面神经损伤模型中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶相关蛋白表达与损伤相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (27): 4362-4367.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.016

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面神经损伤模型中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶相关蛋白表达与损伤相关性

魏海刚¹，李蜀光¹，陈玉婷¹，蔡超雄¹，许彪²

¹佛山市第二人民医院口腔颌面外科，广东省佛山市 528000；²昆明医学院附属口腔医院口腔颌面外科，云南省昆明市 650031

出版日期:2014-06-30 发布日期:2014-06-30
作者简介:魏海刚，男，1974年生，河南省南阳市人，汉族，2002年昆明医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事口腔颌面整形及面神经损伤的研究。
基金资助:
广东省医学科学技术研究基金资助(B2003144)；佛山市科技局医学专项基金立项(200508062)

Correlation between caspase regulatory gene expression and facial nerve injury in a facial nerve injury model

Wei Hai-gang¹, Li Shu-guang¹, Chen Yu-ting¹, Cai Chao-xiong¹, Xu Biao²

¹ Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Second People’s Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong Province, China; ²Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, Yunnan Province, China

Online:2014-06-30 Published:2014-06-30
About author:Wei Hai-gang, Master, Associate chief physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Second People’s Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong Province, China
Supported by:
Medical Science and Technology Research Fund of Guangdong Province, No. B2003144; Medical Foundation by Foshan Municipal Science and Technology Bureau, No. 200508062

摘要/Abstract

摘要：

背景：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在细胞凋亡中发挥着关键作用，但不同形式面神经损伤对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和8和cyto-c蛋白表达的影响及其相互关系，目前尚不清楚。
目的：构建大鼠面神经压榨伤及低位切断伤模型，观察面运动神经元的形态学改变和死亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和8及cyto-c的表达变化并分析其相关性。
方法：制作大鼠右侧面神经的压榨伤和低位切断伤模型，左侧为正常对照侧。用甲苯胺蓝染色及透射电镜观测面运动神经元形态学变化及其死亡情况，免疫组织化学法检测切断伤及压榨伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和8及cyto-c的表达变化。
结果与结论：面神经切断伤及压榨伤均可引起面运动神经元死亡，死亡形式以凋亡为主。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8，cyto-c蛋白表达阳性神经元分布于正常面神经核各亚核，切断伤组损伤侧细胞染色重于压榨伤组。损伤后3 d时各蛋白表达开始增强，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8表达于伤后14 d而cyto-c则于伤后 7 d时达到高峰。相关性分析结果显示：损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8和cyto-c蛋白表达变化与面神经损伤形式、损伤时间有关，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、cyto-c表达与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达相关。提示：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8，cyto-c可能参与了激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的过程。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应在面运动神经元凋亡过程中有重要作用。

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关键词: 实验动物, 组织构建, 面神经, 损伤, 细胞死亡, 调控基因, 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

Abstract:

BACKGROUND: Caspase plays a crucial role in the cell apoptosis, but the influence of different facial nerve injury on caspase 1, caspase 8, cyto-c protein expression and their correlation still remain unclear.
OBJECTIVE: To construct facial nerve crush or distal transection injury models, observe the morphological changes of facial motoneurons, investigate death gene caspase 3, caspase 8, cyto-c expression, and analyze their correlation.
METHODS: Facial nerve crush or distal transection injury model was established in the right facial nerve of rats, while the left facial nerve served as normal controls. We observed the morphology and the death of facial motoneurons with toluidine blue staining and transmission electron microscope. Expressions of caspase 3, caspase 8 and cyto-c proteins were studied by immunohistochemistry analysis following facial nerve injury.
RESULTS AND CONCLUSION: Both facial nerve distal transection and crush injury resulted in the death of
facial motoneurons, and the death pattern was mainly apoptosis. Caspase 3, caspase 8 and cyto-c protein expressions were observed in the subnucleus of normal rat facial nucleus. Cells of the distal transection group were stained more intensely than that of crush group. Expressions of these proteins began to increase at 3 days after the injuries. Caspase 3 and caspase 8 protein expression peaked at 14 days, whereas cyto-c protein expression peaked at 7 days after the injuries. Expressions of caspase 3, caspase 8 and cyto-c proteins were correlated with facial nerve injury type and injury time. Expressions of caspase 8 and cyto-c protein were correlated with expression of caspase 3 protein. The findings indicate that, caspase 8 and cyto-c contribute to activate caspase 3, and caspase cascade reaction plays an important role in the apoptosis of facial motoneurons.

