聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙三维多孔骨组织工程支架的构建与性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.001

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (47): 6887-7005.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.001

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 下一篇

聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙三维多孔骨组织工程支架的构建与性能

胡露^1，2，3，魏坤¹，邹芬^1，2，3

¹华南理工大学材料科学与工程学院，广东省广州市 510640；²国家人体组织功能重建工程技术研究中心，广东省广州市 510006；³广东省生物医学工程重点实验室，广东省广州市 510006

收稿日期:2016-09-01 出版日期:2016-11-18 发布日期:2016-11-18
通讯作者: 魏坤，教授，华南理工大学生物科学与工程学院，广东省广州市 510640
作者简介:胡露，女，1991年生，湖北省咸宁市人，汉族，2016年华南理工大学材料科学与工程学院毕业，硕士，主要从事生物医用材料研究。
基金资助:
广东省级科技计划项目(2015A020214005)资助

Construction and characteristics of poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate scaffolds with three-dimensional pores for bone tissue engineering

Hu Lu^{1, 2, 3}, Wei Kun¹, Zou Fen^{1, 2, 3}

¹School of Material Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China; ²National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; ³Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Engineering, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2016-09-01 Online:2016-11-18 Published:2016-11-18
Contact: Wei Kun, Professor, School of Material Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China
About author:Hu Lu, Master, School of Material Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong Province, China; National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Engineering, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the Guangdong Provincial Science and Technology Program, No. 2015A020214005

摘要/Abstract

摘要：

文章快读阅读：

文题释义：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物：被广泛用于骨组织工程支架材料，具有良好的生物相容性和降解性，但作为一种人工合成的高分子材料，其也有一定的缺陷，如本身的骨传导性较弱、降解产物偏酸性容易引起炎症反应及机械强度不够等。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙三维多孔骨组织工程支架：实验首先在聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球中加入硅酸钙，制得了具有良好生物相容性和降解性的多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙复合微球，然后采用生物3D打印设备3D-Bioplotter，利用熔融沉积制造的原理制备了具有三维连通多孔结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架；最后利用低温融合技术将聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙复合微球与聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架结合起来，预期构建出一种具有良好生物相容性、降解性、机械强度和三维连通多孔结构的新型骨组织工程支架。

背景：目前的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)支架材料存在降解产物呈酸性、力学性能低、孔隙率低、孔径小、孔隙之间的连通率不佳、支架的几何形状不易控制等缺陷。
目的：构建具有三维连通多孔结构的PLGA/硅酸钙骨组织工程支架材料，测试其体外降解性能、力学性能及生物相容性。
方法：先通过乳液溶剂挥发法制备PLGA/硅酸钙多孔复合微球，3D-Bioplotter制备PLGA三维多孔支架，然后采用低温融合技术将微球与支架结合，制备PLGA/硅酸钙复合多孔支架。检测PLGA/硅酸钙多孔复合微球与PLGA微球的组成成分、形貌及降解性能，检测PLGA三维多孔支架与PLGA/硅酸钙复合多孔支架的形貌、孔隙及压缩强度。分别采用PLGA/硅酸钙多孔复合微球与PLGA微球浸提液，含PLGA三维多孔支架与PLGA/硅酸钙复合多孔支架的培养液培养小鼠骨髓间充质干细胞，1，3，5 d后检测细胞增殖活性。
结果与结论：①微球形貌及降解性能：硅酸钙组分的加入，有助于PLGA微球形成表面规则孔结构和内部空腔结构，以及提高PLGA微球降解的pH值；②支架结构：PLGA/硅酸钙复合多孔支架的纤维直径与支架孔径均小于PLGA三维多孔支架；③支架孔隙：PLGA/硅酸钙复合多孔支架的孔隙率与平均孔径均小于PLGA三维多孔支架；④支架力学性能：PLGA/硅酸钙复合多孔支架的压缩强度与压缩模量高于PLGA三维多孔支架(P < 0.05)；⑤细胞相容性：骨髓间充质干细胞在两种微球浸提液和两种支架上的生长状况良好；⑥结果表明：PLGA/硅酸钙复合多孔支架具有良好的体外降解性能、力学性能及生物相容性。

ORCID: 0000-0002-2694-4478(魏坤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 硅酸钙, PLGA, 复合微球, 生物3D打印, 组织工程, 多孔支架, 骨髓间充质干细胞, 生物相容性, 降解性能, 力学性能

