制备坐骨神经损伤大鼠模型：脊髓与局部神经电刺激的修复效果比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (49): 7982-7987.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.019

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制备坐骨神经损伤大鼠模型：脊髓与局部神经电刺激的修复效果比较

裴保安¹，訾金花¹，吴立生¹，张存华¹，陈允震²

¹临沂市人民医院创伤二科，山东省临沂市 276000；²山东大学附属齐鲁医院，山东省济南市 250012

收稿日期:2015-09-07 出版日期:2015-11-30 发布日期:2015-11-30
通讯作者: 吴立生，硕士，主任医师，硕士生导师，临沂市人民医院，山东省临沂市 276000
作者简介:裴保安，男，1984年生，山东省平邑县人，汉族，山东大学在读博士，主治医师，主要从事周围神经损伤研究。
基金资助:
临沂市科技攻关课题(201313026)

Establishing rat models of sciatic nerve injury: repair effect of spinal cord electrical stimulation versus local nerve electrical stimulation

Pei Bao-an¹, Zi Jin-hua¹, Wu Li-sheng¹, Zhang Cun-hua¹, Chen Yun-zhen²

¹Second Department of Trauma, Linyi People’s Hospital, Linyi 276000, Shandong Province, China; ²Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2015-09-07 Online:2015-11-30 Published:2015-11-30
Contact: Wu Li-sheng, Master, Chief physician, Master’s supervisor, Second Department of Trauma, Linyi People’s Hospital, Linyi 276000, Shandong Province, China
About author:Pei Bao-an, Studying for doctorate, Attending physician, Second Department of Trauma, Linyi People’s Hospital, Linyi 276000, Shandong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Research Project of Linyi City, China, No.201313026

摘要/Abstract

摘要：

背景：周围神经损伤后，损伤远端神经纤维出现Wallerian变性，近端相应节段脊髓出现神经元凋亡，导致轴突再生困难，影响神经损伤修复后的效果。目前针对周围神经损伤的研究大都局限在对损伤局部的修复与刺激，而对近端神经元胞体的研究相对较少。
目的：比较脊髓电刺激与局部电刺激治疗周围神经损伤的疗效，探讨脊髓电刺激促进周围神经损伤修复的机制。
方法：建立大鼠坐骨神经损伤模型，按随机数字表法分为3组，脊髓电刺激组、局部电刺激组和对照组各15只。测定造模后不同时期3组大鼠坐骨神经功能指数、小腿三头肌湿质量、脊髓神经元计数和超微结构、再生神经纤维髓鞘厚度及传导速度。
结果与结论：造模后2周，大鼠坐骨神经功能指数比较脊髓电刺激组>对照组，局部电刺激组>对照组(P < 0.05)；造模后4，6，8周，大鼠坐骨神经功能指数比较脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组(P < 0.05)。造模后2周，大鼠小腿三头肌湿重测定脊髓电刺激组>对照组，局部电刺激组>对照组(P < 0.05)；造模后4，8周，大鼠小腿三头肌湿质量比较脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组(P < 0.05)。造模后2，4，8周，各组大鼠脊髓前角神经元计数脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组(P < 0.05)。造模后4，8周，各组大鼠再生神经纤维髓鞘厚度、坐骨神经传导速度比较，脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组(P均< 0.05)。提示周围神经损伤后给予相应节段脊髓电刺激，可以有效预防中枢神经元凋亡，促进轴突再生及神经功能恢复，且效果优于局部电刺激。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 周围神经损伤动物模型, 周围神经, 电刺激, 脊髓损伤, 神经再生, 神经传导

Abstract:

BACKGROUND: After peripheral nerve injury, the nerve fibers distal to the injury site exhibited Wallerian degeneration, and neuronal apoptosis also appeared in the spinal cord segments proximal to the injury site, which inhibit axonal regeneration and affect the repair effect of nerve injury. At present, most researches of peripheral nerve injury are limited to the repair and stimulation of local injured nerve, and little is reported on neuron cell body in the nerve fibers proximal to the injury site.
OBJECTIVE: To compare the efficacy on the treatment of peripheral nerve injury between spinal cord electrical

