硅烷偶联剂对纯钛表面改性及细胞相容性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1864-1869.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.010

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硅烷偶联剂对纯钛表面改性及细胞相容性的影响

古丽巴努•依马木，徐国强，迪丽努尔•阿吉，古则丽阿依•阿不都卡德尔，刘佳怡，徐彬，李琦

新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-01-22 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 徐国强，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 通讯作者：迪丽努尔?阿吉，主任医师，副教授，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院口腔修复科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:古丽巴努?依马木，女，1986年生，维吾尔族，新疆维吾尔自治区库尔勒市人，新疆医科大学第一附属医院在读硕士，主要从事口腔修复科研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81060088)；新疆医科大学第一附属医院青年科研专项基金(2011QN03)；新疆维吾尔自治区重点实验室新疆医学动物模型研究实验室开放课题(XJDX1103-2011-08)

Silane coupler effects on titanium surface modification and biocompatibility

Gulbanu Ymam, Xu Guo-qiang, Dilnur Aji, Guzalay Abdukadr, Liu Jia-yi, Xu Bin, Li Qi

Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-01-22 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Xu Guo-qiang, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Corresponding author: Dilnur Aji, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Gulbanu Ymam, Studying for master’s degree, Department of Prosthodontics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81060088; the Scientific Research Fund for the Youth from the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2011QN03; the Open Project of Xinjiang Laboratory of Medical Animal Models, No. XJDX1103-2011-08

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内将硅烷偶联用于金属表面预处理的报道较少。
目的：对NaOH碱处理的钛片行硅烷化改性，观察硅烷膜的表面形貌与结构特征及细胞相容性。
方法：对制得的纯钛试件行NaOH碱处理，然后分别以8%，15%，33%浓度的KH-550硅烷偶联剂进行改性处理，以纯钛片和碱处理的钛片为对照组，采用扫描电镜观察改性处理钛片表面微观形貌，采用能谱仪分析改性处理钛片表面的成分。将纯钛片、碱处理的钛片及不同浓度KH-550硅烷偶联剂改性处理的钛片分别与犬骨髓间充质干细胞共培养，观察材料表面细胞的形态及黏附。
结果与结论：硅烷膜由许多呈脑浆状的小片构成，排列紧密，主要由C、N、O、Si等元素组成。当硅烷溶液浓度为8%时，钛表面难以形成较完整的硅烷膜；当硅烷溶液浓度为15%时，钛表面形成的硅烷膜表面较8%浓度组钛表面相对较完整，但可仍见有较多裂纹，难以形成致密的硅烷膜；当硅烷溶液浓度为33%时，纯钛表面能形成致密的硅烷膜。犬骨髓间充质干细胞在33%浓度硅烷膜处理后钛基体上的黏附情况明显优于纯钛、碱处理钛片及8%，15%浓度硅烷膜处理后的钛片。说明33%硅烷化改性纯钛表面硅烷膜较完整，并且具有良好的生物相容性，可促进骨髓间质干细胞在活性层表面的黏附。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 硅烷偶联剂, 硅烷化, 钛片, 骨髓间充质干细胞, 细胞相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays, silane coupling for metal surface pretreatment has not been widely applied yet.
OBJECTIVE: To observe the surface appearance, structure and biocompatibility of NaOH pre-treated titanium sheet coated with silane films.
METHODS: The NaOH pre-treated titanium sheet was silanized with the silane coupler (KH-550) at different concentrations (8%, 15% and 33%). The test specimens manufactured with different concentrations of silane treatment solutions were analyzed with scanning electron microscope and energy dispersive spectroscopy analyzer, in comparison with pure titanium and alkali-pretreated titanium sheets as controls. After silanization, bone marrow mesenchymal stem cells from dogs were co-cultured with the test specimens to observe the cell morphology and adhesion on the surface of test specimens.
RESULTS AND CONCLUSION: The silane film consisted of brain shaped sheets which arranged closely. The composition of the silane film was C, N, O and Si. The test specimen coated with the 33% silane solution had the full silane film, while the silane film was imperfect at a concentration of 8%. The cell adhesion was better on the surface of test specimens treated with 33% silane solution than the other specimens. These findings indicate that the titanium sheet modified with 33% silane solution possesses a good biocompatibility, thereby improving the cell adhesion, spreading, proliferation and differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, silanes, titanium, stem cells

