组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙修复兔尺骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.002

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (47): 7006-7013.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.002

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组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙修复兔尺骨缺损

邢飞，彭静，陈龙，彭鲲，李浪，项舟

四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610000

收稿日期:2016-10-17 出版日期:2016-11-18 发布日期:2016-11-18
通讯作者: 项舟，博士，主任医师，教授，博士生导师，四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610000
作者简介:邢飞，男，1991年生，河北省石家庄市人，汉族，四川大学在读硕士，主要从事创伤修复与功能重建工作。
基金资助:
国家自然科学基金(31370984)

Tissue-engineered periosteum-coated biphasic calcium phosphate scaffold repairs bone defects in rabbits

Xing Fei, Peng Jing, Chen Long, Peng Kun, Li Lang, Xiang Zhou

Department of Orthopaedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2016-10-17 Online:2016-11-18 Published:2016-11-18
Contact: Xiang Zhou, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopaedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Xing Fei, Studying for master’s degree, Department of Orthopaedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31370984

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
双相磷酸钙陶瓷：由羟基磷灰石和由-磷酸三钙两相成分构成的陶瓷。通常其生物活性高于羟基磷灰石陶瓷。
猪小肠黏膜下层膜：即SIS膜，是一种非细胞生物衍生膜性材料，具有伸缩性、生物可降解性、免疫相容性等优势。

背景：研究证明骨膜在骨缺损的修复方面起着重要作用，然而大段骨缺损常常伴随骨膜的缺失。因此运用组织工程学原理构建组织工程骨膜修复骨缺损已成为研究热点。
目的：通过外周血来源间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层构建组织工程骨膜，观察其包被双相陶瓷磷酸钙支架对兔骨缺损的修复。
方法：将外周血间充质干细胞接种于SIS膜(猪小肠黏膜下层)上构建组织工程骨膜，并通过活死细胞染色观察间充质干细胞生长情况。取30只新西兰兔构建15 mm尺骨缺损模型，随机等分为空白对照组、单纯磷酸钙陶瓷组、组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组分别进行相应的骨缺损修复处理。通过术后标本影像学、组织学观察对比3组骨缺损修复情况。
结果与结论：①外周血间充质干细胞接种于SIS膜后细胞活死染色发现间充质干细胞生长良好，数量逐渐增多；②X射线片Lane-Sandhu评分：体内实验中，术后4，8周组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组X射线片Lane-Sandhu评分显著高于单纯磷酸钙陶瓷组(P < 0.05)，单纯磷酸钙陶瓷组高于空白对照组(P < 0.05)；③组织学变化：术后4，8周组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组骨基质形成多于单纯磷酸钙陶瓷组，基质周围有较多成骨细胞分布；④结果显示，外周血间充质干细胞和SIS膜构建的组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙对骨缺损有良好的修复作用。

ORCID: 0000-0003-2816-0500(项舟)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 双相陶瓷磷酸钙, 组织工程骨膜, SIS膜, 支架, 骨修复, 羟基磷灰石, 兔, 骨组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Periosteum has been shown to play an important role in bone defect repair, but large bone defects are often accompanied by the loss of periosteum. Therefore, tissue-engineered periosteum constructed by tissue engineering technology is attracting more attention.
OBJECTIVE: To investigate the effect of the tissue-engineered periosteum which is constructed by mesenchymal stem cells from the peripheral blood and procine small intestinal submucosa and biphasic calcium phosphates on the repair of bone defects in rabbits.
METHODS: Mesenchymal stem cells from peripheral blood were seeded onto the procine small intestinal submucosa to construct the tissue-engineered periosteum, and then the cell growth was observed through live/dead staining. The bone defect model of 15 mm in length in the left ulna was created in the 30 healthy New Zealand rabbits, followed by randomly assigned to 3 groups, and then treated with biphasic calcium phosphates and tissue-engineered periosteum-coated biphasic calcium phosphates, respectively. The remaining rabbits received no treatment as controls. Therapeutic effects were compared by X-ray and histological examinations among groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Live/dead staining found that the mesenchymal stem cells grew well and the cell number increased gradually. X-ray Lane-Sandhu scores of the group treated with tissue-engineered periosteum-coated biphasic calcium phosphates were highest, followed by the biphasic calcium phosphates group and the control group at postoperative 4 and 8 weeks (P < 0.05). Histological examination showed that the group treated with tissue-engineered periosteum-coated biphasic calcium phosphates had more osteoblasts, compared with the other two groups. In conclusion, the biphasic calcium phosphate scaffold coated by the tissue-engineered periosteum that is constructed by mesenchymal stem cells from peripheral blood and procine small intestinal submucosa is feasible to repair bone defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stents, Hydroxyapatites