stimulation and local nerve electrical stimulation, and investigate the mechanisms of promoting peripheral nerve injury repair by spinal cord electrical stimulation.
METHODS: Rats were divided into 3 groups according to the random number table: spinal cord electricalstimulation, local nerve electrical stimulation and control groups (n=15 rats/group). Rat models of sciatic nerve injury were established in three groups. Sciatic functional index, triceps wet weight, spinal cord neuron count and ultrastructure, myelin sheath thickness of regenerating nerve fibers and conduction velocity of rats in three groups were measured at different time points after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: At 2 weeks after modeling, rat sciatic functional index was significantly higher in the spinal cord electrical stimulation group or local nerve electrical stimulation group than in the control group (P < 0.05). At 4, 6 and 8 weeks after modeling, rat sciatic functional index was highest in the spinal cord electrical stimulation group, followed by the local nerve electrical stimulation group, and lowest in the control group (P < 0.05). At 2 weeks after modeling, rat triceps wet weight was significantly greater in the spinal cord electrical stimulation group or local nerve electrical stimulation group than in the control group (P < 0.05). At 4 and 8 weeks after modeling, rat triceps wet weight was highest in the spinal cord electrical stimulation group, followed by the local nerve electrical stimulation group, and lowest in the control group (P < 0.05). At 2, 4 and 8 weeks after modeling, spinal cord anterior horn neuron counts were highest in the spinal cord stimulation group, followed by the local nerve electrical stimulation group, and lowest in the control group (P < 0.05). At 4 and 8 weeks after modeling, myelin sheath thickness of regenerating nerve fibers and conduction velocity of sciatic nerve were highest in the spinal cord electrical stimulation group, followed by the local nerve electrical stimulation group, and lowest in the control group (all P < 0.05). These results suggest that electrical stimulation to the corresponding spinal cord segments after peripheral nerve injury can effectively prevent neuronal apoptosis in the central nervous system, promote axonal regeneration and neurological function recovery, and the results are better than those produced by local nerve electrical stimulation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

裴保安，訾金花，吴立生，张存华，陈允震. 制备坐骨神经损伤大鼠模型：脊髓与局部神经电刺激的修复效果比较[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7982-7987.

Pei Bao-an, Zi Jin-hua, Wu Li-sheng, Zhang Cun-hua, Chen Yun-zhen. Establishing rat models of sciatic nerve injury: repair effect of spinal cord electrical stimulation versus local nerve electrical stimulation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7982-7987.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠45只，分为3组，每组15只，其中脊髓电刺激组有1只出现感染，影响肢体功能评价，予以重新造模，补齐脊髓电刺激组大鼠。局部电刺激组与对照组大鼠全部进入结果分析。
2.2 坐骨神经损伤模型方法的改进既往的坐骨神经损伤模型多为切除约10 mm的神经纤维后，将神经纤维远近端倒置直接吻合，但由于坐骨神经为混合性神经，直接的外膜吻合，常常导致感觉、运动神经纤维的对接异常，影响治疗效果，且模型的统一性较差。本实验采取将神经段端旷置的方法，利用神经纤维组织的趋向性，使感觉、运动纤维准确吻合，且塑胶管套限制了瘢痕组织的长入，取得了良好的实验结果。采取此方法，模型的稳定性、同一性、重复性均较传统的造模方法有了明显的提高。
2.3 SFI 计算造模后2周，大鼠SFI比较脊髓电刺激组>对照组，局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表1)，但脊髓电刺激组、局部电刺激组两组差异无显著性意义(P > 0.05，表1)。造模后4，6，8周，大鼠SFI比较脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表1)。

2.4 小腿三头肌湿质量测定造模后2周，大鼠小腿三头肌湿质量测定脊髓电刺激组>对照组，局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表2)，但脊髓电刺激组、局部电刺激组两组差异无显著性意义(P > 0.05，表2)。造模后4，8周，大鼠小腿三头肌湿质量比较脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表2)。

2.5 脊髓前角神经元的电镜观察脊髓电刺激组造模后4周神经元胞体内各种细胞器排列规则(图2A)；造模后8周，神经元细胞核凹陷和异染色质增多，但核膜基本完整，胞体内线粒体和内质网等结构基本正常(图2B)。局部电刺激组造模后4周神经元胞体内线粒体和内质网等结构基本正常，细胞质内的细胞器排列规则，核膜基本完整，但有核凹陷和异染色质增多等(图2C)，造模后8周神经元萎缩，核膜不连续，核凹陷和异染色质增多进一步加重(图2D)。对照组造模后4周神经元萎缩，细胞质有空泡化现象和脂质体出现，有的线粒体嵴断裂，核膜不连续，核异形性明显，异染色质增多(图2E)；造模后8周神经元萎缩明显，并出现毒纤毛细胞(图2F)。

2.6 脊髓前角神经元计数造模后2，4，8周，各组大鼠脊髓前角神经元计数脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表3)。

2.7 再生坐骨神经纤维电镜观察电镜下可见脊髓电刺激组有髓神经纤维数目较多，髓鞘厚度较厚，结构均匀，未见板层间裂开及空泡形成(图3A，B)；局部电刺激组有髓神经纤维数目相对较少，髓鞘厚度较薄，局部间质有轻度水肿现象(图3C，D)；对照组有髓神经纤维数目少，髓鞘形成不完善、厚度薄、可见板层裂开，间质有重度水肿现象(图3E，F)。

