全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2723

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (23): 3615-3620.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2723

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全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因中的作用

吴慧¹，许诺²，王倩³，史春³，姜龙²

¹海南医学院第一附属医院口腔科，海南省海口市 570102；²大连医科大学中山学院，辽宁省大连市 116000；³大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116000

收稿日期:2019-12-02 修回日期:2019-12-04 接受日期:2020-01-10 出版日期:2020-08-18 发布日期:2020-04-26
通讯作者: 姜龙，讲师，大连医科大学中山学院，辽宁省大连市 116000
作者简介:吴慧，女，1985年生，硕士，主治医师，主要从事口腔基础医学科研、口腔内科学的研究。共同第一作者：许诺，女，1984年生，硕士，副教授，主治医师，主要从事口腔医学相关教学与研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金(20180550563)

Screening chronic periodontitis-related genes using whole-genome expression profiling

Wu Hui¹, Xu Nuo², Wang Qian³, Shi Chun³, Jiang Long²

¹Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China; ²Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China; ³School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China

Received:2019-12-02 Revised:2019-12-04 Accepted:2020-01-10 Online:2020-08-18 Published:2020-04-26
Contact: Jiang Long, Lecturer, Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China
About author:Wu Hui, Master, Attending physician, Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan Province, China Xu Nuo, Master, Associate professor, Attending physician, Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China Wu Hui and Xu Nuo contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 20180550563

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

全基因组表达谱芯片：通过高通量平行检测基因的一种优越技术手段，可以在全基因的范围中检测慢性牙周炎的差异基因，进而快速的从分子水平为慢性牙周炎的治疗提供实验基础。

PI3K/Akt信号通路：广泛存在于各种细胞中，在细胞的增殖、分化、存活、凋亡、炎症等方面发挥着重要作用，并且该信号通路参与了以骨破坏为主要特征的骨质疏松、骨关节炎、骨肉瘤等疾病中。PI3K是位于细胞内的一种磷脂酰肌醇3激酶，可以激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt后，激活下游因子，进而影响细胞的增殖与凋亡。

背景：全基因组表达谱芯片是一种用于基因表达研究的技术手段，具有高度敏感性以及特异性，它可以在全基因组范围内检测与慢性牙周炎相关的差异基因，从而高效快速地发现与慢性牙周炎密切相关的因子。

目的：应用全基因组表达谱芯片筛选慢性牙周炎相关基因。

方法：选取15例正畸拔牙患者正常牙周膜组织作为对照组，21例慢性牙周炎患者牙周组织。比对4例慢性牙周炎组织和4例正常组织的全基因组表达谱芯片，筛选出上调基因及下调基因。通过Real-Time PCR(7例正常及13例患者)和Western Blot(4例正常及4例患者)对2组牙周膜组织中差异基因PI3K-Akt信号通路的表达进行验证。实验方案由海南医学院第一附属医院伦理委员会批准(批准号：HNM20180034)并获得所有患者的知情同意。

结果与结论：①全基因组表达谱芯片结果分析发现慢性牙周炎样本中均存在显著差异表达的上调基因1 565个，下调基因1 849个；②富集分析发现其中在慢性牙周炎中PI3K-Akt信号通路表达有显著差异(P < 0.001)；③Real-Time PCR及Western Blot 检测发现PI3K及Akt的mRNA和蛋白在慢性牙周炎中较对照组表达高(P < 0.05)；④结果说明，全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因的改变时具有快速且高敏感度等特点。PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎表达出现明显差异，为慢性牙周炎的治疗提供实验依据。

ORCID: 0000-0002-5099-3878(吴慧)；0000-0002-4258-2470(许诺)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词:

慢性牙周炎, 全基因组表达谱芯片, PI3K, Akt, GO分析, 上调基因, 下调基因

Abstract:

BACKGROUND: Whole-genome expression profiling is a technical method for gene expression research, with high sensitivity and specificity. This technique can be used to detect differential genes related to chronic periodontitis in the whole genome, therefore efficiently and quickly finding chronic periodontitis-related factors.

OBJECTIVE: To screen genes related to chronic periodontitis by using the whole-genome expression profiling.