中图分类号:

R318

古丽巴努•依马木，徐国强，迪丽努尔•阿吉，古则丽阿依•阿不都卡德尔，刘佳怡，徐彬，李琦. 硅烷偶联剂对纯钛表面改性及细胞相容性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1864-1869.

Gulbanu Ymam, Xu Guo-qiang, Dilnur Aji, Guzalay Abdukadr, Liu Jia-yi, Xu Bin, Li Qi. Silane coupler effects on titanium surface modification and biocompatibility[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1864-1869.

图/表（结果） 3

2.1 硅烷膜的表面微观形貌 硅烷偶联剂KH-550的化学结构式为N₂H-CH₂CH₂CH₂-Si(OC₂H₅)₃，具有结合在硅原子上的水解性基团，可进行水解反应并生成Si-OH的基团，以及与聚合物具有较强亲和力或反应能力的基团氨基，硅烷溶液的浓度对膜表面形貌有较大影响。图2是钛片浸入8%，15%，33%硅烷溶液后所制得的硅烷膜钛片表面的微观形貌。由图可见，硅烷膜由许多呈脑浆状的小片构成，排列紧密。图2A示硅烷溶液浓度为8%时，钛表面难以形成较完整的硅烷膜。图2B示硅烷溶液浓度为15%时，钛表面形成的硅烷膜表面较硅烷溶液浓度为8%的钛表面相对较完整，可仍见有较多裂纹，难以形成致密的硅烷膜。图2C可见，当硅烷溶液浓度为33%时，纯钛表面能形成致密的硅烷膜。

2.2 硅烷膜的X射线能谱分析 通过对不同浓度组钛片表面硅烷膜成分分布进行X射线能谱分析可知，不同浓度组钛表面硅烷膜成分均相同，由C、N、O、Si等元素组成，图3为33%硅烷溶液浓度制得钛片表面硅烷膜能谱分析。

2.3 骨髓间充质干细胞在不同材料表面的形态及黏附 通过对5组细胞材料复合培养18 h后，扫描电镜结果如图，图4A-E分别为骨髓间充质干细胞在样品1^#-5^#表面的形态及黏附。细胞材料复合培养18 h后，图4A示对照组黏附于纯钛片表面的细胞呈长梭形，并紧紧附着在钛片表面；图4B示碱热处理组表面细胞可能由于表面网络状结构使得细胞呈扁圆状，数目较纯钛片组增多；图4C可见，细胞在8%浓度硅烷膜处理后的钛基体上黏附数量明显减少，可能由于硅烷溶液浓度为8%时钛表面难以形成较完整的硅烷膜，影响细胞的黏附；如图4D所示：细胞在15%浓度硅烷膜处理后的钛基体上黏附数量明显增多，却导致细胞死亡，不利细胞生长。图4E可见，细胞在33%浓度硅烷膜处理后的钛基体上的黏附情况明显优于纯钛、碱处理钛片及8%、15%浓度硅烷膜处理后的钛片。总的来讲，只要硅烷膜处于适宜浓度所处理的钛片有利于细胞的黏附。

