Ghrelin-GHSR 通路在 4 周间歇低氧改善小鼠肥胖机体的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3098

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (11): 1733-1739.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3098

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

Ghrelin-GHSR 通路在 4 周间歇低氧改善小鼠肥胖机体的变化

杨璐瑶1，2，付鹏宇2，唐舒宁2，朱镕鑫3，龚丽景1

北京体育大学，1中国运动与健康研究院， 2运动人体科学学院，北京市 100084；3上海体育科学研究所，上海市 200030

收稿日期:2020-03-23 修回日期:2020-03-28 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-04-18 发布日期:2020-12-21
通讯作者: 龚丽景，博士，助理研究员，北京体育大学中国运动与健康研究院，北京市 100084
作者简介:杨璐瑶，女，1998年，浙江省金华市人，汉族，北京体育大学在读本科生。
基金资助:
北京市大学生创新创业训练计划项目(201910043040)，项目负责人：杨璐瑶

Change of Ghrelin-GHSR pathway in 4-week intermittent hypoxic exposure improving obesity in mice

Yang Luyao1, 2, Fu Pengyu2, Tang Shuning2, Zhu Rongxin3, Gong Lijing1

1China Institute of Sport and Health, 2School of Sports and Human Sciences, Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 3Shanghai Research Institute of Sports Science, Shanghai 200030, China

Received:2020-03-23 Revised:2020-03-28 Accepted:2020-05-09 Online:2021-04-18 Published:2020-12-21
Contact: Gong Lijing, PhD, Assistant researcher, China Institute of Sport and Health, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
About author:Yang Luyao, 1China Institute of Sport and Health, 2School of Sports and Human Sciences, Beijing Sport University, Beijing 100084, China
Supported by:
Beijing Training Problem of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates, No. 201910043040 (to YLY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生长激素促分泌激素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)：由7个跨膜α螺旋组成的蛋白偶联受体，多分布于垂体、胃部、肠等部位，生长激素促分泌素受体激动剂与生长激素促分泌素受体结合后具有促进生长激素的释放、调节胃肠运动及脂肪积累等多种作用。
胃饥饿素(Ghrelin)：是一种由28个氨基酸残基组成的脑肠肽，是生长激素促分泌素受体的内源性配体，Ghrelin能够与其中枢及外周的受体生长激素促分泌素受体结合对调节动物摄食量、胃收缩及分泌活动、糖脂代谢、能量平衡等方面起重要作用。

背景：低氧暴露下体质量的减少被认为与摄食量减少有关，胃饥饿素(Ghrelin)水平下降能使摄食量减少，但是肥胖所致消化系统营养吸收障碍和血脂异常能否在间歇低氧干预下通过Ghrelin-GHSR通路进行调控，目前尚不清楚。
目的：明确间歇低氧暴露对肥胖小鼠胃组织Ghrelin-GHSR通路的影响。
方法：将30只离乳C57BL/6J小鼠随机分为普通对照组(n=8)和高脂膳食组(n=22)。高脂膳食组饲喂8周高脂饲料建立肥胖模型后随机分为肥胖对照组(n=8)和肥胖低氧组(n=8)，剩余体质量未超过普通对照组平均体质量20%的小鼠弃去。肥胖低氧组进行4周低氧暴露(氧浓度为11.2%)，8 h/d，6次/周。干预结束后检测血清生化和Ghrelin水平，RT-PCR测定胃组织Ghrelin和下丘脑生长激素促分泌激素受体1a mRNA相对表达水平，苏木精-伊红染色法观察胃组织形态，免疫组化法测定胃组织Ghrelin和Ghrelin O-酰基转移酶(Goat)的平均吸光度值，Western Blot测定胃Ghrelin和Ghrelin O-酰基转移酶、下丘脑生长激素促分泌激素受体1a 蛋白表达水平。实验方案经北京体育大学运动科学伦理委员会批准(审批号：2015021)。
结果与结论：①低氧干预4周使肥胖对照组体质量显著高于普通对照组和肥胖低氧组；②肥胖对照组血糖、总胆固醇、三酰甘油水平显著高于普通对照组，肥胖低氧组血糖、总胆固醇水平显著低于肥胖对照组，肥胖低氧组血清Ghrelin水平显著高于肥胖对照组；③肥胖对照组胃组织Ghrelin mRNA相对表达量显著低于肥胖低氧组，下丘脑生长激素促分泌激素受体1a mRNA水平极显著低于普通对照组；④肥胖低氧组胃底腺主细胞规律、密集、均匀分布；⑤肥胖低氧组Ghrelin和Ghrelin O-酰基转移酶的平均吸光度值、生长激素促分泌激素受体1a、Ghrelin和Ghrelin O-酰基转移酶蛋白含量显著高于肥胖对照组；⑥结果说明，4周低氧暴露可显著上调肥胖小鼠胃组织Ghrelin、Ghrelin O-酰基转移酶和下丘脑生长激素促分泌激素受体1a的表达水平，降低肥胖机体的血糖和体质量，改善肥胖对机体的不良影响。
https://orcid.org/0000-0003-3502-0901(龚丽景)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 低氧, 肥胖, 胃组织, 下丘脑, 胃饥饿素, 生长激素促分泌素受体

