2.1 前言 长期大量饮酒与股骨头缺血性坏死的发生之间的关系早已明确,且因饮酒导致股骨头坏死发病逐年上升[1-3]。内蒙古地处北方高寒地区,特殊的文化背景及饮食习惯,饮酒人群非常庞大,部分牧区人群每日饮酒,甚至以酒代饭,因饮酒所致股骨头坏死病例在日常诊疗中非常多见。故此,酒精作为诱因导致的股骨头坏死的发病已不容忽视。
多年来人们一直致力于研究酒精性股骨头缺血性坏死的发病机制,从酒精的细胞毒性、股骨头坏死的全身或局部变化,组织学、细胞学、病理学、免疫学、分子生物学、生物化学、遗传学、血液学等各个方面的研究提出了多种学说,包括脂肪代谢紊乱学说、酒精的细胞毒性学说、骨质疏松学说、骨髓基质细胞成脂分化学说、骨内高压学说、基因多态性学说、血管内凝血学说等等,目前具体发病机制不详[6-10]。尽管关于酒精性股骨头缺血性坏死存在多种假说,但是到目前为止没有一种学说能完全解释酒精性股骨头缺血性坏死发生发展的全部病理过程,多数专家认同酒精性股骨头坏死为多种因素共同作用的结果。
2.2 背景研究 血管内凝血学说目前已经公认为所有非创伤性股骨头坏死的共同通路。股骨头内微循环障碍是股骨头缺血性坏死的病理基础已得到多数专家的认可,在大量股骨头坏死标本中检测到微血栓也证实了这一点,而血管内皮损伤是血管内血栓形成的中心环节[11-16]。
目前研究证实,血管内皮损伤后可释放一种膜性囊泡状物质,将其定义为细胞膜微粒[13]。细胞膜微粒由磷脂和蛋白构成,直径在0.1-1 μm,主要由血小板和内皮细胞释放。细胞膜微粒起源不同,作用不同:CD54由内皮源性微粒特异表达,CD31由血小板及内皮细胞源性微粒共同表达;CD31、CD54可损伤血管内皮细胞,启动内源性凝血,影响血管的舒张功能; CD31表面富含血小板因子、组织因子和黏附因子,可以黏附于暴露的内皮下胶原;同时CD31还含有凝血因子,可为凝血酶原的激活提供更大的催化面积。因此细胞膜微粒CD31、CD54可通过介导血管炎症反应、促凝、影响血管舒缩及促进血管内皮损伤导致股骨头内微血管损伤[17-20]。那么细胞膜微粒是否同样参与股骨头内血栓形成呢?细胞膜微粒是否可以作为一种早期筛查股骨头坏死的敏感指标呢?是否有一种药物通过抑制微粒的产生预防股骨头坏死呢?
文献已证实细胞膜微粒CD31、CD54在激素性股骨头坏死中发挥重要作用。如郑敏哲等[21]的体外细胞学实验发现,激素可刺激内皮细胞产生细胞膜微粒,进而破坏内皮细胞之间的连接,导致内皮细胞通透性增高,降低血管稳定性,进一步引起股骨头缺血坏死。吴志宏等[13]报道大剂量糖皮质激素可使兔体内血小板和内皮细胞源性膜微粒数量显著增加,干预药物能够抑制微粒的产生,或许有助于预防或避免激素诱发股骨头缺血坏死的发生。康鹏德等[22]则指出,应用大剂量糖皮质激素后兔体内血小板和内皮细胞源性膜微粒(CD31、CD54、CD62E)数量增加,这可能是激素诱发血液高凝易栓、导致股骨头缺血坏死发生的原因之一,抑制微粒的产生或许有助于预防或避免激素诱发股骨头缺血坏死的发生。但是,目前尚未见微粒与酒精性股骨头缺血性坏死相关性的研究。
2.3 前期实验介绍 从2000年开始,课题组一直致力于研究非创伤性股骨头坏死的发病机制研究。2001年进一步证实内蒙古自治区科委自然科学基金资助课题“前凝血状态下应用激素导致骨坏死的实验研究”,并在动物股骨头内发现大量血栓形成,随后陆续发表多篇文献证实。近年,课题组对酒精性股骨头坏死的研究也取得进展,证实一些血管炎性递质参与酒精性股骨头血管损伤,从而导致股骨头坏死[23]。
前期实验已经通过长期灌胃烈性白酒模拟人类饮酒,成功建立了酒精性股骨头缺血坏死大鼠模型,证实长期摄入乙醇可导致大鼠股骨头内微血管内皮损伤,局部微循环供血异常,诱发股骨头缺血性坏死,且坏死程度与乙醇累积摄入量相关。
2.4 研究的理论依据 近年国内外学者对酒精性股骨头缺血性坏死机制研究热点为血管内凝血学说,微粒作为检测血管损伤及血栓形成的一种新的标记物正成为共识[24-26]。微粒通过损伤的血管内皮细胞释放后,通过介导血管炎症反应、抑制血管的收缩、启动凝血等多种途径导致血栓形成[27-28]。已有学者证实其在激素性股骨头坏死中发挥重要作用。课题首次提出微粒是否与酒精性股骨头坏死相关,并通过制作酒精性股骨头坏死大鼠模型,检测饮酒前后大鼠血清中细胞膜微粒CD31、CD54的变化,结合病理学染色观察股骨头内血管损伤及血栓形成情况,探讨细胞膜微粒在酒精性股骨头坏死中的作用。更加深入探讨酒精性股骨头坏死发病机制,对其早期诊断、早期治疗提供新的理论依据,可能为其治疗提供一种新的靶点。
3 研究目的 Study purpose