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引言

目前，口腔种植因其能阻碍牙槽骨的吸收、不损伤其他牙齿、恢复咀嚼力、恢复咀嚼时的口感、对牙龈的损伤较小、没有异物感、能维持牙齿间的衔接，使人拥有完整的齿列、维持自然的面貌、不会引起发音上的问题等优点，成为修复牙列缺损、缺失最有效的手段之一，已在临床上得到了广泛的应用和发展^[1]。钛凭借其生物毒性低、耐热、无磁、硬度适中、质轻、耐腐蚀性强、理化性能适于人体等优良的综合性能，早在20世纪60年代，就开始成为临床上应用最广泛的种植体植入材料^[2-4]。但是，钛金属作为一种惰性材料植入体内，它与骨结合只是一种机械锁和，不能像生物材料那样与骨产生生物体相互作用，对机体愈合无明显促进作用，临床上还存在较高的失败率^[5]。为此，为了提高钛表面的生物活性，提高种植体骨结合的质量和强度，缩短愈合时间，提高种植体的成功率，有必要对纯钛种植体进行表面处理^[6]。

采用硅烷偶联剂进行金属表面预处理已成为近年来研究的热点^[7-8]。硅烷偶联剂是一类在分子中同时含有两种不同化学性质基团的有机硅化合物，其经典产物可用通式YSiX₃表示。式中，Y为非水解基团，包括链烯基(主要为乙烯基)，以及末端带有Cl、NH₂、SH、环氧、N₃、(甲基)丙烯酰氧基、异氰酸酯基等官能团的烃基，即碳官能基；X为可水解基团，包括Cl、OMe、OEt、OC₂H₄OCH₃、OSiMe及OAc等。由于这一特殊结构，在其分子中同时具有能和无机质材料(如玻璃、硅砂、金属等)化学结合的反应基团及与有机质材料(合成树脂等)化学结合的反应基团，可以用于表面处理。金属表面的硅烷化处理是利用有机硅的特殊分子结构对其进行表面处理的过程，其有以下多个优点：无有害重金属离子，不含磷，无需加温；硅烷处理过程不产生沉渣，处理时间短，控制简便；处理步骤少，可省去表调工序，槽液可重复使用；有效提高油漆对基材的附着力；可共线处理铁板、镀锌板、铝板等多种基材。

目前，国内硅烷偶联用于金属表面预处理的报道较少，实验将纯钛片浸入KH-550硅烷溶液中制备致密硅烷膜，采用扫描电镜、X射线能谱仪研究硅烷膜的结构特征，并采用电镜观察间充质干细胞在不同浓度硅烷改性材料表面的细胞形态及黏附。

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材料方法

设计：观察实验。

时间及地点：实验于2012年2月至2013年6月在新疆乌鲁木齐市中科院物理化学研究所、新疆医科大学第一附属医院动物模型实验室进行。

材料：

实验动物：从新疆医科大学第一附属医院实验动物科学研究部取正常成年比格犬3只，雌雄不拘，体质量12-14 kg。

实验方法：

硅烷膜的制备^[9]：制作10 mm×10 mm×2 mm大小钛片45件，随机分成5组，每组9件，用砂纸打磨抛光至表面无划痕，用丙酮超声清洗去油污15 min，抽出除去油污后的钛片1组，为对照组，其余4组用10 mol/L NaOH溶液预处理6 h，用去离子水冲洗表面，干燥待用。

在去离子水中加入一定量无水乙醇中搅拌均匀，然后再缓慢加入KH-550硅烷偶联剂，按一定比例将KH-550硅烷偶联剂、水、无水乙醇配制不同浓度的硅烷水解液，滴入0.1 mol/L浓度的NaOH溶液调节pH值为10，继续搅拌至溶液透明、均匀，获得浓度分别为8%，15%，33%的硅烷水解溶液。抽出NaOH碱处理后的钛片3组分别浸入不同浓度的硅烷溶液中 10 min，然后在温度为130 ℃烘箱中加热老化成膜3 h。用浓度8%，15%，33%的硅烷溶液制得的试样分别为3^#、4^#、5^#，纯钛片为1^#，碱处理的钛片为2^#。