Abstract: BACKGROUND: Weight loss under hypoxic exposure is related to a reduction in food intake. Decreased gastric Ghrelin levels can reduce food intake, but whether digestive nutritional absorption disorders and dyslipidemia caused by obesity can be regulated through Ghrelin-growth hormone secretagogue receptor (GHSR) pathway under intermittent hypoxia is unclear yet.
OBJECTIVE: To explore the effect of intermittent hypoxia exposure on Ghrelin-GHSR pathway in gastric tissues of obese mice.
METHODS: Thirty C57BL/6J male mice were randomly divided into a control group (n=8) and a high fat diet group (n=22, fed with high fat diet). After 8 weeks high fat diet, obesity models were successfully established in 16 mice with high fat diet, and then were randomly divided into an obese control group (n=8) and an obese hypoxic group (n=8, 11.2% oxygen concentration, 8 hours per day, 6 times per week). The mice whose remaining body mass did not exceed the average body weight of the normal control group by 20% were discarded. After intervention, the serum biochemical indicators and Ghrelin level were tested; the Ghrelin and GHSR-1a mRNA expressions were tested by RT-PCR; gastric tissue morphology was observed by hematoxylin-eosin staining; the mean absorbance values of Ghrelin and Ghrelin O-acyltransferase (Goat) were measured by immunohistochemistry; the protein expressions of hypothalamic growth hormone secretagogue hormone receptor 1a (GHSR-1a), Ghrelin and Goat were detected by western blot. The study protocol was approved by the Sports Science Ethics Committee of Beijing Sport University, approval No. 2015021.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The body mass of the obese control group was significantly higher than that of the control group and obese hypoxic group after 4-week hypoxic intervention. (2) The blood glucose, total cholesterol, and triacylglycerol levels were obviously higher in the obese control group than the control group. Compared with the obese control group, the blood glucose and total cholesterol levels were significantly lower in the obese hypoxic group, while the serum Ghrelin level was significantly higher in the obese hypoxic group. (3) The Ghrelin mRNA relative expression in gastric tissue of the obese control group was evidently lower than that of the obese hypoxic group, and the GHSR-1a mRNA expression in the hypothalamus was significantly lower in the obese control group than the control group. (4) The obese hypoxic group had a regular, dense and uniform distribution of gastric fundus gland main cells. (5) The mean absorbance values of Ghrelin and Goat as well as the protein contents of GHSR-1a, Ghrelin and Goat in the obese hypoxic group were evidently higher than those in the obese control group. These results indicate that 4-week hypoxic exposure can significantly increase the expression of Ghrelin and Goat in gastric tissue and GHSR-1a in the hypothalamus, decrease blood glucose level and body mass, and improve the adverse effects of obesity in obese mice.

Key words: hypoxia, obesity, gastric tissue, hypothalamus">, Ghrelin, growth hormone secretagogue receptor

中图分类号:

杨璐瑶, 付鹏宇, 唐舒宁, 朱镕鑫, 龚丽景. Ghrelin-GHSR 通路在 4 周间歇低氧改善小鼠肥胖机体的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1733-1739.

Yang Luyao, Fu Pengyu, Tang Shuning, Zhu Rongxin, Gong Lijing . Change of Ghrelin-GHSR pathway in 4-week intermittent hypoxic exposure improving obesity in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(11): 1733-1739.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析排除肥胖建模失败的6只小鼠，干预结束时小鼠数量为24只，后续各组均无小鼠流失，全部进入结果分析。
2.2 小鼠体质量、摄食量小鼠初始体质量为(8.81±0.40) g。8周高脂饲料饲养后，高脂膳食组(肥胖对照组和肥胖低氧组)体质量分别为(24.83±1.44) ，(24.72±1.31) g，超过普通对照组(21.32±0.31) g体质量的20%，说明成功建立肥胖模型。低氧暴露2周时，肥胖对照组(26.32±1.14) g的体质量显著高于普通对照组(21.61±0.93) g(P < 0.01)，见图1。干预4周后，肥胖对照组(27.92±1.44) g体质量显著高于普通对照组(26.33±1.61) g和肥胖低氧组(26.67±1.87) g(P < 0.05)。

普通对照组饲喂普通维持饲料，高脂膳食组饲喂高脂饲料，前8周，普通对照组每周摄食量(该组所有小鼠的单周摄食总量)稍低于高脂膳食组，但无显著差异。低氧暴露2周(第10周)，肥胖低氧组高脂饲料摄食量较肥胖对照组下降；低氧暴露4周时(第12周)，肥胖低氧组与肥胖对照组的摄食量逐渐接近。
2.3 小鼠血清生化指标和Ghrelin水平肥胖对照组血糖(10.21±1.81) mmol/L、总胆固醇(0.12±0.01) mmol/L、三酰甘油(0.34±0.03) mmol/L水平显著高于普通对照组[血糖为(8.53±0.81) mmol/L、总胆固醇为(0.05±0.00) mmol/L、三酰甘油为(0.29±0.02) mmol/L(P < 0.05)]，见图2。低氧暴露干预4周后，肥胖低氧组血糖(8.06±1.31) mmol/L、总胆固醇(0.10± 0.01) mmol/L水平显著低于肥胖对照组(P < 0.05)；肥胖低氧组三酰甘油为(0.35±0.16) mmol/L，与肥胖对照组无显著性差异；肥胖低氧组血清Ghrelin水平(0.40±0.02) mmol/L显著高于肥胖对照组(0.30±0.01) mmol/L(P < 0.05)，见图2D。

