亚低温干预下神经干细胞的RhoA/ROCK通路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.021

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2094-2099.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.021

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

亚低温干预下神经干细胞的RhoA/ROCK通路

李超¹，付红杰²，张建军²，王东²

¹天津医科大学第四中心临床学院，天津市 300041；²天津市第四中心医院，天津市 300143

修回日期:2017-03-13 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 王东，硕士，主任医师，天津市第四中心医院，天津市 300143
作者简介:李超，男，1990年生，山东省济宁市梁山县人，汉族，2015年泰山医学院毕业，硕士，医师，主要从事神经外科研究。
基金资助:
天津市卫计委科技基金项目(2015KR20)；天津第四中心医院硕博基金支持

RhoA/ROCK pathway of neural stem cells under mild hypothermia

Li Chao¹, Fu Hong-jie², Zhang Jian-jun², Wang Dong²

¹The Fourth Clinical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300041, China;²Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300143, China

Revised:2017-03-13 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Wang Dong, Master, Chief physician, Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300143, China
About author:Li Chao, Master, Physician, The Fourth Clinical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300041, China
Supported by:
the Postgraduate Fund of the Tianjin Fourth Central Hospital; the Scientific Foundation of the Health and Family Plan Committee of Tianjin, No. 2015KR20

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
RhoA/ROCK信号通路：是中枢神经系统中普遍存在的一条通路，是介导抑制性信号阻断中枢神经细胞再生的重要途径。中枢神经损伤后再生困难的重要原因是其周围环境中存在强烈抑制再生的物质，并通过该途径介导神经再生障碍。
亚低温治疗：是一种以物理方法将患者的体温降低到预期水平而达到治疗疾病目的的方法。亚低温能有效减轻继发性脑和脊髓损伤，对中枢神经损伤有确切的保护作用；同时亚低温改善脊髓损伤区域的微环境，有利于移植细胞的增殖、活化、生长。

摘要
背景：亚低温能有效减轻继发性脑和脊髓损伤，对中枢神经损伤有确切的保护作用；同时亚低温改善脊髓损伤区域的微环境，有利于移植细胞的增殖、活化、生长。
目的：探讨神经干细胞微环境变化与RhoA/ROCK信号通路的关系。
方法：制备神经干细胞液压损伤模型，随机分为2组：常温组和亚低温组，常温组不进行任何干预，亚低温组于伤后1 h进行亚低温[(32.0±0.5) ℃]干预 4 h。RT-PCR和Western Blot检测神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR 基因和蛋白的表达，免疫荧光观察RhoA/RHOCK阳性细胞数，激光共聚焦显微镜根据荧光强度值测定神经细胞内游离Ca²⁺浓度。
结果与结论：①亚低温组神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA和蛋白的表达较常温组明显降低(P < 0.05)；②亚低温组神经干细胞内游离钙离子浓度低于常温组(P < 0.05)；③亚低温组RhoA/RHOCK阳性细胞数明显低于常温组(P < 0.05)；④结果表明，在亚低温条件下，对神经干细胞内RhoA/ROCK信号通路激活环节产生阻断作用，进而调控神经干细胞增殖、凋亡等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1718-9028(李超)

关键词: 干细胞, 移植, 亚低温, 神经干细胞, 微环境, 游离钙[Ca2+], RhoA, RHOCK, NgR

Abstract:

BACKGROUND: Mild hypothermia can effectively ease secondary brain and spinal cord injuries, which has a definite protective effect on the central nervous system. Meanwhile, mild hypothermia is conducive to the proliferation, activation and growth of transplanted cells by improving the microenvironment of the injured spinal cord.
OBJECTIVE: To investigate whether mild hypothermia intervention can regulate the proliferation and apoptosis of neural stem cells through the RhoA/ROCK pathway.
METHODS: The neural stem cell injury model was prepared and randomly divided into two groups: normothermia group and mild hypothermia group. The mild hypothermia group was treated with mild hypothermia [(32.0±0.5) ℃] for 4 hours. Expression of RhoA, RHOCK, Nogo-A and NgR in neural stem cells was detected by RT-PCR and western blot assay. RhoA/RHOCK positive cells were observed by fluorescence microscope. The intracellular Ca²⁺ concentration in neurons was measured by laser scanning confocal microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of RhoA, RHOCK, Nogo-A and NgR in neural stem cells at mRNA and protein levels was significantly lower in mild hypothermia group than in the normothermia group (P < 0.05). The intracellular Ca²⁺ concentration in the neural stem cells was lower in the mild hypothermia group than in the normothermia group (P < 0.05). The number of RhoA/RHOCK positive cells in the brain tissue of rats was significantly lower in the mild hypothermia group than in the in the mild hypothermia group (P < 0.05). To conclude, mild hypothermia regulates the proliferation and apoptosis of neural stem cells by inhibiting the RhoA/ROCK pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Hypothermia, Induced, rho-Associated Kinases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.

李超，付红杰，张建军，王东. 亚低温干预下神经干细胞的RhoA/ROCK通路[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2094-2099.

