不同代次人脐带间充质干细胞的生物学特性及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (13): 2015-2022.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.009

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

不同代次人脐带间充质干细胞的生物学特性及分化

刘雨思^1，2，王凤昌¹，夏海雄^1，2，许键炜¹，杨燕¹，崔冬冰¹，王黎龙³，何志旭^1，2，3，舒莉萍^1，2，4

贵州医科大学，¹组织工程与干细胞实验中心，²基础医学院免疫学教研室，³儿童医学中心，4实验动物中心，贵州省贵阳市 550004

修回日期:2016-12-23 出版日期:2017-05-08 发布日期:2017-06-09
通讯作者: 舒莉萍，博士，副教授，贵州省医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004；何志旭，博士后，教授, 贵州省医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004
作者简介:刘雨思，女，1991年生，陕西省西安市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事干细胞基础与临床方面的研究。
基金资助:
贵州省“125 计划”重大科技专项(黔教合重大专项字[2013]020)资助

Biological features and differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages

Liu Yu-si^{1, 2}, Wang Feng-chang¹, Xia Hai-xiong^{1, 2}, Xu Jian-wei¹, Yang Yan¹, Cui Dong-bing¹, Wang Li-long³, He Zhi-xu^{1, 2, 3}, Shu Li-ping^{1, 2, 4}

¹Central for Tissue Engineering and Stem Cell Experiments, ²Department of Immunology, Basic Medical College, ³Medical Center for Children, ⁴Central for Experimental Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Revised:2016-12-23 Online:2017-05-08 Published:2017-06-09
Contact: Shu Li-ping, M.D., Associate professor, Central for Tissue Engineering and Stem Cell Experiments, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; He Zhi-xu, M.D., Professor, Central for Tissue Engineering and Stem Cell Experiments, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Liu Yu-si, Studying for master’s degree, Central for Tissue Engineering and Stem Cell Experiments, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Department of Immunology, Basic Medical College, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the Major Special Scientific Project-“125 Plan” of Guizhou Province, No. [2013]020

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脐带来源间充质干细胞的特性：免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不易触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；干细胞分离较为简单，细胞纯度高，且不易造成病原微生物和肿瘤细胞的污染；扩增培养时，能够建立统一的体系，便于质控；可作为种子细胞冷冻，并能够多次使用，冷冻复苏后细胞损失小；潜伏性病毒和病原微生物感染及传播的可能性较低；采集时不会对产妇及新生儿造成任何危害及损伤；易于采集、保存和运输，可避免伦理学争议；脐带来源丰富，细胞含量高，可用此建立自体干细胞库以供今后使用。

摘要
背景：人脐带间充质干细胞作为组织工程及再生医学领域的新兴种子细胞，其应用价值有赖于能否在长期体外传代扩增后仍保持稳定生物学特性和多向分化能力，需要进一步的实验研究。
目的：研究不同培养代次人脐带间充质干细胞重要生物学属性的差异。
方法：采用组织块法分离培养人脐带间充质干细胞，分别采用细胞计数法与MTT法检测第3-6代细胞增殖活性；流式细胞仪检测第1-9代细胞表面标志物；细胞染色法分析第3-6代细胞核型。取第3代人脐带间充质干细胞，检测其分化为神经细胞、成骨细胞及肝样细胞的能力。
结果与结论：①细胞计数法与MTT方法检测结果一致，第3-6代脐带间充质干细胞的增殖曲线均呈“S”型，在一二天时处于缓慢增长期，2-4 d时处于对数增长期，四五天时处于平台期，五六天时处于衰退期；②第1-9代脐带间充质干细胞表面高表达CD90、CD44、CD73，不或低表达CD11b、CD18、CD34、CD43及HLA-DR；③第3-6代脐带间充质干细胞核型均为正常人体核型；④脐带间充质干细胞可分化为神经细胞、成骨细胞及肝样细胞；⑤结果表明，人脐带间充质干细胞具有高度增殖活性和多向分化特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2817-3061(舒莉萍)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带, 间充质干细胞, 生物学特性, 组织块贴壁培养, 增殖, 表型, 染色体制备, 诱导分化, 三胚层

Abstract:

BACKGROUND: As a kind of emerging seed cells in the field of tissue engineering and regenerative medicine,
human umbilical cord mesenchymal stem cells are applied depending on whether it can remain stable biological characteristics and multi-directional differentiation capacity after long-term passage in vitro, which needs further experimental studies.
OBJECTIVE: To investigate differences of vital biological features of human umbilical cord mesenchymal stem cells over different passages.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells taken from Wharton's jelly were isolated and cultured using tissue explant method. The proliferation abilities of cells cultured for 3-6 generations were detected using both cell counting method and MTT method. Expressions of surface markers of the cells after expanding over nine passages were comprehensively determined by flow cytometry. Karyotype analysis of cells cultured for 3-6 generations was assessed using cell staining method. The 3rd generation of cells were used to detect differentiation abilities into nerve cells, osteoblasts and hepatocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: Proliferation curve of cultured cells was “S” shape, and it was in the slow growth phase within 1-2 days, in the increased logarithmic growth phase within 2-4 days, in the plateau growth phase within 4-5 days, and in the declining growth phase within 5-6 days. Furthermore, two methods of testing results were consistent. Expression levels of cell surface markers CD90, CD44, CD73 were all above 90% while the expression levels of CD11b, CD18, CD34, CD43 and HLA-DR were very low at passages 1-9. No abnormality in cell karyotype was found in cells at passages 3-6. Human umbilical cord mesenchymal stem cells could differentiate into nerve cells, osteoblasts and hepatocytes. All theses experimental findings show that the human umbilical cord mesenchymal stem cells have high proliferation activity and multi-directional differentiation properties.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘雨思，王凤昌，夏海雄，许键炜，杨燕，崔冬冰，王黎龙，何志旭，舒莉萍. 不同代次人脐带间充质干细胞的生物学特性及分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(13): 2015-2022.

Liu Yu-si, Wang Feng-chang, Xia Hai-xiong, Xu Jian-wei, Yang Yan, Cui Dong-bing, Wang Li-long, He Zhi-xu, Shu Li-ping. Biological features and differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(13): 2015-2022.

图/表（结果） 3

2.1 hUCMSCs的形态学鉴定 采用组织块法分离培养5-7 d后，可见贴壁细胞从组织边缘爬出，原代细胞(P0)逐渐融合成片状生长，形态均一，由于组织块的存在不能完全贴满培养瓶，镜下观察细胞类似于成纤维细胞，成长梭形流水状生长(图1)，细胞增殖能力强，可稳定传至9代，P1-P9代细胞细胞形态规整，成长梭形流水状贴壁生长，细胞形态良好，并随着细胞的传代，细胞形态未发生变化。

2.2 hUCMSCs的增殖活性 采用两种不同方法对hUCMSCs进行增殖学实验，即细胞计数法和MTT法。图2A为脐带间充质干细胞细胞计数法的增殖曲线，根据增殖曲线可看出，细胞在一二天时处于缓慢增长期，2-4 d时处于对数增长期，四五天时处于平台期，五六天时处于衰退期，不同代次细胞生长曲线相似。图2B示脐带间充质干细胞MTT法增殖曲线，细胞在一二天时处于缓慢增长期，2-4 d时处于对数增长期，四五天时处于平台期，五六天时处于衰退期，不同代次细胞生长曲线相似，其细胞增殖与细胞计数法基本相似，细胞增殖曲线呈“S”型。

2.3 hUCMSCs细胞表型分析 流式细胞仪检测结果显示，hUCMSCs表达间充质干细胞表面标记CD90、CD44、CD73，且表达量均在90%以上；不表达或低表达CD11b、CD19、CD34、CD43及HLA-DR，其表达量呈现逐渐减低后逐渐增加的趋势，体外长期传代后，hUCMSCs 表面标记表达未发生显著改变(图3，表1)。

2.4 hUCMSCs核型分析 为研究hUCMSCs随着传代代数的增加染色体是否发生畸变，采用染色体G显带法对第3-6代细胞进行了染色体核型分析(图4)。根据染色体的核型，可以看出核型为(46，XY)，并随着细胞代数的增加并未发现染色体的缺失、重复、倒位、异位、增多等畸形的改变，其核型均为正常人体的核型图。