Abstract:

BACKGROUND: Some disadvantages exsist in commonly used poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffolds, including acidic degradation products, suboptimal mechanical properties, low pore size, poor porosity and pore connectivity rate and uncontrollable shape.
OBJECTIVE: To construct a scaffold with three-dimensional (3D) pores by adding calcium silicate to improve the properties of PLGA, and then detect its degradability, mechanical properties and biocompatibility.
METHODS: PLGA/calcium silicate porous composite microspheres were prepared by the emulsion-solvent evaporation method, and PLGA 3D porous scaffold was established by 3D-Bioplotter, and then PLGA/calcium silicate composite porous scaffolds were constructed by combining the microspheres with the scaffold using low temperature fusion technology. The compositions, morphology and degradability of the PLGA/calcium silicate porous composite microspheres and PLGA microspheres, as well as the morphology, pore properties and compression strength of the PLGA 3D scaffolds and PLGA/calcium silicate composite porous scaffolds were measured, respectively. Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were respectively cultivated in the extracts of PLGA/calcium silicate porous composite microspheres and PLGA microspheres, and then were respectively seeded onto the PLGA 3D scaffolds and PLGA/calcium silicate composite porous scaffolds. Thereafter, the cell proliferation activity was detected at 1, 3 and 5 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Regular pores on the PLGA microspheres and internal cavities were formed, and the PH values of the degradation products were improved after adding calcium silicate. The fiber diameter, pore, porosity and average pore size of the composite porous scaffolds were all smaller than those of the PLGA scaffolds. The compression strength and elasticity modulus of the composite porous scaffolds were both higher than those of the PLGA scaffolds (P < 0.05). Bone marrow mesenchymal stem cells grew well in above microsphere extracts and scaffolds. These results indicate that PLGA/calcium silicate composite porous scaffolds exhibit good degradability in vitro, mechanical properties and biocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Braces, Microspheres, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

胡露，魏坤，邹芬. 聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙三维多孔骨组织工程支架的构建与性能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(47): 6887-7005.

Hu Lu, Wei Kun, Zou Fen. Construction and characteristics of poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate scaffolds with three-dimensional pores for bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(47): 6887-7005.

图/表（结果） 9

2.1 PLGA/硅酸钙复合微球的组成成分分析图1中圆点标注的位置依次为(400)、(002)、(-202)、(202)、(320)，对照X射线衍射标准JCPDS卡片数据可知，它们是硅酸钙的特征峰，在PLGA/硅酸钙谱图中，硅酸钙的特征峰均存在，说明微球中存在硅酸钙；由图2可以看出，在PLGA/硅酸钙复合微球的谱图中，1 762， 1 170 cm^-1附近出现的2个峰分别为酯键和C-O键的特征吸收峰，而3 000，2 956 cm^-1附近出现的2个较大的吸收峰，分别为-CH₃和-CH₂-的伸缩振动吸收，且PLGA的其他特征峰均存在，说明复合微球中含有PLGA；而在1 077，477 cm^-1附近出现的2个吸收峰，分别为Si-O-Si键的伸缩振动吸收和弯曲振动吸收^[24]，1 006，945，891，682，643，567，477 cm^-1附近出现的特征吸收峰与β-CaSiO₃的谱图基本一致^[25-26]，说明复合微球中也存在硅酸钙。由于PLGA有机组分的存在，硅酸钙在复合微球中的特征峰没有单一组分的尖锐。

2.2 PLGA微球和PLGA/硅酸钙复合微球的形貌和结构由图3可知，微球保持着良好的球形结构，大部分微球的粒径在200 μm左右，PLGA微球表面平整光滑(图3A)，内部为实心结构(图3B)；而PLGA/硅酸钙复合微球表面则分布着大量开放孔结构(图3C)，形状规则，分布均匀，绝大部分尺寸在1-10 μm之间，且内部存在较大空腔(图3D)，说明硅酸钙组分的加入有助于PLGA微球形成表面规则孔结构和内部空腔结构。