Li Chao, Fu Hong-jie, Zhang Jian-jun, Wang Dong. RhoA/ROCK pathway of neural stem cells under mild hypothermia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2094-2099.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2016年5月在天津第四中心医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康孕14-16 d Wistar大鼠1只，由天津医科大学动物实验室提供，动物质量合格证号：SCXK(津)20120028，饲养环境：室温20-22 ℃，常规饮食，自由进食及饮水。实验参照动物伦理学标准对SD大鼠进行处理，处置方法符合伦理学要求。

1.3.2 主要试剂和仪器 胰蛋白酶(美国Sigma公司)；DMEM培养基、EBM-2培养基、胎牛血清、PBS(Hyclone)；细胞培养箱(Heraeus Sepatech)；Trizol试剂盒(Invitrogen)；Fluo-3/AM(美国Bio-Rad公司)；超净工作台(艺斯高上海贸易有限公司)；Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜(美国Meridian公司)；台式离心机(德国SIGMA有限公司)；-70 ℃冰箱(日本SANYO公司)；兔抗鼠RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体(艾康生物技术(杭州)有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的培养 取孕14-16 d的Wistar大鼠1只，引颈处死，体积分数为75%乙醇浸泡消毒，打开腹腔取出胎鼠，然后分离出胎鼠大脑，浸泡在DMEM/F12培养液中，去除脑膜和血管，用吸管反复吹打成细胞悬液，过100目孔筛网，过滤的悬液接种于培养瓶中，加入表皮生长因子(10 mg/L)、碱性成纤维细胞生长因子(10 mg/L)、N2添加剂，37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，3 d后换液。

1.4.2 神经干细胞的鉴定 在原代培养到第3天时，对培养细胞进行nestin免疫荧光染色鉴定。吸取拟鉴定的细胞，接种于放有多聚赖氨酸涂层盖玻片的3 cm培养皿中，加入含体积分数为5%胎牛血清的神经干细胞培养基，培养1 h后进行鉴定。具体染色过程如下：缓冲液清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，然后用缓冲液清洗3遍，加入0.2%的Triton-100作用15 min，再用缓冲液洗3次，正常血清封闭20 min，加入1∶1 000稀释的nestin一抗，37 ℃下反应1 h，然后4 ℃过夜，缓冲液洗3次后，加入1∶100稀释的荧光二抗，37 ℃下反应1 h，缓冲液洗3遍，甘油封固。在倒置相差显微镜下，进行荧光激发，观察并照相记录结果。

1.4.3 神经干细胞的标记 将上述制备的神经干细胞悬液，用5 mL无菌DMEM培养液洗涤1次，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL PBS，以微量加样器取16 μL PKH-26放入一装有2 mL DiluentC的离心管中，将神经干细胞和PBS混悬液加入已装有PKH-26和DiluentC的离心管中，孵育2-5 min，定时轻轻摇动离心管使之混合均匀，加入4 mL胎牛血清孵育1 min，再加入8 mL DMEM，1 500 r/min离心10 min，弃上清，细胞团以DMEM洗涤3次, 完成PKH26的染色过程。经锥虫蓝实验检测存活率> 90%，提示标记后细胞存活。

1.4.4 神经干细胞液压冲击伤模型制备及实验分组 将原代培养的神经干细胞制备成液压冲击伤模型。自行设计液压冲击装置，由压力表、50 mL注射器、三通管、摆锤(4.8 kg)，打击架、培养瓶组成。将培养细胞的培养瓶中充满培养液，通过三通管连接于液压装置中的压力表和注射器(内含25 mL培养液)的一端。摆锤连接于打击架上，从一定高度落下，打击注射器的另一端活塞，其产生的压力，经注射器液体传递培养瓶中培养细胞层，对细胞造成损伤，制备大鼠神经干细胞液压损伤模型。随机分为2组，即常温组和亚低温干预组。常温组神经干细胞常温放置，亚低温干预组于伤后1 h进行亚低温[(32.0± 0.5) ℃]干预4 h。

1.4.5 神经干细胞内游离Ca²⁺浓度的测定 亚低温干预 4 h后，在盖玻片上培养的神经干细胞经PBS冲洗3次，于37 ℃条件下用终浓度为10 μmol/L的Fluo-3/AM负载45 min，盖玻片倒置密封小室上，用Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜488 nm氢激光激发而产生荧光，测定其荧光强度。[Ca²⁺]_i=Kd[(F-F_min)/ (F_max-F)]，式中Kd为400 nmol/L；F为测量的相对荧光值；F_max为加入10 μmol/L高钙液后所得最大荧光值；F_min为加入10 μmol/L无钙液后所得最小荧光值。