中图分类号:

R318

邢飞，彭静，陈龙，彭鲲，李浪，项舟. 组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙修复兔尺骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(47): 7006-7013.

Xing Fei, Peng Jing, Chen Long, Peng Kun, Li Lang, Xiang Zhou.

Tissue-engineered periosteum-coated biphasic calcium phosphate scaffold repairs bone defects in rabbits

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(47): 7006-7013.

图/表（结果） 6

2.1 外周血间充质干细胞的分离、培养及鉴定结果兔外周血来源的单个核细胞具有良好的贴壁能力，漩涡状生长，形态呈长梭形的成纤维细胞样(图2A)。取生长良好的第3代单核细胞行成骨诱导茜素红染色后可见明显的钙结节形成(图2B)，成脂诱导油红O染色可见大量红色脂滴(图2C)。取第3代单个核细胞用表型分析，流式细胞表型鉴定提示强阳性表达具有间充质干细胞特性的细胞表面标记CD29，CD90，而不表达造血干细胞特性的细胞表面标记CD45，MCHII(图2D)。

2.2 SIS膜材料细胞毒性实验检测结果在猪小肠黏膜下层浸润液组和对照组中，间充质干细胞数量随时间均明显增加。第1，3，5，7天猪小肠黏膜下层浸润液组和相应培养基对照组间充质干细胞数量均差异无显著性意义(P > 0.05，图3A，B)。结果证实实验所用SIS膜的浸润液对间充质干细胞的增殖无明显影响。

2.3 构建的组织工程骨膜形态制成的SIS膜呈白色半透明薄膜，弹性尚可，质韧(图3C，D)。扫描电镜结果中可见SIS膜内纵横交错的胶原纤维(图3E)。将间充质干细胞接种于SIS膜上构建组织工程骨膜并分别在第1，3，5，7天进行细胞活死染色(活细胞被钙黄绿素染成绿色，死细胞被碘化嘧啶染成红色)。结果发现，SIS膜上间充质干细胞活细胞数量随时间逐渐增多，并在第7天融合成片。此外，在第7天时可能由于营养物质分布不均等原因可见少许死细胞(图4)。

2.4 组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙修复兔尺骨缺损术后4周X射线检测提示，空白对照组未见新骨新骨形成，组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组和单纯陶瓷磷酸钙组可见材料少量降解，骨修复X射线Lane-Sandhu评分组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组为(4.0±0.8)分，单纯磷酸钙陶瓷组为(2.6±0.8)分，空白对照组为(1.1±0.9)分，各组差异均有显著差异(表1)。术后4周骨缺损区域固定、脱水、脱钙、包埋切片后行苏木精-伊红染色、Mason染色观察可见组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组材料开始降解，骨细胞以及骨基质形成(图5)。单纯陶瓷磷酸钙组标本经过脱钙后可见大量结缔组织长入，但未见骨基质形成。