2.3 硅酸钙组分对PLGA降解pH值的影响图4比较了PLGA微球和PLGA/硅酸钙复合微球的体外降解介质pH值变化情况，降解实验的前15 d，两组微球的pH值基本维持在7.4左右，且相差不大；15 d后，PLGA微球介质的pH值迅速下降，而PLGA/硅酸钙复合微球的下降较为缓慢；在第40天时，PLGA微球介质的pH值下降至2.6左右，而PLGA/硅酸钙复合微球的仍可维持在6左右，结果表明，硅酸钙组分的加入对PLGA的酸性降解产物有一定的中和作用。图5进一步比较了不同含量硅酸钙对PLGA微球体外降解介质pH值的影响，在降解的前15 d内，20%组和30%组的降解介质pH值都有一个明显的升高然后再降低的过程，而10%组基本维持在7.4左右；15 d后，3组pH值都开始缓慢降低，其中10%组下降最为缓慢；到降解的第60天，10%组的pH值降低至3左右，而20%和30%组的pH值比10%略高0.5。说明硅酸钙对PLGA微球体外降解介质pH值的中和作用主要发生在前15 d内。

2.4 PLGA三维多孔支架和PLGA/硅酸钙复合多孔支架的结构特征如图6所示，PLGA/硅酸钙支架的尺寸比PLGA支架略小(图6A)；PLGA支架的纤维直径和孔径约为600 μm和800 μm(图6B)，而PLGA/硅酸钙支架的纤维直径和支架孔径约为500 μm和750 μm(图6C)，均小于PLGA支架，且两种支架的纤维直径均大于所用针头直径0.4 mm，说明在打印过程中出现了纤维挤出胀大现象，低温融合技术制备PLGA/硅酸钙复合多孔支架的过程中，支架尺寸又出现了一定程度的回缩；从支架的扫描电镜图片可以看出，PLGA支架保持良好的三维连通多孔结构(图6D)，在PLGA/硅酸钙支架中，微球均匀地分散在支架的孔道之间，同时与支架保持较好的孔隙结构(图6E)；在PLGA/硅酸钙支架200倍扫描电镜图中，微球已与支架融合，同时单一微球表面仍良好地保留着多孔形貌(图6F)。

2.5 Micro-CT构建三维多孔支架模型和孔隙特征利用Micro-CT对支架扫描重建，得到支架的结构模型和孔径分布图(图7)，PLGA支架的平均孔隙率、孔隙连通率及平均孔径分别为31.35%、100%、0.32 mm，PLGA/CS支架的平均孔隙率、孔隙连通率及平均孔径分别为24.09%、99.88%、0.17 mm。由图7可知，两支架的孔隙均完全连通，孔隙在支架中分布较均匀；PLGA支架的孔径主要分布在0.4-0.5 mm，同时还出现较多的小于0.1 mm的孔洞(图7C)，这部分小孔可能是由于边缘效应造成的；而在PLGA/CS支架中，由于多孔微球的加入，除了0.4-0.5 mm孔洞外，更多的出现了小于0.2 mm的孔洞(图7D)；对两支架的孔隙率、孔隙连通率和平均孔径加以比较发现，PLGA/硅酸钙支架的孔隙率和平均孔径均比PLGA支架小，而两支架的孔隙连通率几乎都为100%。以上结果说明，利用低温融合技术将PLGA/硅酸钙复合多孔微球与PLGA三维多孔支架成功组装成具有完全连通的梯度多级孔结构的复合支架。

2.6 支架的力学性能测试结果图8比较了PLGA支架和PLGA/CS支架的压缩力学性能，在形变为5%、10%、15%时，PLGA支架的压缩强度分别为0.11，1.66， 4.08 MPa，而PLGA/硅酸钙支架对应的压缩强度为0.66，3.34，7.89 MPa(图8A)；PLGA支架的压缩强度和压缩模量分别为4.17，22.74 MPa，而PLGA/硅酸钙支架的压缩强度和压缩模量分别为11.57，88.71 MPa(图8B)。结果表明，与PLGA支架相比，PLGA/硅酸钙支架的力学性能显著提高。