硅烷膜样品表征：采用扫描电镜及能谱仪分析硅烷膜表面微观形貌及其成分。

骨髓间充质干细胞的体外培养与扩增：

骨髓间充质干细胞的体外分离及扩增培养^[10]：无菌条件下用含肝素钠的穿刺针穿刺犬双侧股骨大转子，获取骨髓原液2.0-3.0 mL/犬，肝素钠与骨髓原液比例为1∶1.5，重悬于20 mL低糖DMEM，用小号针吸吹，将骨髓小粒打散，以1 000 r/min离心10 min，弃上清，低糖DMEM重悬至6 mL/管，混匀；另取10 mL离心管，预加3 mL percoll液，将两者缓慢叠加，以2 000 r/min离心20 min；取交界白膜层，加低糖DMEM洗涤3次；再以含体积分数10%FBS，青、链霉素混合液的低糖DMEM与MCDB201以6∶4混匀接种于50 mL培养瓶。当细胞贴壁、扩展、生长时，弃去非贴壁细胞。每3 d更换培养基。

骨髓间充质干细胞的体外扩增^[11]：原代培养至7-10 d细胞80%-90%融合，用胰酶进行传代。先将旧培养液弃去，1×PBS洗2次后加入0.25%胰酶，于镜下观察。见细胞变圆即将脱壁时，吸管吹打瓶底数次，加入3倍以上体积的 L-DMEM完全培养液终止胰酶作用，并用吸管反复吹打使细胞脱壁。离心，重悬，按1∶3比例接种并标记为第1代(P1)，继续培养。以后约每3 d传代1次。至第3代细胞已无造血干细胞污染，细胞均一性较好。实验通过细胞形态来鉴定犬骨髓间充质干细胞，显微镜下观察第3代细胞并照相(图1)示细胞呈梭形外观，贴壁生长，有长的突足，细胞核大，核仁明显。

骨髓间充质干细胞的冷冻：将80%-90%融合的第3代骨髓间充质干细胞消化、离心弃去上清夜，加入细胞冻存液10 mL(成分为1 mL DMSO、3 mL血清、6 mL DMEM，自配)重悬后，转移细胞至无菌细胞冻存管中，密封。按4 ℃30 min，-20 ℃ 30 min将细胞转移至-80 ℃冰箱过夜，最终保存于液氮中。

骨髓间充质干细胞在不同材料表面的形态检测及黏附：将5组材料在L-DMEM完全培养液预湿过夜，接种前在无菌超净台吹至半干，用无菌镊子夹取分别放至9孔培养板，每孔1个材料。将已消化好的3×10⁹L^-1的第3代骨髓间充质干细胞悬液20 μL接种到每个材料表面，在37 ℃，体积分数5%CO₂的恒温培养箱中静置培养3 h，然后每孔加入 1 mL L-DMEM完全培养液用于检测细胞形态、黏附及增殖。细胞材料复合物培养18 h后，取出用2.5%戊二醛固定4 h，梯度乙醇脱水10-30 min，通风橱自然干燥，喷金后在扫描电镜下观察细胞形态及黏附。