术后8周X射线片提示，组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组材料降解明显，材料与骨端组织融合，骨痂形成明显多于单纯磷酸钙陶瓷组，而空白对照组骨缺损处未见新骨形成。根据术后X射线进行Lane-Sandhu评分组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组为(6.1±0.7)分，单纯磷酸钙陶瓷组(3.7±0.8)分，空白对照组(1.1±0.9)分，各组差异均有显著性意义(P < 0.05；表1)。组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组和单纯磷酸钙陶瓷组术后8周Lane-Sandhu评分均高于术后4周评分(P < 0.05)。术后8周苏木精-伊红染色及Masson染色提示骨缺损单纯磷酸钙陶瓷组和组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组材料均仍未降解完全，组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组材料降解明显优于单纯磷酸钙陶瓷组。同时，组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组骨基质形成明显多于单纯磷酸钙陶瓷组，内有较多骨细胞，基质周围有更多成骨细胞分布(图6)。

2.5 不良反应分析组织工程材料植入后，单纯磷酸钙陶瓷组出现1只兔子伤口感染迹象，经过肌注青霉素、伤口涂抹百多邦等治疗后恢复。其他各组实验动物术后恢复顺利未出现明显并发症。

参考文献

[1]Khan Y, Yaszemski MJ, Mikos AG, Laurencin CT. Tissue engineering of bone: material and matrix considerations. J Bone Joint Surg Am. 2008;90 Suppl 1:36-42.
[2]Laurie SW, Kaban LB, Mulliken JB, et al. Donor-site morbidity after harvesting rib and iliac bone. Plastic and reconstructive surgery. 1984;73:933-938.
[3]韩冰,付小兵.间充质干细胞的研究进展与临床应用前景[J].中国修复重建外科杂志, 2006,20(12):1257-1261.
[4]马锡慧,冯凯,石炳毅.人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展[J].中国组织工程研究, 2011,15(32): 6064-6067.
[5]Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res. 2000;2(6):477-488.
[6]Deb A, Wang S, Skelding KA, et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: a study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 2003; 107(9):1247-1249.
[7]Guilak F, Lott KE, Awad HA, et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells. J Cell Physiol. 2006;206(1):229-237.
[8]Li S, Huang KJ, Wu JC, et al. Peripheral blood-derived mesenchymal stem cells: candidate cells responsible for healing critical-sized calvarial bone defects. Stem Cells Transl Med. 2015;4(4):359-68.
[9]杨志明.组织工程骨的研究成果及存在的问题[J].中国修复重建外科杂志,2005,19(2):87-89.
[10]贝抗胜,吴礼杨,孙庆文,等.人骨膜细胞生物学特性的实验研究[J].中华创伤骨科杂志,2011,13(12):1170-1174.
[11]张大伟,田清业,刘光军,等.骨膜瓣复合异体骨移植修复大段骨缺损[J].组织工程与重建外科,2012,8(1):26-31.
[12]Hall BK, Miyake T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 2000;22:138-147.
[13]Hodde J, Record R, Liang H, et al. Vascular endothelial growth factor in porcine-derived extracellular matrix. Endothelium. 2001;8:11-24.
[14]Badylak S, Liang A, Record R, et al. Endothelial cell adherence to small intestinal submucosa: an acellular bioscaffold. Biomaterials. 1999;20:2257-2263.
[15]Allman AJ, McPherson TB, Badylak SF, et al. Xenogeneic Extracellular Matrix Grafts Elicit A Th2-Restricted Immune Response1. Transplantation. 2001;71:1631-1640.
[16]Giannoni P, Scaglione S, Daga A, et al. Short-time survival and engraftment of bone marrow stromal cells in an ectopic model of bone regeneration. Tissue Engineering Part A. 2009;16:489-499.
[17]Nihouannen DL, Duval L, Lecomte A, et al. Interactions of total bone marrow cells with increasing quantities of macroporous calcium phosphate ceramic granules. J Mater Sci Mater Med. 2007;18(10):1983-1990.
[18]Schwartz C, Liss P, Jacquemaire B, et al. Biphasic synthetic bone substitute use in orthopaedic and trauma surgery: clinical, radiological and histological results. J Mater Sci Mater Med. 1999;10:821-825.