2.7 材料的体外细胞相容性图9A比较了骨髓间充质干细胞在不同硅酸钙含量PLGA/硅酸钙微球浸提液中的增殖情况，第1-5天，所有组别吸光度一直升高，随着微球中硅酸钙含量的增加，浸提液对细胞增殖率的作用总体呈略微增加趋势，但与不含硅酸钙的PLGA微球比较差异均无显著性意义，说明细胞可以在不同硅酸钙含量的PLGA微球浸提液中正常生长，硅酸钙组分的加入对骨髓间充质干细胞的增殖有一定的促进作用，但效果不显著；图9B为骨髓间充质干细胞在PLGA支架和PLGA/硅酸钙支架上的增殖情况，以传统热烧结法制备的PLGA微球支架作为对照组，由图可知，细胞在3组支架上均可稳定生长，说明3组支架均具有良好的生物相容性；从单个时间点来看，3D-Bioplotter制备PLGA组的细胞数明显高于其他两组，PLGA/硅酸钙组的细胞数也显著高于传统热烧结法制备的PLGA微球支架，说明PLGA三维多孔支架和PLGA/硅酸钙复合多孔支架比传统热烧结法制备的PLGA微球支架更有利于骨髓间充质干细胞的增殖，其原因可能是高的孔隙率、孔隙连通率和较大的孔径更有利于细胞的长入。

参考文献

[1]Hutmacher DW.Scaffols in tissue engineering bone and cartilage.Biomaterials.2000; 21(24):2529-2543.
[2]Gentile P,Chiono V,Carmagnola I,et al.An overview of poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering.Int J Mol Sci.2014;15(3): 3640-3659.
[3]Danhier F,Ansorena E,Silva JM,et al.PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications.J Control Release.2012;161(2):505-522.
[4]Zolnik BS,Burgess DJ.Effect of acidic pH on PLGA microsphere degradation and release. J Control Release. 2007;122(3):338-344.
[5]Liu H,Slamovich EB,Webster TJ.Less harmful acidic degradation of poly(lactic-co-glycolic acid) bone tissue engineering scaffolds through titania nanoparticle addition.Int J Nanomedicine.2006;1(4):541-545.
[6]Cheng D,Cao X,Gao H,et al.Superficially porous poly (lactic-co-glycolic acid)/calcium carbonate microsphere developed by spontaneous pore-forming method for bone repair.RSC Adv.2013;3(19):6871-6878.
[7]Ege D,Cameron R,Best S.The degradation behavior of nanoscale HA/PLGA and alpha-TCP/PLGA composites. Bioinspir Biomim Nan.2014;3(2):85-93.
[8]Cao J,Shi S,Geng H,et al.Neutralizing ability of bioactive glass (BG) on the PLGA microsphere degradation.Lat Am J Pharm.2015;34(3):468-473.
[9]Lynn A,Nakamura T,Patel N,et al. Composition- controlled nanocomposites of apatite and collagen incorporating silicon as an osseopromotive agent.J Biomed Mater Res A. 2005;74(3):447-453.
[10]Liu X,Ding C,Chu PK.Mechanism of apatite formation on wollastonite coatings in simulated body fluids. Biomaterials.2004;25(10):1755-1761.
[11]Lin K,Zhai W,Ni S,et al.Study of the mechanical property and in vitro biocompatibility of CaSiO3 ceramics.Ceram Int.2005;31(2):323-326.
[12]Xue W,Liu X,Zheng X,et al.In vivo evaluation of plasma-sprayed wollastonite coating. Biomaterials. 2005;26(17):3455-3460.
[13]Wu C,Chang J.A review of bioactive silicate ceramics. Biomed Mater.2013, 8(3):032001.
[14]Shirazi FS,Mehrali M,Oshkour AA,et al.Mechanical and physical properties of calcium silicate/alumina composite for biomedical engineering applications.J Mech Behav Biomed Mater.2014;30:168-175.
[15]Nam YS,Park TG.Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation.J Biomed Mater Res.1999;47(1): 8-17.
[16]Cai Q,Yang J,Bei J,et al. A novel porous cells scaffold made of polylactide-dextran blend by combining phase-separation and particle-leaching techniques. Biomaterials. 2002;23(23):4483-4492.
[17]Bose S,Vahabzadeh S,Bandyopadhyay A.Bone tissue engineering using 3D printing. Mater Today. 2013; 16(12):496-504.
[18]Cox SC,Thornby JA,Gibbons GJ,et al.3D printing of porous hydroxyapatite scafolds intended for use in bone tissue engineering applications.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl.2015;47:237-247.
[19]Castilho M,Rodrigues J,Pires I,et al.Fabrication of individual alginate-TCP scaffolds for bone tissue engineering by means of powder printing. Biofabrication. 2015;7(1):015004.
[20]Tarafder S,Balla VK,Davies NM,et al. Microwave-sintered 3D printed tricalcium phosphate scaffolds for bone tissue engineerig.J Tissue Eng Regen Med.2013;7(8):631-641.
[21]Inzana JA,Olvera D,Fuller SM,et al.3D printing of composite calcium phosphate and collagen scaffolds for bone regeneration.Biomaterials. 2014;35(13):4026-4034.
[22]Wu C,Fan W,Zhou Y,et al.3D-printing of highly uniform CaSiO3 ceramic scaffolds: preparation, characterization and in vivo osteogenesis.J Mater Chem.2012;22(24):12288-12295.
[23]Xu WK,Wang LY,Ling Y,et al.Enhancement of compressive strength and cytocompatibility using apatite coated hexagonal mesoporous silica/poly(lactic acid-glycolic acid) microsphere scaffolds for bone tissue engineering.Rsc Adv.2014; 4(26):13495-13501.
[24]法默.矿物的红外光谱[M]. 应育浦,汪寿松,李春庚,等译.北京:科学出版社,1982.
[25]方敏.纳米CaSiO3 发光材料的性能及特殊形貌研究[D].上海师范大学,2007.
[26]袁曦明,石岚,何应律,等.人工合成硅灰石的发光性质与发光机理的初步研究[J].地球科学: 中国地质大学学报, 1994,19(2):175-180.
[27]Quelch KJ,Melick R,Bingham PJ,et al.Chemical composition of human bone.Arch Oral Biol. 1983; 28(8):665-674.