1.4.6 RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA的表达 亚低温干预4 h后，采用RT-PCR法检测神经干细胞中RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA相对表达水平。通过Oligo 7.36 Demo软件设计引物，RhoA上游引物：5’-AAC CAC TAT GAC AGC ACC ACG-3’，下游引物：5’-AGA GAA GGA AGC CAG TGG AGA-3’，扩增片段长度297 bp；RHOCK上游引物：5’-CCT CAA ATC TCA CAG CAG-3’；下游引物：5’-GCT GTC TAA TGG GAA-3’，扩增片段长度220 bp；Nogo-A上游引物：5’-GGC GCT CAA CCG GCA ACT CA-3’，下游引物：5’-CTC AGG GAC AGG GAA GAG-3’，扩增片段长度256 bp；NgR上游引物：5’-GAA CGC GAA GAA AAG TGA CC-3’，下游引物：5’-AGC CCA TTT CAG GGT AAT CC-3’，扩增片段长度156 bp；内参GAPDH上游引物：5’-GCG CCT GGT CAC CAG GGC TGC TT-3’，下游引物：5’-TGC CGA AGT GGT CGT GGA TGA CCT-3’，扩增片段长度465 bp。采用2^-^??Ct分析法，以GAPDH基因作为内参，测定神经干细胞中RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA相对表达水平。

1.4.7 RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR 蛋白的表达 将上述反转录PCR的提取物，在4 ℃条件下，1 500 r/min离心30 min，取上清为粗体蛋白，Bradford法测定总蛋白浓度。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗体RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR(1∶800)4 ℃过夜；TBST洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗体(1∶700)37 ℃摇床孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×4次，TBST洗膜10 min后DAB显色，Quantity one图像分析软件分析RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白表达量。

1.4.8 免疫荧光检测RhoA/RHOCK阳性细胞数 亚低温干预4 h后，将获得的各组神经干细胞在玻璃盖玻片上用甲醇-20 ℃固定10 min，然后用兔抗大鼠RhoA、RHOCK抗体(1∶200) 4 ℃孵育16 h，PBS冲洗30 min，FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶1 000)室温孵育1 h，再用PBS冲洗30 min，免疫荧光检测RhoA/RHOCK阳性细胞数。

1.5 主要观察指标 ①RT-PCR和Western Blot检测神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR 基因和蛋白的表达；②神经干细胞内[Ca²⁺]_i浓度；③免疫荧光检测RhoA/RHOCK阳性细胞数。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件，组间比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤后神经不能再生、修复，是导致患者死亡率、致残率增高的根本原因，一直是神经外科亟待解决的热门课题之一^[18-21]。干细胞移植治疗脊髓损伤成为临床研究热点。神经干细胞分布广泛，不局限于它们的来源区域，具有很强的可塑性^[22-29]。神经干细胞的分化主要受基因调控，基因表达的方式受其自身固有分子程序的调控和周围微环境的影响。微环境的影响在其中占重要地位。神经干细胞移植于脊髓损伤区后，损伤区的微环境中产生多种重要的环境因子，异常细胞信号通路转导，影响神经干细胞的存活、增殖、分化，甚至导致细胞的凋亡^[30-37]。环境因子包括神经细胞凋亡基因、髓鞘轴突再生抑制因子、神经生长因子等。神经细胞髓鞘再生抑制因子在脊髓损伤过程中由少突胶质细胞受损后释放，具有潜在包括细胞黏附、迁移和轴突生长等抑制作用，这些抑制因子通过调控胞内蛋白RhoA 及其下游效应分子Rho相关激酶激活RhoA/ ROCK信号通路，传递抑制信号，抑制移植神经干细胞的增殖分化^[38-39]。临床研究表明亚低温可以改善脊髓损伤区域的微环境，有利于移植细胞的增殖、分化^[40-46]。亚低温抑制脊髓损伤后炎性因子的释放，抑制脊髓损伤区凋亡基因、轴突生长抑制相关基因等表达，在RhoA/ROCK通路激活的环节上，将产生阻断或部分阻断的作用，干扰其形成的恶性循环，封闭RhoA细胞内抑制信号的传导。RhoA/ ROCK通路是调节脊髓损后神经轴突再生的重要信号通路，大鼠脊髓损伤后，脊髓损伤区产生的轴突抑制因子，导致RhoA/ROCK通路异常表达，RhoA激活，抑制信息传导等一系列反应，最终使脊髓神经组织生长锥塌陷，抑制轴突再生^[47-57]。此次研究主要是明确亚低温对RhoA/ ROCK信号通路的影响。在亚低温干预条件下，检测液压冲击伤神经干细胞内与RhoA/ROCK信号通路相关RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白的表达，测定细胞内游离钙Ca²⁺浓度变化，确定亚低温干预对体外损伤神经干细胞RhoA/ROCK通路的影响。

亚低温干预4 h，亚低温组神经干细胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA和蛋白的表达较常温组明显降低，亚低温组细胞内游离钙离子浓度(236.6± 21.4) nmol/L略低于常温组(286.6±34.7) nmol/L，荧光显微镜观察亚低温组RhoA/RHOCK阳性细胞数(11.25±1.27)个/高倍视野明显低于常温组(31.04±4.62)个/高倍视野，综合以上检测结果，说明在亚低温条件下，对RhoA/ROCK信号通路激活环节产生阻断作用，封闭细胞内抑制信号的传导。

综上所述，亚低温环境下可以阻断RhoA/ROCK信号通路，为今后脊髓损伤的亚低温联合干细胞移植及基因治疗提供更多切入点。

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亚低温干预下神经干细胞的RhoA/ROCK通路

RhoA/ROCK pathway of neural stem cells under mild hypothermia

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