[19]Fu WL, Zhang JY, Fu X, et al. Comparative study of the biological characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow and peripheral blood of rats. Tissue engineering Part A. 2012;18:1793-1803.
[20]Abraham GA, Murray J, Billiar K, et al. Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomaterial. J Biomed Mater Res. 2000;51:442-452.
[21]Zhao L, Zhao J, Yu J, et al. In vitro study of bioactivity of homemade tissue-engineered periosteum. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;58:1170-1176.
[22]Lane JM, Sandhu HS. Current approaches to experimental bone grafting. Orthop Clin North Am. 1987;18:213-225.
[23]孙良,栾保华,李中华,等.兔外周血间充质干细胞的体外分离培养及诱导成骨[J].中国组织工程研究, 2009,13(27): 5291-5295.
[24]Larsen SR, Chng K, Battah F, et al. Improved granulocyte colony-stimulating factor mobilization of hemopoietic progenitors using cytokine combinations in primates. Stem Cells. 2008;26:2974-2980.
[25]Fu Q, Zhang Q, Jia LY, et al. Isolation and characterization of rat mesenchymal stem cells derived from granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood. Cells Tissues Organs. 2016.
[26]Dhar M, Neilsen N, Beatty K, et al. Equine peripheral blood-derived mesenchymal stem cells: isolation, identification, trilineage differentiation and effect of hyperbaric oxygen treatment. Equine Vet J. 2012;44: 600-605.
[27]Lyahyai J, Mediano DR, Ranera B, et al. Isolation and characterization of ovine mesenchymal stem cells derived from peripheral blood. BMC Vet Res. 2012;8:1.
[28]Ab Kadir R, Zainal Ariffin SH, Megat Abdul Wahab R, et al. Characterization of mononucleated human peripheral blood cells. ScientificWorldJournal. 2012;2012.
[29]Fu WL, Xiang Z, Huang FG, et al. Coculture of peripheral blood-derived mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells on strontium-doped calcium polyphosphate scaffolds to generate vascularized engineered bone. Tissue Engineering Part A. 2014.
[30]Dipersio JF, Stadtmauer EA, Nademanee A, et al. Plerixafor and G-CSF versus placebo and G-CSF to mobilize hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation in patients with multiple myeloma. Blood. 2009;113:5720-5726.
[31]Clercq ED. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 2009;77:1655-1664.
[32]Fu WL, Zhang JY, Fu X, et al. Comparative study of the biological characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow and peripheral blood of rats. Tissue Engineering Part A. 2012;18:1793-1803.
[33]Schönmeyr B, Clavin N, Avraham T, et al. Synthesis of a tissue-engineered periosteum with acellular dermal matrix and cultured mesenchymal stem cells. Tissue Engineering Part A. 2009;15:1833-1841.
[34]Fan W, Crawford R, Xiao Y. Enhancing in vivo vascularized bone formation by cobalt chloride-treated bone marrow stromal cells in a tissue engineered periosteum model. Biomaterials. 2010;31:3580-3589.
[35]Hattori K, Yoshikawa T, Takakura Y, et al. Bio-artificial periosteum for severe open fracture-an experimental study of osteogenic cell/collagen sponge composite as a bio-artificial periosteum. Biomed Mater Eng. 2005;15: 127-136.
[36]Liang Y, Wen L, Shang F, et al. Endothelial progenitors enhanced the osteogenic capacities of mesenchymal stem cells in vitro and in a rat alveolar bone defect model. Arch Oral Biol. 2016;68:123-130.
[37]张苍宇,王栓科,任广铁,等.组织工程骨膜同种异体体内成骨修复兔肩胛骨缺损的初步研究[J].中国修复重建外科杂志,2014,28(3):384-388.