引言

随着组织工程学的提出和发展，组织工程材料在临床上的优势日益显著，骨组织工程支架是目前临床应用最有前景的组织工程成果之一。理想的骨组织工程支架材料应当具备良好的生物相容性、合适的生物降解吸收性、合适的孔隙率和三维立体多孔结构、可控的三维外形、与置入部位组织的力学性能相匹配的机械强度及良好的加工性能等特点^[1]。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)被广泛用于骨组织工程支架材料，具有良好的生物相容性和降解性^[2-3]，但作为一种人工合成的高分子材料，其也有一定的缺陷，如本身的骨传导性较弱、降解产物偏酸性容易引起炎症反应及机械强度不够等^[4-5]。为了弥补PLGA的不足，将其与具有骨诱导性的无机生物陶瓷，如羟基磷灰石、生物玻璃、磷酸三钙、碳酸钙等复合，使其与人体骨结构和功能更为接近，是目前的研究热点^[6-8]。有研究表明，硅元素是促进新骨生成的媒介之一^[9]，能促进骨组织细胞的增殖和分化，硅酸钙粉体或陶瓷能够释放硅离子，在体外具有良好生物活性和诱导类骨羟基磷灰石沉积的能力^[10-11]，目前硅酸钙陶瓷已被作为新的骨修复生物陶瓷加以研究^[12-14]。

传统的组织工程支架制备方法主要有相分离法、气体发泡法、模板法、粒子沥滤法、颗粒烧结法、静电纺丝技术等，但上述方法一般只能制备孔径小于200 μm的支架，且有的支架几何形状不易精确控制、孔隙率小、孔隙之间的连通率不佳^[15-16]。随着制造业的不断发展，近几年出现的3D打印技术在很大程度上解决了传统支架制备技术的不足，它能够根据不同患者的需求制备个性化的支架材料，并能同时精确控制支架的几何外形和微观结构，在生物医学领域特别是组织工程应用具有独特的优势，因此受到广大研究学者们的青睐^[17-21]。

综上考虑，实验首先在PLGA微球中加入硅酸钙，制得了具有良好生物相容性和降解性的多孔PLGA/硅酸钙复合微球，然后采用生物3D打印设备3D-Bioplotter，利用熔融沉积制造的原理制备了具有三维连通多孔结构的PLGA支架；最后利用低温融合技术将PLGA/硅酸钙复合微球与PLGA支架结合起来，预期构建出一种具有良好生物相容性、降解性、机械强度和三维连通多孔结构的新型骨组织工程支架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计支架制备及观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年9月至2015年12月在华南理工大学国家人体组织功能重建工程技术研究中心完成。

1.3 材料 PLGA(共聚组分比例50∶50，相对分子质量31 000，济南岱罡生物工程有限公司)；聚乙烯醇1788型(醇解度87%-89%，上海阿拉丁试剂有限公司)；二氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；硅酸钠、硝酸钙(均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；CWF通用型马弗炉(英国CARBOLITE公司)；S312-90数显恒速搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；3D-Bioplotter生物打印机(德国Envision TEC公司)；101-A型数显电热鼓风干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司)；小鼠骨髓间充质干细胞(ATCC)；胎牛血清(Gibco澳洲)；DEME培养基、0.25%胰酶(Gibco)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；细胞培养箱、Thermo3001酶标仪(美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 PLGA/硅酸钙复合多孔支架的制备