主要观察指标：硅烷化改性钛表面硅烷膜的表面形貌及细胞相容性。

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讨论

20世纪60年代Branemark教授在种植领域开创性地提出骨结合理论，奠定了现代口腔种植的研究基础^[16]，显著提高了种植的临床成功率。骨性结合就是种植体表面与骨组织直接产生牢固的骨性结合，即种植体与骨组织产生骨整合^[17]。研究表明，牙种植手术的成功与否是与种植体的早期骨整和密切相关。排除临床外科手术操作和患者种植部位骨量、骨质等因素的影响，种植体表面形貌和表面化学性质对于种植体骨整合能力具有决定性的影响^[18]。通过对材料表面改性，开发研究更适合临床应用的新型钛成为近几年研究的热点。种植体钛表面改性有很多种方法，在过去的20年里，应用了很多物理化学处理种植体表面^[19-21]，如喷砂、酸蚀、碱热法、注入、高能辐射技术等物理化学方法来处理种植体，这些方法得到了具有不同无机成分如羟基磷灰石和粗糙表面形貌的种植体，种植体表面的骨诱导有了极大的提高。大量研究表明，表面改性后的钛种植体稳定性和长期成功率都明显高于没有进行表面改性处理的种植体，原因是改性后种植体表面的无机成分、粗化表面有利于成骨细胞的黏附、增殖和分化，从而促进骨整合^[22-24]。目前临床上使用的几乎全部是经过表面改性且表面为无机成分的种植体，具有较高的种植成功率。但是，临床上口腔种植治疗的周期相当长(一般二三个月，长的4-6个月)，给患者的生活带来诸多不便。因此，努力探索以骨细胞为靶点并强力刺激骨组织反应的新型种植体表面改性方法，在保证高种植成功率的同时，显著缩短种植体与牙槽骨骨整合的时间，减轻患者痛苦，不仅有较大的科学意义且有实际的临床应用前景。

用硅烷偶联剂进行金属预处理是几年来新型的表面处理工艺^[25-26]。由于硅烷偶联剂无毒性、无污染、适用广泛、成本低、对有机涂层有优异的黏结性能等优点而引起国内外学者们的关注。由于硅烷偶联剂分子中存在亲有机和亲无机的两种功能团^[27]，因此可作为连接无机材料和有机材料的“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接起来，即形成无机相一硅烷偶联剂一有机相的结合层^[28-29]。种植材料表面的生物化学改性依赖于对生物学、细胞分化和功能表达的理解及材料表面改性技术。对种植材料表面进行生物化改性主要是将一些有生理功能的物质如蛋白质、多糖或细胞生长因子等生物活性分子固定材料表面，充当邻近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体，使表面形成一个与生物活性相适应的过渡层，换言之，就是将生物分子直接置于种植体表面以控制组织-种植体界面。因而材料有明确的目标性和方向性，起到链接材料与细胞、组织的中介作用。实验拟就以上问题做初步研究，对钛种植材料表面进行生物化学改性，以材料生物活性为主攻方向，制备具有表面活性基团的的钛种植体材料。获得完整的硅烷膜钛片是本实验成功的基础，硅烷溶液浓度对钛片表面硅烷膜表面形貌有较大影响，将NaOH碱处理后的钛片浸入33%浓度的硅烷溶液中10 min，然后在温度为130 ℃烘箱中加热老化成膜3 h所制得的硅烷膜为较完整的硅烷膜，硅烷膜由许多呈脑浆状的小片构成，排列紧密。

适宜浓度硅烷化处理的纯片能明显提高骨髓间充质干细胞的黏附、生长能力，33%硅烷溶液制得的试样效果较佳，由此可见，经33%硅烷溶液处理的钛种植体表面活性层模式为纯钛基体一硅烷化处理一接枝具有生物活性的生物大分子，能够形成完整的硅烷膜，有利于细胞的黏附，并能促进其生长。钛金属表面经过改性后，材料表面的物理、化学性能显著改善，不仅被动诱导细胞黏附、生长，促进组织和材料的生物学结合，还使得种植体-骨界面的结合更加牢固，显著提高了材料细胞相容性。因实验观察时间较短，有关硅烷化处理钛片对细胞增长的影响有待于进一步实验研究证明，对其细胞相容性的长期效果也有待进一步研究，但纵观以上钛表面硅烷化改性方法在生物材料领域的开发应用和研究，可以看出硅烷化改性在临床应用是十分有价值的，虽然有研究指出，硅烷分子与钛表面形成的硅氧键在生理条件下有发生水解的趋势，会使改性的表面可能变得不稳定^[30-36]，但它开创了一个新的研究领域，前景是十分广阔的。

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[1]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[5]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[6]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[7]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[8]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
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[11]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[12]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[13]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[14]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[15]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.