2.5 hUCMSCs多向分化功能研究

2.5.1 hUCMSCs神经诱导分化 第3代hHCMSCs神经预诱导24 h后，可见少量细胞略有变化，形态变为不规则。正式诱导1 h后部分细胞胞质向核回缩，胞体变小变短，呈不规则形或圆形，折光性强。诱导4 h后细胞胞体伸出长突起，有些可形成双极或多极突起，细胞突起向周围呈放射状，或相互连结形成网状，出现类似神经细胞的形态改变。经免疫组织化学检测胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白的表达，hHCMSCs细胞核着色，阳性表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白，细胞核呈棕褐色(图5)。

2.5.2 hUCMSCs成骨诱导分化 第3代hHCMSCs成骨诱导14 d，细胞聚集汇合且呈多层重叠生长，形成圆形钙化结节沉积，周围折光性增强，茜素红染色着色呈红色为阳性表达(图6)。

2.5.3 hUCMSCs肝样诱导分化 第3代hHCMSCs肝样诱导18 d后，光镜下可见细胞折光性增强，具有较多形态改变，细胞大小不均，呈多边形，类似肝细胞的形态学特征；核大而圆，居中，胞质内颗粒丰富，经免疫组织化学检测白蛋白和角蛋白的表达，诱导组细胞细胞核着色，阳性表达白蛋白和角蛋白，细胞核呈棕褐色(图7)。

参考文献

[1] Todeschi MR,Ei Bachiy R,Capelli C,et al. Transpiantedumbi icalcordmesenchyma stem cellsmodify the in vivo microenvironmenten hancingangiogenesis and leading to boneregeneration.Stem Cells Dev.2015;24(13):1570-1581.

[2] Lindenmair A, Hatlapatka T,Kollwig G,et al. Mesenchymal stem or stromal cells from amnion and umbilical cord tissue and their potential for clinical applications.Cells.2012; 1:1061-1088.

[3] Lindenmair A,Hatlapatka T,Kollwig G,et al.Mesenchymal Stem or Stromal Cells from Amnion and Umbilical Cord Tissue and Their Potential for Clinical Applications. Cells. 2012;1(4):1061-1088.

[4] Parolini O,Alviano F,Bagnara GP,et al.Concise review: Isolation and characterization of cells from human term placenta: Outcome of the first international workshop on placenta derived stem cells.Stem Cells.2008;26:300-311.

[5] Shi Z,Zhao L,Qiu G,et al.The effect of extendedpassaging on the phenotype and osteogenic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells.Mol Cell Biochem.2015; 401 (1/2):155-164.

[6] Cheng H,Qiu L,Ma J,et al.Replicative senescence of human bone marrow and umbilical cord derived mesenchymal stem cells and their differentiation to adipocytes and osteobiasts. Mol Biol Rep.2011;38(8):5161-5168.

[7] Remya NS,Nair PD.Mechanoresponsiveness of human umbilical cord mesenchymal stem cells in in vitro chondrogenesis-A comparative study with growth factor induction. J Biomed Mater Res A.2016;104(10):2554-2566.

[8] Li S,Wang Y,Guan L,et al.Characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells during ex vivo expansion.Mol Med Rep.2015;12(3):4320-4325.

[9] 张立新,陈亚宝,叶军,等.脐带间充质干细胞染色体核型制备及安全评估[J].海南医学,2013,23(13):11-12.

[10] Bao C,Chen W,Weir MD,et al.Effects of electrospun submicron fibers in calcium phosphate cement scaffold on mechanical properties and osteogenic differentiation of umbilical cord stem cells.Acta Biomater.2011;7(11): 4037-4044.

[11] Chen E,Tang MK,Yao Y,et al.Silencing BRE Expression in Human Umbilical Cord Perivascular (HUCPV) Progenitor Cells Accelerates Osteogenic and Chondrogenic Differentiation.PLoS One.2013;8(7):e67896.

[12] Hu Y,Liang J,Cui H,et al.Wharton's jelly mesenchymal stem cells differentiate into retinal progenitor cells.Neural Regen Res.2013;8(19):1783-1792.