METHODS: Normal periodontal ligament tissue of 15 patients with orthodontic extraction was selected as control group, and periodontal tissue of 21 patients with chronic periodontitis was selected as experimental group. To screen up-regulated and down-regulated genes. the genome-wide expression profile chips of four chronic periodontitis tissues and four healthy tissues were compared. The expression of the differential gene PI3K-Akt signal pathway was verified by real-time PCR (7 normal cases and 13 cases of chronic periodontitis) and western blot (4 normal cases and 4 cases of chronic periodontitis). The experimental protocol was approved by the Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University (approval No. HNM20180034) and informed consent was obtained from each patient.

RESULTS AND CONCLUSION: Analysis of the whole genome expression profile chip revealed that 1 565 up-regulated genes and 1 849 down-regulated genes were significantly differentially expressed in chronic periodontitis samples. The enrichment analysis revealed that the expression of PI3K-Akt signaling pathway was significantly different in chronic periodontitis (P < 0.001). Real-time PCR and western blot assay results indicated that PI3K and Akt expression was higher in the experimental group than in the control group (P < 0.05). All the findings indicate that the genome-wide expression profile chip is fast and highly sensitive to screen the changes in chronic periodontitis-related genes. Significantly differential expression of PI3K-Akt signal pathway in chronic periodontitis provides an experimental basis for the treatment of chronic periodontitis.

Key words: chronic periodontitis, genome-wide expression profile chip, PI3K, AKT, GO analysis, up-regulated gene, down-regulated gene

中图分类号:

吴慧, 许诺, 王倩, 史春, 姜龙. 全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3615-3620.

Wu Hui, Xu Nuo, Wang Qian, Shi Chun, Jiang Long. Screening chronic periodontitis-related genes using whole-genome expression profiling[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(23): 3615-3620.

图/表（结果） 6

2.1 全基因组表达谱芯片结果

2.1.1 正常及慢性牙周炎牙周膜组织全基因组表达谱芯片实验结果(n=4) 差异倍数柱状图结果显示所有检出的基因探针于分组比对中讯号差异的分布。差异倍数以Rosetta Resolver 7.2软件误差模型计算得出，随后通过Amersham Pairwise Ration Builder进行组间比较。柱状图的横坐标以log2表示差异倍数，纵坐标则代表探针数目。一般情况下此图显示出正态分布，代表比对中的上/下调基因大致相当，见图1。

火山图结果显示分组比对中差异基因探针的分布。横坐标为差异倍数(fold change，log2)，纵坐标以负log(P值)代表差异的显著性。图中每一个点为一个检出的基因探针(不含控制探针及flagged探针)，见图2。Rosetta Resolver^?System进行全基因表达谱芯片的数据前处理分析。采用R3.0.3版本，丛聚分析采用package功能，主成分分析采用R内建的prcomp功能，当有过少的差异基因出现时执行ANOVA，one-way ANOVA中P 值小于0.00。结果显示慢性牙周炎样本中均存在显著差异表达的上调基因1 565个，下调基因1 849个。

2.1.2 无监督层次聚类分析实验样本间整体基因表达的相似性聚类分析的相关数据包含基因名称的聚类图。聚类分析是通过数据建模简化数据的一种方法，目的在于获得数据的分布状况，观察每一簇数据的特征。并以距离指标描述样本簇之间的关联性，见图3。分析中以差异表达基因探针讯号差异(该探针在所有芯片间的讯号值差异大于31 000)筛选出的294基因探针进入分析。

2.1.3 功能富集分析以差异基因进行生物途径富集分析。所有组别结果、芯片表达量与KEGG反应路径图、分析逻辑、详细结果与其他组生物途径富集分析相关数据，结果显示排名前3的信号通路主要是：PI3K-Akt信号通路、细胞黏附分子信号以及ECM-受体信号。见图4。

2.2 PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎中的表达通过上述结果发现PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎样本中表达增高，差异非常有显著性意义(P < 0.001)，因此将对PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎临床样本基因及蛋白水平的表达进行验证。

2.2.1 Real-Time PCR检测PI3K-Akt mRNA的表达情况 7例正常牙周膜组织及13例慢性牙周炎患者牙周膜组织进行Real time PCR验证。结果显示PI3K及Akt在慢性牙周炎临床样本中基因表达水平增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其结果与芯片结果一致。见图5。

2.2.2 Western Blot检测PI3K-Akt蛋白表达情况 4例正常牙周膜组织及4例慢性牙周炎患者牙周膜组织进行Western Blot验证。结果显示p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt在慢性牙周炎临床样本中蛋白表达水平增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其结果与芯片结果一致。见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计临床试验、分组对照观察。