2.8 再生坐骨神经纤维髓鞘厚度的测量造模后4，8周，各组大鼠再生神经纤维髓鞘厚度测量，脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01，表4)。

2.9 坐骨神经传导速度测定造模后4，8周，各组大鼠坐骨神经传导速度测定，脊髓电刺激组>局部电刺激组>对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05，表5)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，于2013年12月至2014年10月在山东大学附属齐鲁医院及临沂市人民医院动物实验室完成。
1.2 材料 45只8周龄SD大鼠，雄性，体质量200-230 g，由山东大学医学院动物试验中心SPF级动物实验室提供，许可证号：SCXK(鲁)2010003，按随机数字表法分为3组，即脊髓电刺激组、局部电刺激组和对照组(n=15)。

1.3 造模方法
制备坐骨神经损伤模型：各组大鼠均用10%的水合氯醛(3 mL/kg)经腹膜腔内注射麻醉成功后，取右后肢外侧纵向切口，显露坐骨神经，在坐骨结节处切除长约5 mm的神经纤维，然后在显微镜下用11-0尼龙线将近远端神经外膜缝合至橡胶套管上，间断缝合三至四针，中间缺损的神经纤维给予旷置(图1)。

各组大鼠处理措施：脊髓电刺激组大鼠取后正中切口,在T10-L3椎板及棘突间钝性剥离，除椎板，将自制电刺激极片置入T10，L3椎板下硬膜外侧，固定。用低周波治疗仪来提供电刺激，电流强度6.5 mA/h，刺激频率15 Hz，2次/d，15 min/次，共8周。局部电刺激组大鼠用柱状电针分别置于损伤神经近远端，低周波治疗仪来提供电刺激，电流强度2.5 mA/h，刺激频率5 Hz，2次/d，15 min/次，共8周。对照组未提供电刺激。
1.4 指标测定
坐骨神经功能指数(SFI)测定：造模后第2，4，6，8周各组取5只大鼠，自制大鼠足行走箱，长50 cm，宽15 cm，受试鼠双足蘸碳素墨水，选择爬行过程中留下的四至五个足印，实验侧足(E)和正常侧足(N)，测量以下3个变量：①足印长度(PL)。②足趾宽度(TW)，即第一趾到第五趾连线距离。③中间足趾距离(IT)，即第二趾到第四趾连线距离。将上述3个变量带入Bain公式计算SFI，SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+ 109.5(ETW-NTW)/NTW+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。SFI正常为0，-100表示神经完全离断。
小腿三头肌湿质量：造模后第2，4，8周各组取5只大鼠，在测定神经传导速度之后处死，紧贴骨面取出小腿三头肌，剔除表面结蹄组织，滤纸吸干表面血液后，置于天枰称重。
脊髓神经元计数和超微结构观察：
大鼠标本的取材：造模后第2，4，8周各组取5只大鼠处死后，剪开胸腔，确定右心房，生理盐水(内加肝素500 IU)约200 mL自左心室灌注，至右心房流出液为清澈液体后，改用4 g/L的多聚甲醛缓冲液进行灌注，灌注量约为 200 mL。自原手术入路进入，依次取腰骶段脊髓标本(从已固定好的大鼠脊髓标本上截取L5节段，在损伤侧脊髓的腹外侧切小口作标记)以及坐骨神经。将用于电镜观察的标本用30%蔗糖和40 g/L多聚甲醛混合液固定，4 ℃保存备用。用于苏木精-伊红染色的标本放入40 g/L多聚甲醛中固定，4 ℃保存备用。光镜下进行脊髓神经元神经元计数：将各组脊髓标本，包埋后，连续切片，苏木精-伊红染色，随机选取8个400倍的光学显微镜下计数神经元数目。
电镜观察各组脊髓神经元的超微结构：将各组脊髓标本，分别定向包埋、超薄切片、经枸橼酸铅染色后，用JEM21200E透射电子显微镜分别观察其超微结构变化。
电镜观察再生坐骨神经的超微结构并测量神经纤维髓鞘厚度：造模后第2，4，8周各组取5只固定的坐骨神经标本，定向包埋、超薄切片、经枸橼酸铅染色后在JEM21200E透射电子显微镜下观察新生坐骨神经纤维的生长情况。5000倍下，随机选取8条有髓鞘的神经纤维，以通过神经纤维中心的水平线、垂直线与髓鞘交点处4个点的髓鞘厚度的平均值，作为髓鞘厚度[16]。
坐骨神经传导速度测定：造模后第4，8周各组取5只大鼠在处死前，游离右侧坐骨神经，钩状电极分别刺激大鼠损伤神经的远近端。刺激强度比阈强度增加30%，频率 1 Hz，波宽1 ms，记录近远两刺激点的潜伏期，测量两点间距，计算其传导速度。传导速度(m/s)=距离(mm)/[近端神经潜伏期(ms)-远端神经潜伏(ms)]。
1.5 主要观察指标 ①脊髓神经元计数及超微结构。②再生坐骨神经纤维超微结构和髓鞘厚度。③坐骨神经传导速度。
1.6 统计学分析实验数据以x(_)±s表示，SPSS 13.0统计软件进行分析，各组数据的处理采用单因素方差分析进行比较，若差异有显著性意义，则在采用LSD-t 法进行组间两两比较，P < 0.05作为显著性差异界值。