[13] Wang L,Ott L,Seshareddy K,et al.Musculoskeletal tissue engineering with human umbilical cord mesenchymal stromal cells.Regen Med.2011;6(1):95-109.

[14] Fu YS,Cheng YC,Lin MY,et al.Conversion of human um-bilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to do-paminergic neurons in vitro: potential therapeutic application for Parkinsonism.Stem Cells.2006;24(1):115-124.

[15] Xie L,Lin L,Tang Q,et al.Sertoli cell-mediated differentiation of male germ cell-like cells from human umbilical cord Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells in an in vitro co-culture system.Eur J Med Res.2015;20(1):9.

[16] Li WW,Wei YH,Li H,et al.Isolation and Characterization of a Novel Strain of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Umbilical Cord: Potential Application in Cell-Based Therapy. PLoS One.2013;8(8):e74478.

[17] Weinand C,Pomerantseva I,Neville CM,et al. Hydrogel-beta-TCP scaffolds and stem cells for tissue engineering bone.Bone.2006;38(4):555-563.

[18] Barberini DJ,Freitas NP,Magnoni MS,et al.Equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue and umbilical cord:immunophenotypic characterization and differentiation potential.Stem Cell Res Ther.2014;5(1):25.

[19] Hao H,Chen G,Liu J,et al.Culturing on Wharton’s jelly extract delays mesenchymal stem cell senescence through p53 and p16INK4a／pRbpathways.PLoS One.2013; 8(3):e58314.

[20] Joseph M,Das M,Kanji S,et al.Retention of stemness and vascul ogenic potential of humanumbilical cord blood stem cells after repeated expansions on PES- nanofibermatrices. Biomateriais.2014;35(30):8566-8575.

[21] Zhang D,Kiiian KA.The effect of mesenchymal stem cell shape on the maintenance of multipotency. Biomaterials. 2013;34(16):3962-3969.

[22] 赵庆华,祝家学,王雷.人脐带间充质干细胞生物学的特性及向软骨细胞、骨细胞分化实验研究[J].中华医学杂志,2011, 91(5): 317-321.

[23] Zhou CH,Yang B,Tian Y,et al.Immunomodulatory effect of human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells on Iymphocytes.Cell Immunol.2011;(1):33-38.

[24] Josse C,Schoemans R,Niessen NA,et al.Systematic chromosomal aberrations found in murine bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Stem Cells Dev.2010;19(8): 1167-1173.

[25] Grade M,Michael J.Difilippantonio,Jordi Camps.Patterns of Chromosomal Aberrations in Solid Tumors.Cancer Res. 2015;200:115-142.

[26] Kim DM,Staples M,Shinozuka K,et al.Wharton’s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: Phenotypic Characterization and Optimizing Their Therapeutic Potential for Clinical Applications. Int J Mol Sci.2013;14(6):1692-11712.

[27] Yan M,Sun M,Zhou Y,et al.Conversion of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Wharton’s Jelly to Dopamine Neurons Mediated by the Lmx1a and Neurturin In Vitro: Potential Therapeutic Application for Parkinson’s Disease in a Rhesus Monkey Model.PLoS One. 2013;8(5): e64000.

[28] 邓蓉蓉,谢伊旻,谢林.间充质干细胞归巢的研究与进展[J].中国组织工程研究,2016,20(19):2879-2888.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年5月至2016年5月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心完成。

1.3 材料 新鲜脐带由健康产妇分娩后自愿捐赠，由贵阳仁爱医院提供。脐带采集前产妇均需检测免疫四项(HBV、HCV、HIV、梅毒标志物)且为阴性，采集后4 ℃保存，6 h内完成实验。研究内容经医院伦理委员会审定通过，所有捐献者均签署知情同意书。