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Key words: facial nerve, cell death, caspases, gene

中图分类号:

R318

魏海刚，李蜀光，陈玉婷，蔡超雄，许彪. 面神经损伤模型中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶相关蛋白表达与损伤相关性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(27): 4362-4367.

Wei Hai-gang, Li Shu-guang, Chen Yu-ting, Cai Chao-xiong, Xu Biao. Correlation between caspase regulatory gene expression and facial nerve injury in a facial nerve injury model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(27): 4362-4367.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠98只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组大鼠造模后大体观察结果损伤后1周时，所有动物进食、活动正常，损伤侧触须集中伸直并向后伸展，完全不能抖动，呈现完全性面瘫。损伤后2周时，压榨伤组大鼠损伤侧触须在完全性面瘫基础上，触须能部分抖动。切断伤组动物的触须仍完全不能抖动。损伤后4及6周时，压榨伤组大鼠的面瘫症状基本完全恢复，触须回到正常位置，抖动基本与左侧一致。切断伤组动物损伤侧触须仅出现轻微抖动。

2.3 各组大鼠面运动神经元光镜观察结果面神经低位断裂伤及压榨伤均可引起面运动神经元死亡，损伤后28 d时达到死亡高峰，死亡率分别为51%和28%。低位断裂伤组面运动神经元死亡率明显高于压榨伤组。

2.4 各组大鼠面运动神经元透射电镜观察结果正常面神经核团中面运动神经元胞体中央有大而圆的细胞核，常染色质丰富，絮状分布，核异染色质少，着色浅，细胞器正常。面神经损伤后，无论是断裂伤组或是压榨伤组，均可见到运动神经元胞体缩小呈固缩状态，胞核皱缩，DNA浓缩、核不规则变形，保存的细胞器胞质浓缩和典型凋亡细胞的膜出泡现象，细胞器正常，也符合凋亡细胞特征，而不象坏死细胞首先表现为细胞体破坏，胞膜破裂，胞浆外溢，溶酶体释放，引起周围组织炎症反应。断裂伤组面运动神经元细胞损伤程度较压榨伤组严重^[1]。

2.5 各组大鼠面运动神经元死亡相关基因caspase 3、caspase 8、cyto-c的表达：免疫组织化学及图像分析结果光镜下caspase 3，caspase 8和cyto-c蛋白表达均定位于细胞胞浆，偶有胞核着色，呈色为棕褐色。除神经元细胞外，胶质细胞也有着色。损伤后不同时期各蛋白表达(图1)。

2.6 大鼠面神经损伤后面神经核团阳性单位值(Pu)右左侧比值(R/L)的动态观察切片经图像分析仪分析处理，计算出右左侧阳性单位值(Pu)之比(R/L)，其表达变化(表1)。

由表1可以看出：面神经损伤后，caspase 3，8和cyto-c蛋白表达增强。损伤后3 d时，caspase 3，8表达略增强 (P > 0.05)，cyto-c表达增强明显(P < 0.05)。损伤后14 d时，caspase 3，8蛋白表达增强达到高峰，而cyto-c蛋白表达则于损伤后7 d时达到高峰。损伤后28 d时，各蛋白表达逐渐恢复至对照侧水平(P > 0.05)。

2.7 大鼠面神经损伤后caspase 3，caspase 8和cyto-c蛋白表达的相关性分析相关性分析结果显示：①面神经损伤后各蛋白表达与神经损伤形式有关(相关系数r 的显著性概率均为P < 0.01)。②面神经切断伤组，caspase 8， cyto-c蛋白表达与caspase 3蛋白表达有关(相关系数r 的显著性概率分别为P < 0.01， P。面神经压榨伤组，caspase 8蛋白表达与caspase 3蛋白表达有关(相关系数r的显著性概率P < 0.01，表2)。 < 0.05)

