由里来生物科技有限公司提供)，图像分析系统(Image-Pro Plus 6.0，美国Media Cybernetics公司)，数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 改良型富血小板纤维蛋白制备及兔颅骨洞穿型全层骨缺损模型建立及分组兔术前禁饮禁食12 h，采血处剃毛消毒，一次性蝶形采血针和改良型富血小板纤维蛋白真空无菌采血管于兔耳中动脉处采血，4 mL/试管，2管/兔，立即以2 000 r/min，24 min离心(前期实验中证实以 2 000 r/min，24 min为标准制备的兔改良型富血小板纤维蛋白膜的生长因子分布、空间结构都与人改良型富血小板纤维蛋白膜最接近^[16])。离心完成后，25 ℃室温下静置 5 min，试管分为顶部无细胞血浆层，中部纤维蛋白凝块，底部红细胞层。以有齿镊取出中部棕黄色凝块置于工具盒内，剥离器去除多余的红细胞层(保留与中部改良型富血小板纤维蛋白接口处的红细胞底层)，自然压制一两分钟以排出部分血清，得到改良型富血小板纤维蛋白膜备用。

按照1 mL/kg的用量以3%戊巴比妥溶液经腹腔注射麻醉实验动物。参考何通文等^[17]建模方式，以Φ5.5/5.9 mm环形中空取骨钻，转速1 000 r/min在颅中缝两侧，对称性制备直径为6 mm洞穿型全层骨缺损各一个，两洞中心点相距约10 mm，备洞过程中生理盐水术区降温，以免骨灼伤。触及落空感时立即停止备洞，以挖匙挖去取骨区域，避免损伤硬脑膜，引起颅内感染。将30只骨缺损建模完成的实验兔随机分为改良型富血小板纤维蛋白组及空白组，改良型富血小板纤维蛋白组缺损处均填入自体改良型富血小板纤维蛋白膜，牙周探针试探确保膜就位下，止血后对位分层缝合肌肉及皮肤。空白组制备骨缺损后，均不填入任何材料，止血后对位分层缝合肌肉及皮肤。建模后连续3 d注射青霉素钠，80万U/次，1次/d，并观察术后动物饮食行为有无异常，建模后1周内密切观察创口有无感染并积极对症处理。

1.4.2 取材根据实验设计的时间节点(建模后当天、2周、4周、8周、12周)，3%戊巴比妥钠麻醉下空气栓塞处死，取下兔颅顶骨包括术区在内的25 mm×25 mm范围，制取不同标本。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体观察观察计划时间节点时动物颅顶术区创口愈合情况，有无红肿、感染，处死后观察实验组与对照组骨缺损处植入材料的改变情况以及成骨情况。

1.5.2 苏木精-伊红染色在计划时间节点处死动物后常规制作病理切片，苏木精-伊红染色后，采用BA400Digital数码三目摄像显微系统，图像采集在100倍光镜下进行。

1.5.3 Masson三色染色在计划时间节点处死动物后常规制作病理切片，Masson三色染色后，采用BA200Digital数码三目显微摄像系统，于40倍下大体观察后，再选取1个区域在100倍下采集图像。

1.5.4 核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)及骨保护素免疫组织化学染色平均吸光度在计划时间节点处死动物后制作术区病理切片，并进行免疫组织化学染色，用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集所有图像的平均吸光度，统计分析RANKL和骨保护素的表达情况。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0 统计分析软件对数据进行单因素方差分析，数据以x(_)±s表示，以P < 0.05差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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