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讨论

研究电刺激对周围神经损伤的影响，需要实验模型有较高的同一性、稳定性、重复性，并尽可能的符合临床特征。经典的坐骨神经损伤模型多为切除或切断神经纤维后，直接神经外膜吻合^[17]。但由于坐骨神经为混合神经纤维，常常导致感觉、运动神经纤维的对接异常，影响治疗效果。近年来，越来越多的研究证实，神经纤维损伤后断端释放的炎性因子，可以引导不同性质的神经纤维组织在一定的距离内准确吻合^[18]。本实验中坐骨神经损伤模型的建立就是应用此理论，并将神经断端旷置与塑胶管套，既充分利用神经纤维的趋向性，又可以限制了瘢痕组织的长入，取得了良好的实验结果。
周围神经损伤可以引起相应节段的神经元胞体凋亡，这是由于轴突损伤后，逆行运输中断，神经元胞体不能从靶器官获得神经营养物质^[19-20]；同时细胞电生理改变导致Ca2+内流，破坏了胞内Ca2+的内环境稳定，使蛋白水解酶及一些核酸内切酶激活，触发一系列免疫反应，最终导致神经元凋亡^[7]。其中线粒体的改变起着重要作用，bax和bcl-2的基因表达水平异常可以改变线粒体膜的通透性，触发细胞凋亡的发生^[6]。治疗周围神经损伤，目标是及时恢复神经的连续性和完整性，促进轴突及髓鞘再生，避免神经元凋亡，防止神经支配肌肉或器官萎缩并促进其功能恢复，而胞体数量的减少，无疑会影响神经损伤后功能的恢复。因此，有效预防周围神经损伤后中枢神经元胞体的凋亡是促进神经再生、最大限度地恢复神经功能的关键。
本实验结果证实，局部应用电刺激与脊髓电刺激对于周围神经损伤后，相应节段脊髓神经元的保护、轴突的再生具有保护作用；而脊髓电刺激效果更为确切，无论从神经元超微结构观察还是神经元计数都优于局部电刺激组，并且有效的促进了神经纤维的再生，预防肌肉的失神经萎缩。其可能的机制：①电场具有极化作用，可以使一些带电荷的神经营养物质特别是带正电荷的神经生长因子聚集。研究表明，成熟神经元，感觉神经元需要神经生长因子的营养支持^[21-22]，并且电刺激可促使脊髓Ⅱ板层，背核和备用背根的背根节中神经生长因子阳性神经元数量增多且此效应随时间增长而加强^[23]。②电场能引起离子运动，调节细胞内、外离子的分布，减轻Ca2+内流，稳定细胞内环境，阻断神经元凋亡^[24-25]。③扩张小动脉，改善局部血运^[26-27]，电场通过轴突反射和节段反射引起血管扩张，还能电解微量组织蛋白，释放血管活性肽，扩张小动脉改善局部血运，这对于改善神经元损伤后的细胞内、外微环境具有一定意义。④调节基因表达。电场对坐骨神经切断后脊髓运动神经元抑凋亡的bcl-2基因表达增强，促凋亡的bax基因表达减弱^[28-29]。电刺激可以调节免疫、造血、内分泌等作用于非神经组织的功能，如促进肥大细胞的存活、释放组胺等多种活性物质，影响淋巴细胞的增殖分化等等^[30]。总之，脊髓电刺激可以通过以上机制减轻周围神经损伤对中枢神经元的损害，阻断神经元胞体的凋亡发生，从而促进轴突再生。
本实验结果表明，周围神经损伤后，可引发神经断端近侧的神经元胞体凋亡；电刺激可以促进周围神经损伤后的修复，保护近端脊髓神经元的结构和功能；其中脊髓电刺激对预防神经元胞体凋亡，促进周围神经轴突的再生，预防周围神经损伤后肌肉的失神经萎缩效果更佳，为临床治疗周围神经损伤提供了新的治疗理念。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

制备坐骨神经损伤大鼠模型：脊髓与局部神经电刺激的修复效果比较

Establishing rat models of sciatic nerve injury: repair effect of spinal cord electrical stimulation versus local nerve electrical stimulation

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