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引言

在啮齿目动物，面神经轴突损伤是体内研究凋亡性细胞死亡分子机制的一个便利模型。近来研究表明面神经损伤后面运动神经元主要以凋亡方式发生死亡^[1-2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡中发挥着关键作用，因为已明确这个家族的一些成员参与了细胞死亡的执行阶段。Caspases首先以非活性的前体形式被合成，随后被一系列细胞刺激事件所引起的蛋白水解作用激活，现已明确这个家族的一些成员参与了细胞死亡的执行阶段^[3-6]。但不同形式面神经损伤对caspase 3、8和cyto-c蛋白表达的影响及其相互关系，目前尚不清楚。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程，caspase在此过程中发挥着重要作用，是所有细胞死亡的基本机制^[7-8]。活化的caspase 3被看作是细胞凋亡早期的生化指标，会导致蛋白酶级联切割效应放大，最终使细胞走向死亡^[5]。正常情况下，胞质中caspase 3以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡时才被激活为有活性的caspase 3。Cyto-c，caspase 8对其活化起着重要作用^[4^，^6]：即一条是由DD(death domain)介导的，将procaspase 8募集到Fas(CD95)、TNFR-1、DR3等受体复合物途径，使procaspase 8自我水解活化，形成活性的caspase 8，后者再激活caspase 3，6，7等；另一条途径则由cyto-c介导，细胞内外各种死亡信号可诱导线粒体膜电位改变，形成bax通道，释放出cyto-c与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合，使Apaf-1发生寡聚化，再与procaspase 9结合形成cyto-c-Apaf-1-procaspase 9“凋亡体”，从而使procaspase 9活化并激活下游其他的caspase。作者利用成年SD大鼠的面神经低位切断伤和压榨伤模型，观察两种损伤形式引起面运动神经元的形态学变化；以及损伤后caspase 3、8和cyto-c蛋白的表达变化。探讨面神经损伤后面运动神经元死亡机制及caspase级联反应在其中的作用，以期减少面运动神经元死亡、延长临床神经修复的时间窗。

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材料方法

设计：随机对照和同体对照动物实验。

时间及地点：实验于2005年5月至2007年6月在中山医科大学(现中山大学)完成。

材料：

实验动物及分组：成年雄性SD大鼠98只，体质量200-260 g，由中山医科大学动物实验部提供，质量证书编号：0001143。随机将大鼠分为2大组，两组动物又随机分为术后饲养1，3，7，14，21，28和42 d 7小组。每小组各7只。

实验方法:

动物模型建立：按李蜀光等^[1]所用方法制作大鼠右侧面神经低位切断伤和压榨伤模型，左侧为正常对照。切断伤组和压榨伤组动物造模后分别饲养1，3，7，14，21，28和42 d。实验动物在预定时间行大体观察后，常规麻醉灌注取出脑桥组织收集于2.5%的戊二醛固定液中^[1]。

切片和染色：依据大鼠脑立体定位图谱^[6]，定位面神经核。脑组织经脱水、透明和石蜡包埋，石蜡切片机冠状位切片，片厚约5 μm，脱蜡至水，每间隔5张取1张，共得到6套切片，其中2套常规行苏木精-伊红染色，甲苯胺蓝染色，另4套用于免疫组织化学染色。用于透射电镜观察的标本，预固定于2.5%戊二醛溶液中，包埋块经半薄切片定位后做超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，JEM100CX透射电镜观察神经元细胞的超微结构变化。

神经元胞体计数：面神经核团内神经元计数在显微镜(×200)下进行。在200倍光镜下计数每组动物面神经核切片上损伤侧和未损伤侧凋亡运动神经元的总数。为了避免将胶质细胞计数在内，直径在8 μm以下的小细胞不在计数范围。计数每组动物面神经核区域神经核和核仁清晰、尼氏体染色的所有运动神经元总数。双核仁的校正未做。得出面神经核团运动神经元数目右左侧之比(R/L)，也即右侧面神经核团中运动神经元的存活率，死亡百分率则为1-R/L。面运动神经元的计数方法：胞体直径大小约20 μm，尼氏体染色均匀，或胞核、核仁明显位于胞体中央者均在计数范围内。

免疫组织化学染色：原理：采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液反应显色来测定细胞和组织中的抗原。实验以PBS代替一抗用做阴性对照。

结果判断与分析：caspase 3，caspase 8和cyto-c蛋白表达主要定位于细胞胞浆，偶有胞核着色，染色棕褐色为阳性细胞。所有切片经北京航空航天大学CMLAS多功能真彩色图像分析仪分析和处理，得出左右两侧面神经核团的阳性单位值Pu，Pu值大于5为阳性。为减少实验误差，计算出Pu值右/左侧之比(R/L)进行分析。

主要观察指标： ①大鼠造模后大体观察结果。②大鼠面运动神经元光镜观察及透射电镜观察结果。③大鼠面运动神经元死亡相关基因caspase 3、caspase 8、cyto-c的表达。④大鼠面神经损伤后面神经核团阳性单位值(Pu)右左侧比值(R/L)的动态观察。⑤大鼠面神经损伤后caspase 3，caspase 8和cyto-c蛋白表达的相关性分析。