2.4 小鼠胃组织形态变化苏木精-伊红染色法观察低氧干预4周后胃组织形态变化。普通对照组胃底腺主细胞呈柱状，核圆形，多分布于腺的下半部；肥胖对照组胃底腺主细胞较普通对照组分布杂乱而分散，且细胞肿胀、充满脂肪空泡；肥胖低氧组胃底腺主细胞相对于肥胖对照组较规律、密集而均匀分布。见图3。

2.5 小鼠胃组织Ghrelin和Goat的平均吸光度值 Ghrelin由胃X/A样细胞分泌，在胃黏膜中该细胞呈封闭卵圆形。棕黄色区域为免疫阳性细胞，见图4A箭头标注。干预4周后，肥胖对照组Ghrelin(0.26±0.02)和Goat(0.22±0.02)平均吸光度值高于普通对照组(0.25±0.01，0.21±0.01)，但无显著性差异，肥胖低氧组Ghrelin(0.29±0.03)和Goat(0.29±0.03)表达显著高于肥胖对照组(P < 0.05)，见图4B。

2.6 小鼠下丘脑生长激素促分泌素受体1a 蛋白及mRNA水平与普通对照组相比，肥胖对照组下丘脑生长激素促分泌激素受体1a蛋白水平无显著差异；肥胖低氧组下丘脑生长激素促分泌激素受体1a(1.66±0.15)蛋白水平显著高于肥胖对照组(1.14±0.08)(P < 0.05)，见图5。肥胖对照组的下丘脑生长激素促分泌激素受体1a mRNA(0.28±0.14)水平极显著性低于普通对照组(1.00±0.13)(P < 0.01)；与肥胖对照组相比，肥胖低氧组下丘脑生长激素促分泌激素受体1a mRNA(0.33±0.21)相对表达量有所增加。

2.7 小鼠胃组织Ghrelin和Goat 蛋白及mRNA水平与普通对照组相比，肥胖对照组胃组织Ghrelin和Goat蛋白水平无显著差异；肥胖低氧组胃组织Ghrelin(1.39±0.20)和Goat(1.31±0.09)蛋白水平显著高于肥胖对照组(0.82±0.16，1.16±0.28)(P < 0.05)，见图6。肥胖对照组的胃组织Ghrelin mRNA(0.28±0.12)水平极显著性低于普通对照组(1.00±0.10)(P < 0.01)。与肥胖对照组相比，肥胖低氧组胃组织 Ghrelin mRNA(0.41±0.18)相对表达量显著增加(P < 0.05)。