1.2 时间及地点于2018年2月至2019年11月在海南医学院第一附属医院口腔科完成。

1.3 对象选取15例正畸拔牙患者正常牙周膜组织作为对照组，21例慢性牙周炎患者牙周组织，通过牙周手术中刮取的牙周组织。实验方案由海南医学院第一附属医院伦理委员会批准(批准号：HNM20180034)并获得所有患者的知情同意。对照组男性6例，女性9例；年龄为23-37岁；慢性牙周炎组男性8例，女性13例；年龄为27-40岁。两组之间性别、年龄比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

两种牙周组织中，4例正常牙周膜组织及4例慢性牙周炎患者牙周膜组织进行全基因组表达谱芯片试验，筛选慢性牙周炎上调及下调相关基因。7例正常牙周膜组织及13例慢性牙周炎患者牙周膜组织进行Real time PCR验证。4例正常牙周膜组织及4例慢性牙周炎患者牙周膜组织进行Western Blot验证。

1.3.1 慢性牙周炎样本纳入标准患者需要进行牙周手术且患者年龄大于18岁；曲面断层显示有的牙槽骨吸收，且2个或2个以上牙齿探诊深度(PD)≥6 mm。

1.3.2 排除标准患者患有糖尿病、高血压等全身系统性疾病。

1.4 材料人全基因组芯片(华联生物科技股份有限公司)；SYBR^® Premix ExTaqMⅡ(TaKaRa)；p-PI3K抗体(abcam)；PI3K抗体(Elabscuence)；Akt抗体(Elabscuence)；p-Akt抗体(abcam)；ECL 发光液(Thermo Fisher Scientific)；PVDF膜(Merck Millipore)；Trizol(TaKaRa)。

1.5 方法

1.5.1 全基因组表达谱芯片

(1)RNA萃取：将牙周炎及对照组样本置于EP管中，并进行研磨。加0.2 mL氯仿，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，取上层水相至EP管。加体积分数80%乙醇1 mL混匀，4 ℃，7 600 r/min离心5 min，弃乙醇，室温干燥5 min，取30 μL DEPC Treated DDW 溶解，-80 ℃储存备用。吸收光谱分析RNA 浓度和纯度。

(2)样品制备：RNA 样品扩增后，进行荧光标定反应及Phalanx OneArray^TM杂交反应，将NewOAHyb Buffer 置于加热板加热60 ℃约10 min，对夹空白芯片与完成前杂交的芯片，备用储存于50 ℃烘箱，于芯片口处加215 μL预热的aRNA mixture，套第二层热缩膜，置于50 ℃杂交烘箱旋转架16 h，打开芯片于小盒清洗液中于42 ℃震荡烘箱放置芯片摇洗5 min，杂交清洗液Ⅱ置于芯片中，弃杂交清洗液Ⅱ加25 ℃杂交清洗液Ⅱ摇洗后在杂交清洗液Ⅲ垂直向5 s，离心并甩干芯片，避光扫描。

1.5.2 Real-Time PCR检测PI3K及Akt的mRNA表达样本组织提取RNA，取出临床样本组织，用研磨棒抵住EP管底端于冰盒上间断研磨至匀浆状；将样品室温放置5-10 min，使核酸于核蛋白完全分离或4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；加200 μL氯仿于样本EP管中，剧烈震荡30 s，室温放置3 min 或4 ℃ 12 000 r/mim离心10 min；吸200 μL上层水相至EP管；加入100 μL无水乙醇，混匀，小离心机离心1.0-2.0 min；10 000 r/min离心30 s，弃掉收集管中液体。

引物序列，GAPDH：GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC与TGG TGA AGA CGC CAG TGG A；PI3K：AGC ATT GGG ACC TCA CAT TAC ACA与ACT GGA AAC ACA GTC CAT GCA CAT A；Akt：AGC GAC GTG GCT ATT GTG AA与CAC GTT GGT CCA CAT CTG。