主要试剂及仪器：低糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、L-谷氨酰胺、PBS、核型专用培养基(GIBCO公司)；锥虫蓝(BioServer公司)；细胞计数板(Brand普兰德公司)；MTT(Solarbio公司)；流式抗体(美国BD公司)；DMSO(AMRESCO)；人肝细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、人制瘤素(PeproTech)；冰乙酸、甲醇(北京市通广精细化工公司)；秋水仙素、Giema染液、双抗、β-巯基乙醇、丁羟基茴香醚、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma公司)；兔抗人胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体、鼠抗人神经元特异性烯化酶单克隆抗体、鼠抗人微管相关蛋白2a.b.c单克隆抗体、白蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白18单克隆抗体、二步法免疫组织化学检测试剂、浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥)；倒置显微镜、正置显微镜(日本Olympus公司)；核型分析专用显微镜(德国Leica公司)；流式细胞仪(BD-FACSCALIBUR)；电热恒温水浴箱(北京精科华瑞仪器公司)；石蜡切片机(德国SLEE公司)；烤箱(中国高明锐欧工业设备有限公司)；CO₂细胞培养箱(Thermo公司)；离心机(Eppendorf公司)；通用酶标仪(美国BIO-TEK公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 hUCMSCs的分离、培养^[7] 将脐带于超净工作台中取出，使用生理盐水清洗2遍，并清除脐带血管中和表面的血液，将脐带放于体积分数75%医用乙醇中浸泡约30 s，取出脐带后用生理盐水清洗2遍，将附着于脐带表面的乙醇充分洗净，将脐带手术时夹取的部分予以剪除，将剩余组织，剪成3-5 cm的组织段，并剥除组织中的3根血管，用眼科镊剥离脐带内部的凝胶状华通式胶，将剥离的华通式胶转移入青霉素小瓶中并用眼科剪将其剪碎，并将剪碎的组织块离心清洗2遍后，加入含体积分数10%FBS的低糖DMEM，将其转移至培养瓶中，于37 ℃、含体积分数5% CO₂培养箱中培养；细胞从组织中爬出的时间为培养后5-7 d，原代细胞待细胞贴壁面积达50%时即可进行传代。传代时将培养瓶中的培养液和组织块弃除，使用生理盐水清洗2遍，将组织块完全清除，加入适量0.25%的胰酶溶液，在显微镜下观察消化情况，当细胞由长梭形变为圆形即可，加入略多于0.25%胰酶溶液体积的含体积分数10%FBS的低糖DMEM培养基，终止消化反应，并使用移液管吹吸，使贴附于培养瓶的细胞脱落成为单个悬浮细胞，之后转移至离心管中，1 500 r/min离心5 min，离心，弃上清，加入含体积分数10%FBS的低糖DMEM培养基，细胞浓度1×10⁹ L^-¹接种于75 cm²培养瓶中，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。

1.4.2 hUCMSCs的增殖活性研究^[8] 采用2种不同的方法绘制hUCMSCs增殖曲线，得到不同代次的细胞增殖情况，可用于指导后续的核型分析的检测研究。

细胞计数法检测细胞增殖活性：将不同代次的细胞(第3，4，5，6代)接种于六孔板中，每孔细胞数量为5×10⁵-1×10⁶个，首先使用含体积分数10%FBS的低糖DMEM培养基进行培养，第2天细胞生长成为单层后，将含体积分数10%FBS的低糖DMEM培养基更换为含体积分数2%FBS的低糖DMEM维持液，在计数过程中每2 d进行常规换液，第3天对培养细胞进行消化，并重悬成1 mL细胞悬液，采用细胞计数板进行细胞计数，每天计数1孔并观察细胞增殖情况，并根据每天细胞数量绘制细胞增殖曲线。

MTT法检测细胞增殖活性：将不同代次的细胞(第3，4，5，6代)分别接种于96孔板中，每一代细胞每块板接种12孔(边缘不予以接种，以免发生边缘效应)，每孔加入细胞悬液200 µL，每孔接种细胞数量为500-1 000个，共接种6块96孔板，第2天更换为维持液，继续于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养，第3天对其进行处理，取第1块96孔板每孔中加入10 µL的MTT(调零孔同样加入)，并继续于37 ℃、含体积分数5%CO₂培养箱中培养4 h，4 h后吸出96孔板中的液体，每孔中加入200 µL二甲基亚砜，于摇床上80 r/min震荡5 min，使MTT充分溶解，并使用酶标仪在490 nm波长下测量每孔的A值，予以记录，共测量6 d，并计算每天每代细胞的平均A值(A值即可代表细胞数)，根据每天A值的变化绘制细胞增殖曲线。