PLGA/硅酸钙复合微球的制备：硅酸钙粉末采用化学沉淀法制备而成，具体方法参考文献[22]。将1 g PLGA溶解于5 mL二氯甲烷中，加入硅酸钙粉末(0，0.1，0.2，0.3 g)持续搅拌6 h，超声处理30 min，得到分散均匀的s/o乳液；将该s/o乳液注射至10 g/L聚乙烯醇溶液中，在280 r/min下持续搅拌12 h，使二氯甲烷挥发，乳化过程在室温进行；乳化结束后，收集粒径范围为100-300 μm的固化微球，并用去离子水反复冲洗5遍以上，除去微球表面残留的聚乙烯醇；然后冷冻干燥 48 h，得到多孔结构的PLGA/硅酸钙复合微球，放入干燥箱中储存备用。为了减少实验误差，除特别说明外，以下所用的PLGA/硅酸钙复合微球中的硅酸钙含量均为20%。

PLGA三维多孔支架的制备：利用计算机辅助设计(CAD)软件设计出长、宽、高分别为10 mm、10 mm、6 mm的三维支架模型，导入Bioplotter RP中进行分层处理；将1 g PLGA加入3D-Bioplotter生物打印机的高温不锈钢料筒中，升温至150 ℃至PLGA熔融，设置平台温度为室温，挤出压力为0.1 MPa，挤出速度6 mm/s，内部结构为0°和90°交错排列，选用直径为0.4 mm的针头，然后启动3D-Bioplotter将三维多孔结构的PLGA支架模型逐层打印成型。

PLGA/硅酸钙复合多孔支架的制备：将2.5 g PLGA/硅酸钙复合微球加入5 mL去离子水中，并轻轻振荡使复合微球完全浸湿并分散均匀，得到50%(w/v)的微球分散液；将PLGA三维多孔支架浸没于微球分散液中，并置于37 ℃、90 r/min的摇床中摇晃20 min，使微球均匀分散于支架三维多孔结构的空隙中；然后将支架放入50 ℃烘箱，24 h后取出，即得PLGA/硅酸钙复合多孔支架。

1.4.2 PLGA/硅酸钙复合微球的性能测试

组成成分分析：用X射线衍射分析复合微球中的无机组分：将样品置于玻璃载物台上后转移至荷兰帕纳科公司的Empyrean锐影X射线衍射仪中，利用Cu靶 Kα 射线以1 (°)/min速率扫描，扫描范围10°-70°。用傅里叶变换红外光谱仪进一步分析复合微球的化学组成：首先将样品与KBr一同研磨压成薄片，然后将薄片转移至德国Bruker公司VERCTOR-22型傅里叶变换红外光谱仪中扫描，扫描范围4 000-400 cm^-1，分辨率2 cm^-1。

形貌观察：用扫描电镜观察复合微球的表面形貌和内部结构。将微球浸没在OTC包埋剂中，用德国Leica公司的CM1900 Cryostat冷冻切片机于-20 ℃将微球切片，厚度为20 μm，去离子水洗去残留的包埋剂并收集微球，冷冻干燥48 h，然后将切片后的微球和未切片的微球分别用导电胶固定于载物台，喷金90 s后转移至德国蔡司公司的Merlin场发射扫描电镜中观察。

体外降解产物pH值测试：分别称取PLGA微球和PLGA/硅酸钙复合微球50 mg，浸没在装有10 mL PBS(pH=7.2)的离心管中，将离心管转移至90 r/min的37 ℃恒温恒湿摇床中，在设定时间点取出离心管，用上海雷磁新泾仪器公司的PHS-3C型精密pH计测量释放介质的pH值，样品重复数为3。

1.4.3 PLGA/硅酸钙复合多孔支架的性能测试

形貌观察：采用日本HiroX公司的7700型三维显微镜观察支架的宏观结构、纤维尺寸和孔径大小，扫描电镜观察支架表面的微观形貌。

孔隙特征分析：采用英国Metris公司的HARRIER HP23.4JX型Micro-CT对支架结构进行扫描重建，比较PLGA三维多孔支架与PLGA/硅酸钙复合多孔支架的孔径大小、孔径分布情况、孔隙率和孔隙连通率。将样品置于样品架上，扫描获取连续Micro-CT图像，获取二维片层灰度图后通过软件建立出三维支架模型图，利用灰度阈值确定支架的孔隙边界，计算支架的孔径大小、孔隙率和孔隙连通率，输出支架模型图和孔径分布图。