1.5.3 Western Blot检测PI3K及Akt蛋白表达取临床慢性牙周炎组织以及正常组织分别为实验组和对照组，置于冻存管中放-80 ℃贮存备用。

提取样本总蛋白，测量蛋白浓度，蛋白变性，根据目的蛋白的分子量大小选择10%的分离胶，转膜，封闭、一抗孵育(抗体浓度PI3K及Akt为1∶500，p-PI3K、p-Akt及GAPDH为1∶1 000)，二抗孵育、显影，用BIO-RAD凝胶成像系统采集蛋白印迹结果，使用Image Lab软件进行蛋白印迹结果分析。

1.6 主要观察指标 ①差异倍数柱状图、火山图及聚类分析检测全基因组表达谱芯片的上调及下调基因；②生物途径富集分析检测慢性牙周炎中差异明显信号通路；③Real-Time PCR及Western Blot 验证PI3K及Akt是否与芯片筛选结果相一致。

1.7 统计学分析采用SPSS 17.0 for windows中卡方检验分析男女比例；t 检验及单因素方差分析对芯片结果、Real-Time PCR及Western Blot的结果进行检测，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

全基因组表达谱芯片是目前研究疾病基因特异性表达的主要方法之一，它不仅改善了之前只是针对于单一基因或者少数基因进行分析的缺点，它可以更广泛的对疾病进行全面的提取所能采集到的全部生物学信息，进而从分子生物学的基因角度对疾病进行快速及高通量的分析^[24-26]。

慢性牙周炎的主要特征是细菌刺激机体产生防御反应，造成了牙槽骨出现了骨组织的破坏^[9^，^27-29]。其主要原因是病原刺激物促进了破骨细胞的增殖量多余成骨细胞的增殖量^[30-31]。PI3K/Akt信号通路广泛存在于各种细胞中，在细胞的增殖、分化、存活、凋亡、炎症等方面发挥着重要作用，并且该信号通路参与了以骨破坏为主要特征的骨质疏松、骨关节炎、骨肉瘤等疾病中^[32-37]。PI3K是位于细胞内的一种磷脂酰肌醇3激酶，可以激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt后，激活下游因子，进而影响细胞的增殖与凋亡^[38-43]。

此次研究通过采用HunmanOneArray Plus全基因组表达图谱进行基因芯片筛选，发现在所检测的慢性牙周炎临床样本采用差异倍数柱状图、火山图检测全基因组表达谱芯片的上调及下调基因，结果显示慢性牙周炎样本中均存在显著差异表达的上调基因1 565个，下调基因1 849个。试验采用的是表达谱基因芯片较常见的全基因组测序及转录组测序芯片而言，其改进了以前针对单一或少数基因分析的缺点，它可以最广泛全面的提取所能采集到的生物信息，综合分析疾病发展过程中多基因的功能其表达，具有高通量、速度快等特点。有学者通过全基因组测序发现在慢性牙周炎中ECM-受体相互作用、细胞黏附分子、焦点粘连等信号通路密切相关。

为了更好的检测基因差异，采用聚类分析筛选出的294基因探针进入分析，之后以差异基因进行生物途径富集分析。所有组别结果、芯片表达量与KEGG反应路径图、分析逻辑、详细结果与其他组生物途径富集分析相关数据，结果显示排名前3的信号通路主要是：PI3K-Akt信号通路、细胞黏附分子信号以及ECM-受体信号。而由于目前关于PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎中的研究较少，且其是此次基因芯片筛选出的首条通路，通过Real-Time PCR及Western Blot在慢性牙周炎临床样本中对PI3K-Akt 信号通路的表达进行了验证，结果表明PI3K及Akt在慢性牙周炎中较对照组表达高，此结果与芯片筛选结果相一致。Western Blot的结果显示PI3K及Akt在慢性牙周炎及对照组中表达差异不明显，之后检测了p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt的蛋白表达情况，结果显示p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt的蛋白表达在慢性牙周炎表达增高，其结果表明PI3K及Akt是通过其磷酸化发挥其调节慢性牙周炎的骨破坏及炎性相关的功能。研究表明PI3K-Akt信号通路与炎症密切相关，在胃溃疡患者的胃黏膜中发现PI3K-Akt信号通路表达增高，试验发现在慢性牙周炎患者中PI3K-Akt信号通路表达增高，可能与其与炎症密切相关有关。此次研究通过全基因组表达图谱筛选出PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎中为重要的信号通路，但是其在慢性牙周炎中起到的作用，以及其在炎性通路中的作用，需要进一步细胞学实验进行验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因中的作用

Screening chronic periodontitis-related genes using whole-genome expression profiling

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