1.4.3 hUCMSCs表面标记检测^[8]取不同代次的细胞(第1-9代)，使用0.25%胰酶消化，使用含体积分数1%FBS的PBS清洗2遍，将细胞分装于9个流式管中，每支流式管100 µL，使得细胞数至少达到5×10⁵个。将各个流式管进行标记，并按照以下的一定顺序添加流式抗体：FITC Mouse Anti-Human CD90 5 µL，PE Mouse Anti-Human CD44 5 µL，APC Mouse Anti-Human CD73 5 µL，Blank，hMSC Positive Isotype Control Cocktail 20 µL，PE hMSC Negative Isotype Control Cocktail 20 µL，hMSC Positive Cocktail (20 µL) PE hMSC Negative Cocktail (20 µL)，hMSC Positive Isotype Control Cocktail(20 µL)Drop in isotype control (i.e. PE Mouse IgG2b，κ) 5 µL，hMSC Positive Cocktail(20 µL)PE Drop in (i.e. PE Mouse Anti-Human CD44) 5 µL，将含有细胞的流式管置于暗环境中室温孵育30 min，待细胞孵育完成后，将细胞利用含体积分数1%FBS的PBS清洗2遍，并加入500 µL含体积分数1%FBS的PBS进行重悬细胞，应用BD公司流式细胞仪检测分析hUCMSCs表面抗原CD73、CD90、CD44、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达量。

1.4.4 hUCMSCs核型分析^[9] 取不同代次的细胞(第3，4，5，6代)，使用核型分析专用培养基(含有刀豆蛋白)对其进行培养48-72 h，加入秋水仙碱15 µL(40 g/L)，于CO₂培养箱中继续培养4 h，予以回收细胞；利用细胞刮刀刮除贴壁的细胞，将细胞悬液转移至离心管中，1 800 r/min离心8 min，弃上清，并在离心管中加入4 mL低渗KCl，并在37 ℃恒温水浴箱中水浴5 min，加入2 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)继续于恒温水浴箱中37 ℃水浴5 min，1 800 r/min离心8 min，弃上清，并在离心管中加入4 mL的固定液，重悬细胞，1 800 r/min离心8 min，弃上清，加入4 mL固定液，重悬细胞，于室温条件下固定5 min，1 800 r/min离心8 min，弃上清，加入1.5-2.0 mL的固定液，重悬细胞，以备进行滴片；将滴有细胞的载玻片于室温条件下放置48 h，并予以75 ℃、4 h进行烤片处理，将烤好的玻片予以消化显带处理；将编有①、②、③、④号的器皿放置于37 ℃水浴箱中，在其中加入不同的试剂：①号中加入0.25%胰酶；②号中加入生理盐水；③号中加入生理盐水；④号中加入Giema染液，首先将玻片在①号器皿中消化30 s，在②、③器皿中清洗2遍，并于④号器皿中染色显带10 min，并将多余的染料用自来水冲洗干净，并将玻片烘干，并于核型分析显微镜下进行观察，并对染色体进行分析。

1.4.5 hUCMSCs多向诱导分化能力及鉴定^[10]

诱导分化为神经细胞：取生长良好的第3代细胞，以5×10³/cm²的密度接种到24孔板中，待细胞贴壁达60%融合时，加入含有1 mmol/L β-巯基乙醇和体积分数为20% FBS的高糖DMEM预诱导液继续培养，24 h后弃预诱导液，加入含有体积分数2%DMSO和200 μmol/L丁羟基茴香醚的高糖DMEM诱导液。诱导4 h后，按照免疫组化试剂盒的步骤检测胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白的表达，非诱导分化组不加诱导液。

诱导分化为成骨细胞：取生长良好的第3代细胞，以5×10³/cm²的密度接种到24孔板中，待细胞贴壁达70%融合时，更换培养基为含有10^-⁸ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸和体积分数为10%FBS的高糖DMEM诱导液，每3 d更换1次诱导液，诱导14 d后，PBS漂洗，40 g/L多聚甲醛固定30 min；蒸馏水缓慢冲洗2 min，重复3次，保持样本湿润，0.1%茜素红染液37 ℃避光孵育30 min，蒸馏水洗2 min，镜检观察。非成骨组不加诱导液。