压缩强度测试：采用美国Instron公司的 5967型万能材料试验机测试支架的压缩性能，比较PLGA三维多孔支架与PLGA/硅酸钙复合多孔支架的压缩强度。将长、宽、高分别为10 mm、10 mm、6 mm的支架置于万能试验机平板的中心，以1 mm/min的恒定速率缓慢加压，记录力与位移的数据并转换成应力与应变，样品重复数为5。

1.4.4 体外细胞相容性测试分别测试小鼠骨髓间充质干细胞在PLGA/硅酸钙复合微球浸提液、PLGA三维多孔支架和PLGA/硅酸钙复合多孔支架上的增殖情况。

材料准备和消毒：参照国家标准GB/T 16886.12- 2005进行。将1.4 g PLGA微球和PLGA与硅酸钙质量比为1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3的PLGA/硅酸钙复合微球分别用体积分数75%乙醇溶液浸泡2 h，紫外光照射30 min消毒灭菌，然后用PBS洗涤5遍，浸泡于7 mL无血清培养基中，置于37 ℃、60 r/min摇床48 h，取上清液并按比例添加体积分数10%胎牛血清，即得微球浸提液。分别将长、宽、高为10 mm、10 mm、6 mm的传统热烧结法制备的PLGA微球支架，具体方法参考文献[23]。将3D-Bioplotter制备的PLGA三维多孔支架和PLGA/硅酸钙复合多孔支架用离心管装好密封，在15 kGy辐照剂量下用γ射线消毒处理。

细胞培养和种植：①用上述微球浸提液对骨髓间充质干细胞进行扩增。在96孔板中每孔加入100 μL (1×10⁸L^-1)细胞悬液，放入培养箱12 h，待细胞完全贴壁后将孔板中的培养基吸出，加入100 μL/孔上述微球浸提液，放入37 ℃、体积分数5%CO₂、95%湿度的培养箱中培养；②用含有体积分数10%胎牛血清的高糖DEME培养基对骨髓间充质干细胞进行扩增。将支架放入24孔板中，加入无血清培养基浸泡24 h后，将孔板中的培养基吸出，每孔加入200 μL(5×10⁸ L^-¹)细胞悬液，放入培养箱2 h，待大部分细胞黏附于支架上以后，每孔补充培养基至1 mL，将孔板放入37 ℃、体积分数5%CO₂、95%湿度的培养箱中培养。

CCK-8法检测细胞的增殖活性：①微球浸提液培养细胞：在预定时间点，将CCK-8原液用培养基按体积比1/10稀释得到工作液，吸去孔板中的培养基，每孔加入100 μL工作液，在培养箱中培养1 h后，轻微混匀，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸收值。②支架接种细胞：在预定时间点，将CCK-8原液用培养基按体积比1/10稀释得到工作液，吸去孔板中的培养基，每孔加入1 mL工作液浸没支架，在培养箱中培养2 h后，吸取 200 μL上清工作液至96孔板中，轻微混匀，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸收值。

1.5 主要观察指标 PLGA/CS复合微球的形貌特征、体外降解性能和细胞相容性；PLGA/CS复合多孔支架的形貌特征、孔隙结构、抗压强度和细胞相容性。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行数据统计学处理，计量数据用x(_)±s表示，组间比较采用完全随机化设计两独立样本的t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