引言

目前对于骨缺损的治疗主要依靠自体骨移植、同种异体骨移植、骨搬运等治疗手段，但这些手段均有其局限性。而由种子细胞、细胞因子、支架材料构建的组织工程骨为大段骨缺损的修复提供了良好的前景^[1-2]。间充质干细胞是一常用的种子细胞，存在于骨髓、脂肪、胎盘、滑膜等多种组织中^[3]，这些途径来源的间充质干细胞均需要侵入性的操作获取；另外，对于胚胎来源间充质干细胞，虽然其分化能力高，但其存在伦理问题及组织相容性问题。这些因素阻碍其在临床上的应用^[4]。而Zvaifler等^[5]首次从人类外周血中分离获取到类似间充质干细胞的多能干细胞。近年来，许多研究均发现外周血液中同样存在少量的间充质干细胞并具有良好的成骨分化能力和一定的骨修复作用。相比于传统的获取间充质干细胞需要骨髓穿刺、抽脂术等侵入性操作^[6-7]，外周血来源的间充质干细胞因其取材微创，是有良好临床应用前景的种子细胞^[8]。目前的组织工程骨植入体内后受营养物质渗透不够、代谢产物堆积等原因的影响仍难以达到良好的修复效果^[9]。

骨形成的方式主要有软骨下成骨和膜内成骨2种方式。包被于骨表面的骨膜内存在可以分化为成骨细胞的间充质干细胞，在骨组织生长发育以及骨缺损修复的过程中起着重要的作用^[10]。然而临床中大段骨缺损常常伴随骨膜的缺失，最大程度的保护骨膜已经成为一个基本共识。已经有实验证实通过移植骨膜可以达到一定的骨缺损修复效果^[11-12]。但骨膜移植受自身供体来源有限、异体间免疫排斥等原因的限制发展十分缓慢。而传统的组织工程骨植入体内修复骨缺损时一般缺乏骨膜的包绕，这也许是影响其骨修复能力的因素之一。近年来，随着组织工程领域的快速发展，运用组织工程的方法来构建模组织工程骨膜模拟骨膜特性为临床中大段骨缺损的治疗提供一种新的思路。

猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)是一种非细胞生物衍生膜性材料，具有伸缩性、生物可降解性、免疫相容性等优势^[13-15]。已有大量研究证实将细胞接种到支架材料SIS膜后对软骨、皮肤缺损展现出了良好的修复能力^[16]。但对于间充质干细胞结合SIS膜构建的组织工程骨膜是否有促进骨缺损的修复报道较少。双相陶瓷磷酸钙是由羟基磷灰石和β-磷酸三钙组成，已被广泛应用于组织工程支架材料的研究中。因其具有良好的免疫相容性、骨诱导性以及一定的力学强度，可以作为组织工程骨膜依附的载体^[17-18]。

故实验通过外周血来源间充质干细胞复合SIS膜构建组织工程骨膜，包被具有骨诱导作用的双相陶瓷磷酸钙支架材料探讨其修复兔大段尺骨缺损的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年2月至2016年4月在四川大学华西医院转化医学中心干细胞与组织工程实验室和动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：成年雄性新西兰大白兔50只，体质量2.0-3.0 kg，均在四川大学华西医院转化医学中心动物实验室购买，动物许可证号：SCXK(川)2013-026，实验已获得四川大学华西医学中心动物伦理委员会批准。

支架材料：所用双相陶瓷磷酸钙由四川大学生物材料工程研究中心提供，大体直径5 mm，高5 mm，中心有3个1 mm宽孔径，其相组成为HA/-TCP≈20/80，孔隙率约70%，大孔尺寸30-400 μm，微孔尺寸0.1-2.0 μm。

1.4 实验方法

1.4.1 外周血干细胞的动员、分离、培养及鉴定采用体质量为2.0-3.0 kg的健康新西兰大白兔，按之前研究报道注射粒细胞集落刺激因子G-CSF 100 μg/kg^[19]，连续5 d皮下注射，第6天皮下注射CXCR4拮抗剂AMD3100 5 mg/kg，1 h后颈动脉抽血约60 mL后等体积Ficoll液(天津灏洋公司)稀释，密度梯度离心后收集中间白膜层，洗涤，离心，重悬，接种于25 mL培养瓶，置于37 ℃、95%湿度、体积分数5%CO₂培养箱，72 h后首次换液，此后隔天换液，倒置相差显微镜下观察细胞状态，达80%-90%融合时用胰酶消化，按1∶3传代培养。取第3代间充质干细胞按细胞密度2×10⁴/孔接种于6孔板中，成骨培养基(江苏赛业公司)诱导3周后 40 g/L多聚甲醛固定，行茜素红染色。取第3代间充质干细胞按细胞浓度10×10⁴/孔浓度接种于6孔板中，成脂培养基(江苏赛业公司)诱导2周后40 g/L多聚甲醛固定，行油红O染色。取第3代间充质干细胞计数、离心、PBS重悬细胞密度为1×10⁹ L^-1，取0.5 mL细胞悬液于流式管中。选取CD29、CD90作为阳性标记，CD29，CD90为阴性标记，分别室温下避光孵育、离心、洗涤。首先使用流式细胞仪器检测未添加抗体的细胞组，根据结果设置线性门，在通过检测与相应抗体结合过后的细胞数量以及荧光强度进而了解标本内细胞表面标记的表达情况。