参考文献

[1] SHENG C, LI R, YANG P, et al. The correlation and relationship of obesity and cancer: a possible research perspective.Chin-Ger J Clin Oncol. 2013;12(8): 393-398.
[2] SUI Y, ZHAO HL, WONG VCW, et al.A systematic review on use of Chinese medicine and acupuncture for treatment of obesity. Obes Rev. 2012;13(5):409-430.
[3] Camilleri M. Peripheral mechanisms in appetite regulation.Gastroenterology. 2015;148(6):1219-1233.
[4] MICHAEL C, HARMEET M, ANDRES A. Gastrointestinal Complications of Obesity. Gastroenterology. 2017;152(7):1656-1670.
[5] 杨卫红,黄薇.胃肠功能与肥胖症[J].医学研究杂志,2015,44(1): 160-163+153.
[6] 郭展宏,臧璞,邵加庆.胃饥饿素与糖脂代谢、能量平衡及肥胖的关系[J].中国糖尿病杂志,2019,27(4):316-320.
[7] 郭展宏,臧璞,邵加庆.胃饥饿素对肥胖小鼠胰岛素抵抗的影响[J].医学研究生学报,2020,33(2):122-126.
[8] 付鹏宇,龚丽景,朱镕鑫,等. Ghrelin-GHSR通路在急性低氧暴露大鼠胃炎症反应中的调节作用[J].中国生物化学与分子生物学报, 2018,34(10):1103-1110.
[9] 尹悦,张炜真.胃X/A样细胞和肥胖[A]中国生理学会.中国生理学会第24届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文汇编[C].中国生理学会,2014: 43.
[10] KONOPKO-ZUBRZYCKA M, BANIUKIEWICZ A, WRÓBLEWSKI E, et al. The effect of intragastric balloon on plasma ghrelin, leptin, and adiponectin levels in patients with morbid obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2009; 94(5):1644-1653.
[11] 郭子君.运动对肥胖易感和抵抗大鼠内脏Ghrelin表达的影响[D].太原:山西大学, 2016.
[12] ABIZAID A. Stress and obesity: The ghrelin connection. J Neuroendocrinol. 2019;31(7):12693.
[13] BOYER SJ, BLUME FD. Weight loss and changes in body composition at high altitude.J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 1984;57(5): 1580-1585.
[14] KAYSER B, VERGES S. Hypoxia, energy balance and obesity: from pathophysiological mechanisms to new treatment strategies.Obes Rev. 2013;14(7):579-592.
[15] WESTERTERP KR, KAYSER B. Body mass regulation at altitude.Eur J Gastroenterol Hepatol. 2006;18(1):1-3.
[16] 李晓东.食源性肥胖大鼠模型的建立和电针治疗肥胖症作用机制的实验研究[D].天津医科大学,2003.
[17] 付鹏宇,龚丽景,朱镕鑫,等.有氧运动对肥胖小鼠胃组织Ghrelin和下丘脑GHSR-1a表达的影响[J].中国运动医学杂志,2019,38(8): 685-690.
[18] BECK B, MAX JP, FERNETTE B, et al. Adaptation of ghrelin levels to limit body weight gain in the obese Zucker rat.Biochem Biophys Res Commun. 2004;318(4): 846-851.
[19] ZWIRSKAKORCZALA K, KONTUREK SJ, SODOWSKI M, et al. Basal and postprandial plasma levels of PYY, ghrelin, cholecystokinin, gastrin and insulin in women with moderate and morbid obesity and metabolic syndrome. J Physiol Pharmacol.2007;58 Suppl 1:13-35.
[20] 裴晓萌,肖海涛,李显,等.高脂饮食诱导的肥胖倾向和肥胖抵抗大鼠胃组织和血浆ghrelin水平的研究 [J]. 中国康复医学杂志, 2009,24(10): 876-879.
[21] 李硕硕,张荷玲.四周有氧运动结合节食对大鼠下丘脑Ghrelin的影响[J].体育科技文献通报,2018,26(1):161-162+165.
[22] 刘文倩,张建刚,谢岚,等.运动和限食减肥对肥胖大鼠血浆和胃组织ghrelin表达的影响[J].中国运动医学杂志,2010,29(2): 184-187+216.
[23] CANCELLO R, CLÉMENT K. Is obesity an inflammatory illness? Role of low-grade inflammation and macrophage infiltration in human white adipose tissue. Bjog. 2010;113(10):1141-1147.
[24] MASOUD SB, FATEMEH N, ABBAS H, et al. Paraventricular nucleus-microinjected glucose increases food intake in 18 h food-deprived rats: A central regulatory mechanism on serum ghrelin and leptin levels. Eur J Pharmacol. 2020;876:173073.
[25] PRITCHETT NR, MAZIARZ M, SHU XIAO-OU, et al. Serum ghrelin and esophageal and gastric cancer in two cohorts in China.Int J Cancer. 2020;146(10):2728-2735.
[26] 屈豫花,秦燕. Ghrelin在应激状态下对机体保护作用的研究进展[J].生理科学进展,2019,50(2):103-106.
[27] 张捷, 刘荣凤. Ghrelin的研究进展[J].实用医学杂志,2009,25(10): 1537-1538.
[28] BAATAR D, PATEL K, TAUB DD. The effects of ghrelin on inflammation and the immune system. Mol Cell Endocrinol. 2011;340(1): 44-58.
[29] YANG J, BROWN MS, LIANG GS, et al. Identification of the acyltransferase that octanoylates ghrelin, an appetite-stimulating peptide hormone. Cell. 2008;132(3):387-396.
[30] SEOANE LUISA M, MIGUEL L, SULAY T, et al.Agouti-related peptide, neuropeptide Y, and somatostatin-producing neurons are targets for ghrelin actions in the rat hypothalamus. Endocrinology. 2003; 144(2):544-551.
[31] LUIS V, VÁZQUEZ MARÍA J, FERNANDO C, et al. Ghrelin and lipid metabolism: key partners in energy balance.J Mol Endocrinol. 2011; 46(2):R46-63.
[32] CHOPIN LK, SEIM I, WALPOLE CM, et al. The Ghrelin Axis-Does It Have an Appetite for Cancer Progression?.Endocr Rev. 2012;33(6):849-891.
[33] HEPPNER KM, PIECHOWSKI CL, ANNE M, et al. Both acyl and des-acyl ghrelin regulate adiposity and glucose metabolism via central nervous system ghrelin receptors. Diabetes.2014;63(1):122-131.
[34] 范锦勤,翁锡全,徐国琴,等.低氧运动干预肥胖模型大鼠下丘脑Nesfatin-1和Ghrelin水平[J].中国组织工程研究,2020,24(20): 3202-3208.
[35] YUKA H, TORU O, KAZUO C, et al. Differences in relationships among sleep apnoea, glucose level, sleep duration and sleepiness between persons with and without type 2 diabetes. J Sleep Res. 2012;21(4): 410-418.
[36] 孙正启,廉会娟,赵洁,等.模拟高原低压低氧对大鼠血清和胃黏膜Ghrelin表达的影响[J].世界华人消化杂志,2011,19(16): 1726-1730.
[37] 陈雷,孙晓,王实,等.慢性间歇低氧对大鼠血脂和ghrelin表达的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2014,16(7):747-750.
[38] RICARDO L, JVM, LUIS V, et al. Ghrelin effects on neuropeptides in the rat hypothalamus depend on fatty acid metabolism actions on BSX but not on gender. FASEB J. 2010;24(8):2670-2679.
[39] SILVA PJAD, CORRÊA DSF, MENDES D M-V PM. The Impact of Ghrelin in Metabolic Diseases: An Immune Perspective. J Diabetes Res. 2017: 4527980.