3.1 主要目的 ①研究细胞膜微粒CD31、CD54是否与血管内皮损伤及血栓形成相关;②探讨细胞膜微粒CD31、CD54在酒精性股骨头坏死中的作用。
3.2 次要目的 证实长期大量饮酒可导致大鼠股骨头缺血性坏死。
4 动物的选择 Animal selection
选择成年健康雄性Wistar大鼠,鼠龄四五个月,体质量(240±30) g,由内蒙古大学动物实验研究中心提供,许可证号:SCXK(蒙)2002-0001。所有Wistar大鼠体型正常,健康状况良好,排除健康状况不良,不活泼,有发烧、腹泻等症状者。
5 实验方法 Experimental methods
5.1 酒精性股骨头缺血性坏死大鼠模型建立 Wistar大鼠灌胃给予46度烈性白酒10 mL/kg,1次/d,连续6个月。
5.2 分组处理及取材 雄性Wistar大鼠随机分为2组,模型组连续6个月灌胃给予烈性白酒制备酒精性股骨头缺血性坏死模型,空白对照组给予等量生理盐水(10 mL/kg, 1次/d,连续6个月)。每个月2组各随机取6只大鼠,分批取血后处死,取下双侧股骨头进行各项检测。
5.3 指标检测
5.3.1 血清中细胞膜微粒CD31、CD54检测 每月两组各取血4 mL入抗凝管,取血后2 h内分次离心,获得富含微粒血浆,加入抗体,常温孵育20 min,流式细胞仪检测CD31、CD54含量。
5.3.2 股骨头空骨陷窝率 将所取双侧股骨头,用40 g/L多聚甲醛(pH=7.2)固定24 h,10%乙二胺四乙酸(EDTA,pH 7.4)脱钙8周,沿股骨头冠状面切片,石蜡包埋切片,厚度5 μm。然后作苏木精-伊红染色,光镜下观察组织形态学变化,计数空骨陷窝率,确定股骨头坏死情况。
5.3.3 微血管损伤情况 股骨头固定、脱钙、石蜡包埋切片后,按相应步骤进行Verhoeff 氏染色,随机抽取每张切片5个视野,观察动、静脉的各层结构及血管内皮细胞的形态,比较血管损伤阳性率。
5.3.4 微血栓检测 股骨头固定、脱钙、石蜡包埋切片后,按相应步骤进行MSB微血栓染色。每组在显微镜下连续观察50个视野,计数微血栓数量。
6 研究设计 Study protocol
6.1 研究设计概要 随机分组干预,动物体内实验。
6.2 实验计划 实验计划解决3个问题:①证实长期大量饮酒可导致大鼠体内细胞膜微粒CD31、CD54含量增加,并与酒精摄入量呈正相关;②证实酒精性股骨头坏死主要原因为血管内皮损伤及微血栓形成,进一步揭示酒精性股骨头坏死发病机制;③证实细胞膜微粒CD31、CD54参与酒精性股骨头坏死发病,从而为酒精性股骨头坏死的治疗提供新的靶点。
6.3 实验步骤
(1)建立酒精性股骨头缺血性坏死大鼠模型。
(2)流式细胞仪检测血清细胞膜微粒CD31、CD54含量。
(3)光镜下组织形态学观察,计数股骨头空骨陷窝,确定股骨头坏死情况。
(4)进行Verhoeff 氏染色,观察股骨头血管内皮损伤情况。
(5)进行MSB微血栓染色,观察微血栓。
6.4 实验动物脱落情况 在实验过程中有大鼠死亡脱落者,记录并分析原因,不再补足动物数量。
6.5 技术路线图 见图1。
7 指标与观察 Outcome measurement
7.1 主要观察指标 ①血清细胞膜微粒CD31、CD54水平;②股骨头空骨陷窝率;③股骨头动静脉血管损伤阳性率;④股骨头微血栓数。
7.2 次要观察指标 细胞膜微粒CD31、CD54水平与股骨头坏死、血管内皮损伤及微血栓的相关性。
7.3 实验观察指标一览表 见表1。
8 统计方法 Statistical analysis
8.1 研究假设 所有假设检验均为双侧检验,P < 0.05认为差异有显著性意义。
8.2 样本量 根据预实验结果每组大鼠数量定为40只。
8.3 实验分析 应用SPSS 13.0统计学软件完成数据统计分析,计量资料(包括细胞膜微粒CD31、CD54水平;股骨头空骨陷窝率;股骨头动静脉血管损伤阳性率及股骨头微血栓数)用x±s表示,采用方差分析。细胞膜微粒CD31、CD54水平与股骨头坏死、血管内皮损伤及微血栓的相关性分析采用线性相关分析。
8.4 统计分析 由不参与实验的专业统计人员完成统计工作。在所有数据录入、审核完毕后,统计人员应及时完成统计分析工作,交付实验的主要研究者,写出研究报告。
9.1 实验用试剂及仪器 46度白酒购自北京红星股份有限公司,由专人保存,每天实际用量均有相应的记录。相关实验试剂已与厂家及代理商取得联系;内蒙古医学院分子病理学实验室提供实验仪器。
9.2 动物的饲养 内蒙古大学提供质量合格的实验动物,专人饲养,标准饮食,分笼喂养,自由饮水,实行12 h/12 h间断照明,饲养环境温度控制在(24±2) ℃。