1.4.2 SIS膜的制备及观察按照之前文献中方法制备SIS膜^[20-21]，健康成年家猪处死后5 h内取其空肠洗净,修剪成10-15 cm长小段，用包裹湿纱布的手术刀柄刮除黏膜、浆膜和肌层后洗净后得到半透明的薄膜。将其浸泡在pH 11-12的10 mmol/L的氢氧化钠和100 mmol/L的乙二胺四乙酸溶液中16 h后用去离子水漂洗；浸泡于pH 0-1的1 mol/L氯化钠和1 mol/L的盐酸混合液中6-8 h；浸泡于pH 7.0-7.4的1 mol/L的氯化钠和10 mmol/L的PBS中16 h；用pH 5.8-7.0的去离子水冲洗2 h后用体积分数0.1%过氧乙酸和20%乙醇混合溶液浸泡8 h。用体积分数0.01%叠氮化钠冲洗2 h后-70 ℃冷冻干燥8 h以上，将得到的片状SIS膜裁剪为直径2 cm的圆形薄膜，真空密封包装，⁶⁰Coγ辐照30 min后冷藏于-80 ℃冰箱中，扫描电镜下观察SIS膜结构。

1.4.3 SIS膜细胞毒性实验通过培养基获得所制备SIS膜的浸润液并用其培养细胞来检测所制SIS膜的细胞毒性，将间充质干细胞接种于96孔板中，相应培养基作为对照组，各个时间点每组5孔，分别于第1，3，5，7天CCK-8细胞毒性试剂盒检测吸光度值。

1.4.4 组织工程骨膜的体外构建将直径2 cm的圆形SIS膜放入12孔板底部，PBS浸泡24 h，将第3代外周血间充质干细胞混悬、计数，按照1.0×10⁸ L^-1，200 μL/孔滴入SIS膜上后孵箱内静置4-6 h使细胞贴附在SIS膜上，每孔加入2.0-3.0 mL培养液，隔日换液。分别于第1，3，5，7天行细胞活死染色后激光共聚焦显微镜观察细胞存活情况。

1.4.5 组织工程骨膜结合双相陶瓷磷酸钙修复兔骨缺损及分组干预动物手术均在相同条件下由相同人员完成，体积分数3%戊巴比妥耳缘静脉麻醉，前臂常规备皮、消毒、铺巾。取兔前臂正中切口入路，长约3 cm，沿肌间隙暴露兔尺骨，完全去除骨膜，构建单侧长约 15 mm尺骨缺损模型，并灼烧破坏周围骨膜，冲洗、止血后将分组材料植入骨缺损区域处，肌肉包埋固定(图1)。术后青霉素肌肉注射3 d预防感染，术后4，8周进行影像学和组织学评估。

实验将30只成年新西兰大白兔随机分为3组：空白对照组、单纯磷酸钙陶瓷组、组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组，每组10只。术后4，8周通过标本X射线片进行Lane-Sandhu评分^[22]评价在各个时间点各组Lane-Sandhu评分有差异无显著性意义，Lane-Sandhu评分(0-4分)越高代表骨缺损修复效果越好。术后4，8周随机抽取单纯磷酸钙陶瓷组和组织工程骨膜包被磷酸钙陶瓷组中3只动物，取骨缺损区组织标本固定、脱水、脱钙、包埋切片后行苏木精-伊红染色及马松染色观察。