引言

机体能量摄入与消耗不均衡，导致脂肪细胞堆积，体质量上升，乃至肥胖，各个国家的肥胖发生率越来越高[1]，已成为日益突出的社会问题。肥胖会引起多种慢性疾病、代谢综合征，严重威胁着人类健康[2]，会使机体胃生理、神经激素调节改变[3]，导致胃组织出现一系列不良症状，例如糜烂性胃炎、胃癌等[4]。
胃功能影响着肥胖的发生、发展以及维持等方面[5]，因此从改善胃功能出发来缓解肥胖带来的危害不失为一种可行的方法。胃饥饿素(Ghrelin)是一种由胃黏膜合成分泌的脑肠肽，不仅能够促进生长激素分泌，在机体糖脂代谢及能量平衡方面也有重要影响，与机体的食欲、肥胖密切相关[6]。有研究指出，长期应用Ghrelin可改善胰岛素抵抗，明显降低肥胖小鼠的空腹血糖[7]，Ghrelin可通过抑制胰岛素的分泌引起血糖升高。生长激素促分泌素受体在下丘脑及垂体中表达显著，在胃功能的调节上发挥重要作用[8]，例如调节食欲以及能量平衡。胃是直接反映能量与摄食量的器官，当机体处于能量正平衡状态，如高脂饲料诱导肥胖时，胃组织的 Ghrelin产生减少，机体摄食量减少，以期维持能量稳态[9]。在肥胖患者中，由胃内球囊引发的体质量下降与血浆瘦素水平降低、血浆Ghrelin水平短暂升高有关[10]，所以肥胖会引起胃组织Ghrelin表达下调[11]，而胃合成Ghrelin的速率受到Ghrelin O-酰基转移酶(Ghrelin O-acyltransferase，Goat)活性限制，Goat也主要在胃中合成[12]，Goat使Ghrelin酰基化，酰基化的Ghrelin即具有活性能与生长激素促分泌素受体结合进一步发挥其生理作用。
近年来，低氧减肥和高原探险旅游越来越常见，BOYER等[13]发现，在4 500 m海拔上(氧浓度约为11.2%)暴露7 d平均体质量下降1.9 kg，暴露32 d体质量下降4 kg。低氧暴露下体质量的减少常被认为是由摄食量下调所致[14-15]。研究发现，血浆Ghrelin水平的升高、胃Ghrelin水平的降低能够下调摄食量。Ghrelin和生长激素促分泌素受体 mRNA以及蛋白质水平与低氧暴露时间延长的变化基本一致，先下降再上升[8]，这一变化可能与适应低氧环境有关，提示低氧干预下摄食量也存在先下降后上升的应激与适应。但是肥胖所致消化系统营养吸收障碍和血脂异常，能否在低氧干预下通过Ghrelin-GHSR通路进行调控，目前尚不清楚。因此，研究拟通过4周间歇低氧干预，观察肥胖小鼠体质量、摄食量、血脂血糖，胃组织Ghrelin、Goat和下丘脑生长激素促分泌素受体含量的变化，以明确间歇低氧暴露对肥胖小鼠胃组织Ghrelin-GHSR通路的影响机制，为低氧减肥是否有效果提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2016年4月至2017年12月在北京体育大学动物实验室内完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康离乳C57BL/6J小鼠30只，体质量(8.81±0.40) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2015-0004。所有小鼠均单笼饲养，饲养环境：温度(22±2) ℃，湿度40%-70%，光照12 h/d，许可证编号：SYXK(京)2016-0034。所有操作符合北京体育大学运动科学实验伦理学要求(审批号：2015021)。
1.3.2 实验试剂和仪器自动生化分析仪(7020，Hitachi)；中生北控试剂盒，TG-0220、TC-0180、GLU-0230；EZRGRT-91K，Millipore；RT-PCR试剂盒，Super Real Pre Mix Plus (SYBR Green)；Ghrelin抗体(Abcam，ab129383)，Goat抗体(Abcam，ab170690)，生长激素促分泌激素受体1a(GHSR-1a)抗体(Abcam ab95250)，内参Tubulin (Sigma T6074)；高通量组织匀浆器(BBY24M, NEXT ADVANCE)；Pierce™ BCA Protein Assay Kit (23227，Thermo Scientific)；干转系统iBlot 2，Life Technologies；ChemiDocTMXRS+ System，Bio-Rad。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组及干预将小鼠随机分为2组：普通对照组(n=8，自由饮食饮水)和高脂膳食组[n=22，高脂饲料饲养(D12109C：Rodent Diet with 40 kcal% Fat，美国Research Diet)，以建立肥胖模型(diet-induced obesity，DIO模型)，体质量高于普通对照组平均体质量20%以上[16]]。8周后高脂膳食组小鼠肥胖模型建立成功，将其随机分为肥胖对照组和肥胖低氧组，每组8只，继续给予高脂饲料饲养；没有建模成功的6只小鼠麻醉后放血处死。对肥胖低氧组小鼠进行8 h/d的低氧暴露干预(空气经空气压缩机、冻干机和制氮机分筛后，制成氧气浓度11.2%的气体通入低氧房内，模拟4 500 m海拔高度)，6次/周，共4周。12周饲养过程中，每周称量小鼠体质量，记录摄食量。