诱导分化为肝样细胞：取生长良好的第3代细胞，以5×10³/cm²的密度接种到24孔板中，待细胞贴壁达70%融合时，更换培养基为含有20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L制瘤素的体积分数10%FBS的高糖DMEM诱导液，每3 d更换1次诱导液，诱导18 d后，按照免疫组化试剂盒的步骤检测白蛋白和角蛋白的表达，非肝样诱导组不加诱导液。

1.5 主要观察指标 不同培养代次hUCMSCs重要生物学属性的差异。

讨论

许多国家已经批准了间充质干细胞的临床研究，而且随着间充质干细胞培养及移植等相关技术的日益成熟，在中国也有多项临床试验获得了批准，使中国走入了间充质干细胞核心技术研发的行列。但选择理想的间充质干细胞来源仍是目前急需解决的问题，成人骨髓源间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺，由于疾病原因，患者常有感染、体质较弱等因素也限制了自体骨髓间充质干细胞的应用，因此寻找新的间充质干细胞来源是目前国内外研究的热点。hUCMSCs与其他干细胞相比具有更大的应用潜能：胎盘和脐带中的祖细胞更为原始，有更强的增殖和分化能力^[11-13]；免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不易触发免疫反应及引起移植物抗宿主病^[14-15]，间充质干细胞的低免疫原性与其低表达主要组织相容性复合体MHC-Ⅰ而不表达MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86有关，同时间充质干细胞对各类免疫细胞均具有免疫调节作用。研究发现，间充质干细胞可通过调节T细胞的活化和增殖来抑制免疫反应；干细胞分离较为简单，细胞纯度高，研究表明脐带富含干细胞，平均每厘米脐带组织中含有4×10⁵个^[16]，不易造成病原微生物和肿瘤细胞的污染；扩增培养时，能够建立统一的体系，便于质控；可作为种子细胞冷冻，并能够多次使用，冷冻复苏后细胞损失小；潜伏性病毒和病原微生物感染及传播的可能性较低；采集时不会对产妇及新生儿造成任何危害及损伤；易于采集、保存和运输，可避免伦理学争议；脐带来源丰富，细胞含量高，可用此建立自体干细胞库以供今后使用。综上，hUCMSCs很有望成为骨髓间充质干细胞的较为理想的替代物^[17-18]，但它是否适宜应用于组织工程及再生医学领域，还取决于是否能获得足够数量且保持干性的活性细胞。体外连续的传代扩增会增加成体间充质干细胞衰老和老化现象，表现为细胞表型的变化、干细胞表面标记表达下降等^[19-21]。

实验通过组织块贴壁法分离、培养、扩增hUCMSCs，深入研究不同代次hUCMSCs的生物学特性。研究结果发现组织hUCMSCs可稳定传代至第9代，不同代次hUCMSCs 的形态特征及生长曲线相似，经组织块贴壁法获得的hUCMSCs原代细胞即P0代呈长梭形，传代培养至第3代以后细胞比较均一，呈流水状生长，排列紧密，增值迅速，一般二三天可传1代，传至第7代以后，细胞增殖缓慢，胞体开始变大变圆，胞质可见空泡。第3-6代hUCMSCs增殖情况稳定，细胞生长曲线均呈“S”型，即一般细胞接种一二天时，处于一种适应阶段，增殖比较缓慢；2-4 d处于对数增长期，细胞生长旺盛；四五天后处于平台期，增殖速度变缓，此后逐渐衰退，掌握这一特性可为将来应用时选择合适的培养时间和控制细胞生长速度等方面提供参考依据。干细胞表面标记随代次增加无明显表达下降，第1-9代hUCMSCs均强表达间充质干细胞表面特异性标记CD90、CD44、CD73，而不表达或低表达造血系细胞标记CD11b、CD19、CD34、CD43及主要组织相容性抗原HLA-DR，其中第1-5代hUCMSCs造血系细胞标记表达量随传代次数逐渐降低，第六七代以后其表达量造血系细胞标记表达量出现升高，呈现逐渐减低后逐渐增加的趋势，加之其形态学在P7代之后的改变，是否说明有些细胞出现了分化？又究竟是什么原因导致细胞发生这些改变？造成这一现象的原因仍有待进一步研究，但可以明确的是，hUCMSCs的免疫分子表达情况较稳定，具有低免疫原性，不会造成移植免疫排斥，对于器官和细胞移植具有重要意义。hUCMSCs除了满足国际细胞疗法和间充质与组织干细胞委员会制定的最低间充质干细胞标准，还表达一些原始干细胞标记，并还可抑制淋巴细胞的增殖，表明其作为一种免疫缺陷的细胞，在移植应用中发挥免疫排斥的可能性很小^[22-23]。由于间充质干细胞移植还可能存在致瘤风险^[24]，而肿瘤的发生与细胞染色体互易、缺失、插入和倒位等为核型的异常改变关系密切^[25]，因此，在美国食品药品管理局(FDA)关于间充质干细胞的应用程序中安全性评估提出了对间充质干细胞染色体核型检测的要求，同时，核型分析的异常结果比癌基因的表达特异性更高，因此在细胞治疗资格认证中进行核型分析非常重要，实验显示体外传代培养的第3-6代hUCMSCs染色体核型均为正常的二倍体核型，未见染色体重复、缺失、易位等改变，这证明了长期传代后的hUCMSCs不会发生染色体畸变。此结果可以作为脐带间充质干细胞应用安全的重要证据。