人体的骨组织是一个非常复杂而精密的系统，在化学成分上，主要由有机物和无机物构成^[27]。有机相在成骨过程中扮演着重要的作用，其中约95%是Ⅰ型胶原，其余5%主要是蛋白多糖和少量非胶原蛋白；无机相的主要成分是纳米羟基磷灰石，可提供骨较好的力学强度。因此，将可降解的生物高分子材料和无机生物陶瓷复合起来制备的骨修复材料是骨组织工程研究的热点。PLGA是一种可降解和易加工的生物高分子材料，在组织工程领域已得到广泛应用，然而由于其降解产物呈酸性、机械强度不足和表面缺乏有利于细胞黏附的结合位点等缺陷，有必要对PLGA进行改性研究。有研究分别将生物活性玻璃、羟基磷灰石和壳聚糖颗粒加入PLGA微球支架中，得到的复合支架具有更高的生物活性；有研究将介孔硅与PLGA复合，制备的介孔硅/PLGA复合微球支架力学性能较纯PLGA微球支架有了很大的提升；有研究利用碳酸钙原位成孔法制备了表面有均匀开孔结构的PLGA/碳酸钙复合微球，证实了微球表面的微孔形貌有利于细胞黏附和增殖。硅酸钙陶瓷能够释放硅离子，具有良好的生物活性和降解性能，目前已被作为最具前景的骨修复生物陶瓷之一广泛研究。

骨支架作为骨组织再生的框架，为种子细胞提供生长环境，其孔径大小、孔隙率等参数直接影响细胞的生存、迁移、增殖和代谢功能，在组织工程中起着关键性的作用。有研究表明，当支架孔径大于300 μm时更有利于细胞的迁移和增殖；考虑成骨效应，小孔可提供低氧的环境诱导骨形成前的软骨生成，而大孔更有利于血管的生成和直接成骨。因此实验旨在构建一种梯度多级孔结构的骨组织工程支架，首先将硅酸钙陶瓷加入PLGA微球中，利用硅酸钙原位成孔制备了PLGA/硅酸钙多孔复合微球，其表面孔径为1-10 μm；然后采用3D-Bioplotter生物打印技术制备出三维连通多孔结构的PLGA支架，其平均孔径约为320 μm；最后利用低温融合技术将具有微孔表面的PLGA/硅酸钙复合微球和连通大孔结构的PLGA三维多孔支架结合起来，构建出一种梯度多级孔结构的新型骨组织工程支架。

PLGA/硅酸钙多孔复合微球利用乳液溶剂挥发法制备，其X射线衍射和红外图谱中都能观察到硅酸钙的特征峰，说明硅酸钙组分与PLGA微球成功复合；从扫描电镜图片中可以看出，PLGA/硅酸钙复合微球表面均匀分布着大量形状规整的1-10 μm的开放孔结构，且内部形成了较大空腔，这可能是由于在微球的制备过程中，硅酸钙能从外水相吸附水分，随着有机溶剂的挥发，油滴逐渐固化成微球，被吸附的水分所占的空间在微球干燥后形成表面孔隙；在搅拌的过程中，硅酸钙吸附的一部分水分可能被包裹到油滴内部，这些内水相逐渐融合，最终形成较大的内腔；通过测试其体外降解介质的pH值变化，说明硅酸钙组分可能中和一部分PLGA的酸性降解产物，从而缓解由于PLGA降解产物呈酸性引起的炎症反应。

PLGA/硅酸钙复合多孔支架是先采用3D-Bioplotter生物打印技术制备具有三维连通多孔结构的PLGA支架，然后用低温融合技术将粒径为100-300 μm的PLGA/硅酸钙多孔复合微球与之结合构建的具有多级孔结构的三维支架。PLGA/硅酸钙复合多孔支架在制备过程中出现了体积收缩的现象，且它与PLGA三维多孔支架的纤维直径均大于打印针头的直径，其原因可能是，在使用3D-Bioplotter熔融挤出沉积法制备支架时，纤维从针头挤出后迅速冷却固化，残余应力导致纤维挤出胀大；在后期低温融合技术处理支架时，残余应力得到缓慢释放，从而导致支架体积回缩。相对于传统的组织工程支架制备方法，3D-Bioplotter具有可精确控制支架的几何形状和内部结构，制备出三维连通的大孔结构等优点，但却牺牲了支架的力学强度，通过与PLGA/硅酸钙多孔复合微球的结合，不仅支架的力学强度有了显著提高，同时还获得了梯度的多级孔结构，虽然孔隙率和平均孔径有所降低，但依然保持着接近100%的孔隙连通率。通过将BMSCs与支架共培养，细胞可在支架上稳定生长，说明该支架具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚乳酸-羟基乙酸共聚物/硅酸钙三维多孔骨组织工程支架的构建与性能

Construction and characteristics of poly(lactic-co-glycolic acid)/calcium silicate scaffolds with three-dimensional pores for bone tissue engineering

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[5]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[6]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[7]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[8]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[9]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[10]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[11]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[12]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[13]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[14]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[15]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.