1.4.2 取材干预结束，禁食12 h后，对小鼠腹腔注射1%浓度的戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，心脏取血，静置、离心得血清，-20 ℃保存。取胃组织，分3份，分别放多聚甲醛固定液、RNA保存液和液氮；取下丘脑分2份，分别放RNA保存液和液氮。
1.4.3 血清生化指标检测取取小鼠的血清，按TG-0220、 TC-0180、GLU-0230试剂盒说明书进行操作，使用自动生化分析仪测试其样品总胆固醇、血糖和三酰甘油水平；用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测试小鼠血清总Ghrelin水平。
1.4.4 实时荧光定量分析引物参考付鹏宇等[17](见表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成、纯化。取胃组织和下丘脑，用Real Time-PCR(RT-PCR)法提取并检测胃组织Ghrelin、Goat和下丘脑生长激素促分泌素受体1a mRNA总浓度，37 ℃15 min进行反转录反应，获取cDNA液，用ABI 7500 Real-Time PCR System进行RT-PCR扩增片段，95℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，重复40个循环。PCR反应结束后，读取并分析反应数据，使用比较阈值法(ΔΔCt法)计算胃组织Ghrelin、Goat和下丘脑生长激素促分泌素受体1a mRNA的相对表达。

1.4.5 苏木精-伊红染色法观察胃组织形态取出40 g/L多聚甲醛固定好的胃组织，脱蜡水化，石蜡包埋，切片5 μm，用苏木精-伊红染色法进行染色：使用苏木精染液染色5 min，之后用水冲洗，并用0.5%盐酸乙醇处理10 s，置于镜下并观察染色效果，水洗15 min，放入体积分数95%乙醇30 s，然后放入乙醇伊红染液20 s，常规脱水后封固，镜下观察。
1.4.6 免疫组化法测平均吸光度值蜡块切片5 μm，放置于体积分数3%H2O2中孵育10 min后，使用PBS冲洗 5 min，重复操作3次；37 ℃下0.1%胰酶孵育15 min；0.1% Triton X-100孵育10-15 min后；10% BSA封闭20-30 min，倒去勿洗；加Ghrelin或Goat抗体，胎牛血清做阴性对照， 4 ℃过夜；加入二抗(bs-0295G-HRP)，室温孵育1h，以上各步均用PBS 冲洗3次；DAB显色，使用苏木精染液复染细胞核，脱水后封固；镜检，每个切片镜下取5个视野，棕黄色区域为阳性部位，用Image Pro Plus6.0软件进行积分光密度测定，得到胃组织Ghrelin和Goat的平均吸光度值。
1.4.7 蛋白印迹法检测蛋白表达水平取出小鼠胃、下丘脑样品，放入装好研磨珠的螺盖离心管中，加500 μL预冷的RIPA裂解液，用高通量组织匀浆器进行匀浆，时间3 min。12 000 r/min，4 ℃离心10 min。使用 Pierce™ BCA Protein Assay Kit进行蛋白定量。用蛋白印迹法(Western Blot)测定胃组织Ghrelin、Goat和下丘脑生长激素促分泌素受体1a 蛋白表达水平，使用预制的4%-12% Bis-Tris梯度胶进行凝胶电泳，用干转系统(iBlot 2)将蛋白从凝胶转到膜硝酸纤维素膜上，形成印迹。3%的牛血清白蛋白(BSA)封闭 1 h，在孵育盒中分别孵育生长激素促分泌素受体1a、Ghrelin、Goat抗体、以Tubulin作为内参，4 ℃过夜，TBST洗掉未结合的一抗，后孵育HRP二抗，化学发光液，用成像系统读取条带灰度值(ChemiDocTMXRS+ System)，使用Image Lab软件对结果进行相对定量分析。
1.5 主要观察指标 ①间歇低氧暴露前后各组小鼠的体质量、摄食量变化；②血清生化指标，血清Ghrelin水平；③胃组织Ghrelin、下丘脑生长激素促分泌素受体1a mRNA的相对表达；④胃组织形态；⑤胃组织Ghrelin、Goat平均吸光度值；⑥胃组织Ghrelin、Goat、下丘脑生长激素促分泌素受体1a 蛋白表达水平。
1.6 统计学分析所得各项指标数据采用SPSS 19.0软件进行分析，体质量和摄食量数据采用单因素方差分析，低氧干预后结果采用独立样本 t 检验比较数据间是否存在统计学意义上的差异(肥胖对照组与普通对照组比较，肥胖低氧组与肥胖对照组比较)，所有图表中的指标结果均用x±s来表示。P < 0.05 表示差异有显著性意义，P < 0.01 表示差异有非常显著性意义。