1.5 主要观察指标

1.5.1 成骨成脂染色茜素红染色有无红色钙结节生成、油红O染色有无红色脂滴生成。

1.5.2 流式细胞学检测通过观察流式细胞仪观察样本内细胞数量以及荧光强度进而了解样本内表达细胞表面标记CD29，CD90，CD45，MHCII的细胞占样本总细胞的比例。

1.5.3 细胞毒性实验测量所制备的SIS膜组(猪小肠黏膜下层组)和相应培养基对照组第1，3，5，7天的吸光度值(n=5)，比较各个时间点两组均数有差异无显著性意义，观察所制备SIS膜对细胞增殖有无影响。

1.5.4 术后各组影像学结果分别观察动物术后第4，8周各组Lane-Sandhu X射线评分。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，实验中数值均符合正态分布，计量资料用x(_)±s表示，多组间数据差异的比较采用单因素方差分析和LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前许多研究通过不同方法从多种动物外周血中成功分离培养出间充质干细胞。有研究表明当机体接受一定的病理刺激之后，间充质干细胞可以经过动员进入外周血。孙良等^[23]通过间断的皮肤切除、原位回植的方法成功从兔外周血中分离出具有成骨分化能力的间充质干细胞。也有研究证实从烧伤后大鼠的外周中血中可以分离获得间充质干细胞。通过此类方法获取外周血间充质干细胞的创伤过大，临床应用意义较小。外周血中干细胞的含量受体内各种细胞因子、黏附因子及趋化因子等多种分子的相互影响，因此可以通过一定的药物动员的方法从将间充质干细胞动员入外周血中进而分离获取外周血间充质干细胞^[^24-25^]。

许多研究证实通过外周血动员的方法成功从人、马、羊、兔、鼠等多种动物的外周血中分离出间充质干细胞，并具有成骨、成脂、成软骨等间充质干细胞特性^[25-29]，而此类研究主要的动员方法是单独使用集落刺激因子。尽管集落刺激因子是可以动员CD34阳性细胞进入外周血中，但这种方法并非动员非造血祖细胞的最佳方式^[30]。其中SDF-1/CXCR4是间充质干细胞另外一个非常重要的趋化因子受体，对干细胞的迁移、归巢有重要的影响^[31]。按本课题组之前研究^[32]，相比于单独使用集落刺激因子动员，联合集落刺激因子和CXCR4拮抗剂可以更好的从兔外周血中分离获得间充质干细胞。实验中即采用此种方法成功通过外周血动员获得单个核细胞，并证实其具有成骨、成脂等干细胞特性。

目前组织工程骨膜构建形式多种多样。Schönmeyr等^[33]将大鼠骨髓来源成骨细胞接种到经过脱细胞处理后的人皮肤组织上构建仿生骨膜，再植入同源大鼠内收肌以及裸鼠下颌骨内，3周后可见材料与肌肉结合处有骨样物质生成，6周后可见骨愈合。Fan等^[34]在人骨髓来源间充质干细胞培养过程中加入氯化钴处理后接种于牛Ⅰ型胶原支架上构架模拟骨膜，对小鼠颅骨缺损有一定的修复能力。Koji等^[35]将鼠骨髓来源间充质干细胞接种于软支架胶原海绵上构建生物人工骨膜来修复鼠颅骨骨折展现出了良好的愈合能力。Yuan等^[36]将鼠骨髓来源间充质干细胞进行培养构建细胞膜片来修复鼠颅骨缺损展现出了良好的骨修复能力。