统计学分析：实验结果用x(_)±s表示，统计学处理采用SPSS 10.0软件处理。组内比较用t 检验，组间比较用ANOVA方差分析，相关性检验用Pearson相关分析。以P < 0.05表示差异具有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

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讨论

3.1 面神经损伤后其运动神经元的形态学改变面神经损伤后其胞体从靶器官获取的神经营养因子减少，出现形态、代谢方面的逆行性改变，并不可避免地引起一定数量的运动神经元死亡^[2-3]。最近研究证明轴突断裂伤后，面神经运动神经元主要以凋亡方式死亡^[1-2]。本实验也支持这一观点，神经损伤后光镜、透射电镜观察：损伤侧面神经核团中运动神经元出现胞体缩小变圆，胞浆浓缩，染色加深，胞核也皱缩变小，轴突不明显但胞膜完整。这些形态学变化符合凋亡细胞的特征；无论是断裂伤组或是压榨伤组，均可见到运动神经元胞体缩小呈固缩状态，胞核皱缩，DNA浓缩、核不规则变形，保存的细胞器胞质浓缩和典型凋亡细胞的膜出泡现象，细胞器正常，也符合凋亡细胞特征，而不象坏死细胞首先表现为细胞体破坏，胞膜破裂，胞浆外溢，溶酶体释放，引起周围组织炎症反应。实验还观察到，面神经断裂伤组中面运动神经元损伤程度较压榨伤组严重。实验揭示了面神经损伤后其胞体死亡的动态变化，无疑为临床工作者对创伤性面瘫的治疗提供了理论依据。 3.2 面神经损伤后caspase 3，caspase 8和cyto-c蛋白的表达变化实验结果显示，不论是面神经切断伤或是压榨伤，损伤后7 d时，损伤侧面运动神经元中caspase 3蛋白表达均增强，并于术后14 d时达到高峰。而且其表达同损伤程度有关，损伤越重，表达增强越明显。Guarin等^[7]研究发现在bcl-2转基因的新生鼠和成年鼠中，尽管bcl-2转基因可以抑制面神经损伤所诱导的运动神经元凋亡，但神经元中caspase 3 mRNA及其蛋白表达依然增高，并与面运动神经元的死亡进程有关；作者认为bcl-2过表达并不能阻止caspase 3基因转录，而是作用于转录后水平，通过干预cyto-c释放和凋亡复合物而发挥作用。

Fujimura等^[8]用免疫组织化学方法检测到局灶性脑缺血后4h缺血区神经元胞浆内出现cyto-c，首次提供了线粒体中cyto-c释放到胞浆的证据，并提示cyto-c在缺血后的神经元凋亡中有重要作用。在鼠脑缺血模型中，还检测到caspase 3 mRNA及蛋白表达增强^[9]。Casha等^[10]研究发现大鼠脊髓损伤后，凋亡的神经胶质细胞中出现Fas和p75蛋白表达，同时发现在凋亡高峰时出现caspase 3和caspase 8的活化。在本实验中，面神经损伤后相应的神经元中caspase 8、cyto-c蛋白表达增强，且其变化与caspase 3的表达变化相关；各蛋白表达于损伤后42d时恢复至对照侧水平与面运动神经元的死亡时程一致，并与面神经损伤形式有关。这些结果初步证明caspase 8、cyto-c在激活caspase 3的过程中有重要作用，caspase级联反应参与了损伤所诱导的神经元凋亡过程。目前有研究表明，bcl-2家族可通过调节cyto-c的释放，从而调控cyto-c介导的caspase级联反应来抑制细胞凋亡^[5-6^，^8]。FLIP(FADD样caspase抑制蛋白)和ARC(含有CARD的凋亡抑制蛋白)，可与procaspase 8竞争结合FADD的结合位点或直接与多种procaspase结合而阻止其活化，从而抑制凋亡的发生^[5]。这也进一步支持了作者的观点。神经损伤后促进损伤神经元存活，抑制神经元退变，无疑将有助于提高神经再生的可能性。神经受损后成功再生的首要条件是保护神经细胞体，防止其不可逆性变性。目前针对caspase的治疗神经细胞凋亡的对策已逐渐受到人们的重视，并取得一些可喜的成果^{[11-19]

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