讨论

3.1 肥胖机体生化、胃组织形态的变化肥胖机体的血清Ghrelin总水平下降，血糖血脂水平上升[18- 19]。裴晓萌等[20]的研究显示，肥胖鼠胃组织ghrelin表达与肾周脂肪质量、体质量增加量显著正相关；还有研究显示，肥胖鼠胃组织和下丘脑Ghrelin水平显著低于正常鼠[21- 22]。此次研究结果显示，经过高脂饲料建立的肥胖模型高脂膳食组小鼠的血清总胆固醇、三酰甘油水平显著高于普通对照组；苏木精-伊红染色观察到肥胖对照组的胃底腺主细胞形态与普通对照组明显不同，肥胖对照组主细胞分布分散且杂乱无序，细胞肿胀、充满脂肪的空泡形态。肥胖会使机体处于慢性炎症状态，免疫细胞在脂肪细胞处形成细胞浸润，随着脂肪细胞数目增加，更多的促炎因子释放，加剧全身炎症反应[23]，例如肥胖引发的机体糜烂性胃炎、胃癌[4]。
3.2 Ghrelin-GHSR通路在消化系统中的作用 Ghrelin是胃内分泌细胞以及下丘脑弓状核中产生，含有28个氨基酸残基的多肽，相对分子质量为3 310，是生长激素促分泌素受体的内源性配体，具有促生长激素释放的作用[7]，脑室旁核调节Ghrelin的分泌，进而影响食物的摄入机制[24]。PRITCHETT等[25]在营养干预试验中发现，低循环Ghrelin浓度与相关胃癌风险增加有关，在应激状态下Ghrelin对胃黏膜屏障有很好的保护作用[26]，Ghrelin还具有抵抗炎症、调节糖代谢的作用[7]，提高血糖水平。Ghrelin的结构在不同种属间具有高度保守性，人与大鼠的Ghrelin具有89%的同源性。机体血浆中大部分Ghrelin是由胃泌酸腺的X/A样细胞分泌的[27]。
此次研究中，肥胖对照组肥胖小鼠血清总Ghrelin水平较普通对照组有所下降；且其胃黏膜Ghrelin免疫阳性细胞表达较强，平均吸光度值高于普通对照组；肥胖对照组的下丘脑生长激素促分泌素受体1a mRNA和胃组织Ghrelin水平极显著性低于普通对照组。生长激素促分泌素受体作为Ghrelin的天然受体，是一种典型的G蛋白偶联受体，大量表达于中枢神经系统(包括下丘脑)以及周围免疫细胞[28]，生长激素促分泌受体的内源性配体Ghrelin需要依赖于生长激素促分泌素受体发挥作用[7]。在Goat的作用下，Ghrelin酰基化是其与生长激素促分泌素受体结合产生生物学效应的前提[29]。Ghrelin及其相关通路不仅可通过调节神经肽Y发挥促食欲功效[30]，还在调控能量平衡并参与调控中枢和外周的脂质代谢[31]。Ghrelin是生长激素促分泌素受体唯一的内源性配体，通过结合并激活生长激素促分泌素受体1a，发挥调节生长激素、食欲和摄食、胃肠蠕动、能量平衡、抗炎等作用[32-33]。
3.3 低氧暴露介导Ghrelin-GHSR通路调控消化系统小鼠经过高脂饲料喂养建立了肥胖模型，在4周间歇低氧暴露过程中，肥胖低氧组小鼠摄食量虽较肥胖对照组有所减少，但整体呈现先下降后上升的趋势，不同暴露时长下，Ghrelin和生长激素促分泌素受体的变化趋势基本一致，都呈现为先下降再上升，这可能与机体对低氧环境的适应有关，但由于此次研究中只在4周间歇低氧暴露结束后这一时间点进行Ghrelin、生长激素促分泌素受体的检测，无法体现这段间歇低氧暴露期间的Ghrelin和生长激素促分泌素受体的变化，而这期间可能存在Ghrelin-GHSR通路的先下降后上调，这样就可以解释肥胖低氧组小鼠摄食量的变化趋势。与肥胖对照组相比，肥胖低氧组小鼠体质量显著下降，与摄食量指标相比，体质量对间歇低氧暴露的反应较不灵敏，且由于后期摄食量的增加，肥胖低氧组小鼠的体质量并未低于低氧干预前，提示单纯通过间歇低氧暴露的减重效果不佳；肥胖低氧组血清Ghrelin水平显著高于肥胖对照组，而总胆固醇水平显著低于肥胖对照组；肥胖低氧组胃黏膜主细胞形态相对于肥胖对照组有所改善，分布较规律、密集而均匀；肥胖低氧组Ghrelin和Goat吸光度值显著高于肥胖对照组。研究结果提示在4周间歇低氧暴露后肥胖机体健康情况有所缓解。范锦勤等[34]研究显示，与常氧安静组比较，16.3 %低氧安静组的大鼠下丘脑Ghrelin水平显著性降低。低氧刺激会诱发下丘脑双侧室旁核以及HPA轴损伤，影响Ghrelin-GHSR通路，进而改变Ghrelin的表达[35]。大鼠在模拟海拔3 000 m和5 000 m的环境下低压低氧暴露24 h后，血清Ghrelin水平和胃黏膜Ghrelin阳性细胞密度显著降低[36]。大鼠在模拟海拔5 000 m高度的低氧舱中暴露1或3个月后，下丘脑和血管内皮Ghrelin的表达与常氧组相比无显著差异[37]，提示长期低氧暴露不再造成Ghrelin下调。
Ghrelin发挥调节食欲的作用是通过生长激素促分泌素受体所介导的，生长激素促分泌素受体高表达于下丘脑中调节摄食和体质量平衡的细胞群中[38]。研究发现12 h的急性低氧暴露会导致胃Ghrelin mRNA和蛋白水平急剧下调，但随着暴露时间延长至24 h和48 h，Ghrelin水平慢慢回升，甚至超过常氧水平[8]，这可能与Ghrelin-GHSR通路被激活来抵抗低氧损伤和对前期胃组织损伤的修复有关[39]，低氧暴露或可通过改变胃组织Ghrelin和下丘脑生长激素促分泌素受体的表达来调控肥胖机体的消化系统，此次研究在一定程度上验证了这一猜想：4周间歇低氧暴露后，肥胖低氧组小鼠胃组织Ghrelin mRNA 以及其蛋白水平均显著高于肥胖对照组，Goat及下丘脑生长激素促分泌素受体1a蛋白水平也显著高于肥胖对照组，苏木精-伊红染色也观察到小鼠胃黏膜主细胞形态的修复趋势，提示胃Ghrelin和下丘脑生长激素促分泌素受体1a的上调可能与进行肥胖造成的胃损伤修复有关。
3.4 结论高脂膳食可显著下调小鼠胃Ghrelin和下丘脑生长激素促分泌素受体1a的mRNA水平，增高血糖血脂水平，导致肥胖；4周间歇低氧暴露显著提高肥胖小鼠胃Ghrelin和下丘脑生长激素促分泌素受体1a的表达水平，调节食欲，降低血糖，减低体质量。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Ghrelin-GHSR 通路在 4 周间歇低氧改善小鼠肥胖机体的变化