张苍宇等^[37]将兔骨髓来源间充质干细胞接种到SIS膜上构建组织工程骨膜后通过填充来修复兔肩胛骨骨缺损同样展现出良好的修复能力。猪小肠黏膜下层(SIS膜)在组织工程工程领域是一种应用十分广泛的天然生物衍生膜性材料。相比诸如聚乳酸等工有机合成材料容易引起周围组织炎症，SIS膜含有大量的胶原纤维，具有良好的机械性能、较低的免疫原性、良好的通透率、易降解、对动物体内其他组织器官无毒性等特点。因SIS膜上含有多种促进细胞增殖、分化、迁移的细胞因子，如血管内皮因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等，将SIS膜与相应细胞复合后广泛应用于神经损伤修复、皮肤缺损修复、心脏血管修复及膀胱修复等。相比于使用其他材料构建组织工程骨膜，SIS膜还具有更好的生物强度、韧性、来源广及获取便捷等优点。有研究将兔骨髓来源间充质干细胞接种于SIS膜后通过扫描电镜观察细胞在SIS膜上很快贴附、伸展。其他研究研究结果表明将间充质干细胞接种到SIS膜上检测碱性磷酸酶表达含量上升。而实验采用将外周血来源间充质干细胞接种于SIS膜上构建组织工程骨膜，分别从不同时间点进行活死染色，更加直观的证实间充质干细胞在SIS膜上可以顺利存活并且能快速生长增殖。

目前构建出的组织工程骨膜仍有部分不足。目前大多数研究构建出的组织工程骨膜主要通过填塞的方式来进行骨缺损的修复，而骨缺损主要集中在颅骨、肩胛骨这些扁骨内。由于动物体内营养物质扩散范围十分局限，从而导致填塞过后处于内部的细胞营养供给不足、代谢产物堆积等问题，致使组织工程骨膜内间充质干细胞大量失活及死亡。同时构建出的组织工程骨膜具有较差的力学性能，无法起到支撑作用，在体内易收到其他组织的挤压而变形。具有骨诱导作用的双相陶瓷磷酸钙支架已被广泛应用于骨缺损的修复当中，但其植入体内后依然存在降解缓慢等缺点。因此实验采用将构建出的组织工程骨膜通过包被双相陶瓷磷酸钙的方式来增强其力学性能，进而用来修复兔尺骨缺损。将双相陶瓷磷酸钙作为组织工程骨膜的辅助支架，通过3个支架材料的堆叠和支架材料中心的3个孔洞增加营养物质的渗透。在为组织工程骨膜提供支撑的同时，随着新骨的逐渐生成，双相陶瓷磷酸钙支架材料不断被吸收，同时降解产物可以作为新骨生成的原料。实验术后影像学以及组织学结果证明，组织工程骨膜加快了双相陶瓷磷酸钙材料的降解，同时起到了良好的骨修复效果。

综上所述，利用外周血间充质干细胞和SIS膜构建的组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙构建组织工程骨有良好的骨缺损修复能力，为组织工程骨修复大段骨缺损提供了另外一种探索的可能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

组织工程骨膜包被双相陶瓷磷酸钙修复兔尺骨缺损

Tissue-engineered periosteum-coated biphasic calcium phosphate scaffold repairs bone defects in rabbits

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[1]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[2]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[3]	李文静, 李浩渤, 刘从娜, 程东梅, 陈惠珍, 张志勇. 不同生物活性支架治疗年轻恒牙再生牙髓活力的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 499-503.
[4]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[5]	刘江锋. 纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合材料联合锁定钢板治疗股骨骨纤维异常增殖症[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 542-547.
[6]	马志杰, 李京育, 曹放, 刘蓉, 赵德伟. 多孔碳化硅涂覆生物活性钽新型生物医用材料的影响因素及生物学性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 558-563.
[7]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[8]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[9]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[10]	叶海民, 丁凌华, 孔维豪, 黄祖泰, 熊龙. 多级微管结构骨支架载体促进成骨成血管作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 621-625.
[11]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[12]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[13]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[14]	高坤, 陈大宇, 张勇, 刘伟东, 孙淑芬, 赖文强, 马笃军, 吴益宏, 林展鹏, 蒋鹰鹭, 余伟吉. 牛膝醇提物调控滑膜成纤维细胞外泌体抑制软骨细胞外基质降解[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3636-3640.
[15]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.