间充质干细胞具有细胞的“可塑性”，大量研究证实 hUCMSCs 经诱导培养能向多种成体细胞分化，它在体外可分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞等，在体内可分化为多巴胺能神经元、骨骼肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞等，而决定分化方向的关键是诱导分化的条件^[26]。大多数人类间充质干细胞可作为中胚层组织如骨骼、脂肪和软骨发育的前体细胞，同时还可以跨越胚层横向分化为各种组织细胞，如神经细胞和内皮细胞等。实验通过使用不同诱导剂，对第3代hUCMSCs进行向3个不同胚层细胞诱导，观察其是否能向外胚层(神经细胞)、内胚层(成骨细胞)以及中胚层(肝细胞样细胞)分化。结果显示，将第3代hUCMSCs神经预诱导后，经免疫组化检测胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白的表达，诱导组的细胞细胞核着色，阳性表达胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白。此外，Weiss 等^[27]还成功地将其诱导为表达酪氨酸羟化酶的胆碱能神经元。说明 hUCMSCs 不仅可分化为神经元和胶质细胞，还可分化为特定类型的神经元细胞。hUCMSCs 可向外胚层来源的神经细胞分化的潜能，使其具有作为种子细胞应用于修复替代受伤或病变的神经组织，从而为目前一些尚无有效治愈方案的重大神经系统疾病如脊髓损伤、多发性硬化、老年性痴呆、帕金森病等提供了崭新的治疗方案。成骨诱导结果显示通过本实验获得的细胞成分单一、扩增迅速、生物学性状稳定的hUCMSCs可在体外向成骨细胞分化，为进一步将其应用于组织工程和细胞治疗提供了实验依据，比如对椎间盘再生治疗具有重大意义，椎间盘退变可引起一系列疾病如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、节段性腰椎不稳等，而目前还没有理想的方法治疗椎间盘退变。肝样诱导结果提示hUCMSCs分化的细胞表达肝细胞表面标志物白蛋白和角蛋白CK18，是具有向有功能的肝细胞分化活性的间充质干细胞群，主要由细胞角蛋白构成的中间丝系统对维持肝脏细胞的结构与功能完整具有重要作用，正常成人肝脏实质细胞CK组成由CK8和CK18组成，称为“肝细胞型”CK组型，hUCMSCs向肝细胞分化的潜能为重症肝病乃至终末期肝病的治疗提供了新的途径。

hUCMSCs在组织工程与再生医学领域具备高应用价值及不可替代的优势^[28]，而后续研究仍需更多扩增代数从而开展进一步的基础研究，结合动物体内研究以更深入探究传代扩增对hUCMSCs生物学特性的影响，在日后多层次的实验基础上hUCMSCs将更为安全而广泛地走向临床。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同代次人脐带间充质干细胞的生物学特性及分化

Biological features and differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different passages

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[5]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[6]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[7]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.