Change of Ghrelin-GHSR pathway in 4-week intermittent hypoxic exposure improving obesity in mice

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[2]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[3]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[4]	赵敏, 冯柳祥, 陈垚, 顾霞, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧环境下外泌体可作为疾病的标志物[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1104-1108.
[5]	陈子扬, 蒲锐, 邓爽, 袁凌燕. 外泌体对运动介导胰岛素抵抗类疾病的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 4089-4094.
[6]	王朝格, 翁锡全, 林宝璇, 陈丽娜, 徐国琴. 低温运动干预肥胖大鼠的脂肪组织类型及功能改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3162-3167.
[7]	李松桃, 李欣奕, 宋云峰, 宁加银, 任强, 杨仁旭, 彭波. 麻杏芎葶合剂干预肺心病急性发作模型小鼠肺组织重构和肺血管重塑相关因子的表达 [J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 274-280.
[8]	黄朱宋, 林煜, 陈翔, 蓝锦福, 关勇, 高曦. 巴戟天醇提物对卵巢切除肥胖模型大鼠脂代谢及骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 205-210.
[9]	代敏, 王帅, 张霓霓, 黄桂林, 余丽梅, 胡小华, 易杰, 姚礼, 张立刚. 低氧预处理人羊膜间充质干细胞的生物学特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3004-3008.
[10]	李梓涵, 印文, 孙薇, 朱坤, 沈娣, 刘雨佳. 有氧运动训练8周可改善肥胖介导大鼠肠系膜动脉平滑肌电压依赖性钾通道功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2630-2635.
[11]	张磊, 严玉, 刘崟, 徐隆, 杨行雷, 刘雨佳. 8周有氧运动改善肥胖诱导心肌纤维化过程中核因子E2相关因子2通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2650-2656.
[12]	毛振立, 宋振全, 张海松, 刘恩智. 8-羟基-2-(二丙基氨基)四氢萘干预弥漫性轴索损伤模型大鼠低氧诱导因子1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1238-1242.
[13]	范锦勤, 翁锡全, 徐国琴, 吴菊花, 林文弢. 低氧运动干预肥胖模型大鼠下丘脑Nesfatin-1和Ghrelin水平[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3202-3208.
[14]	蒋涵, 丁杰, 陈根, 解强, 李伟, 王志彬, 朱磊. 低氧运动介导miRNAs影响糖代谢：预防控制糖代谢异常的新认识[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 303-311.
[15]	殷令妮, 陈德宣. PI3K/Akt通路在低氧诱导脂肪干细胞增殖和向内皮细胞分化中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 3004-3009.