2.1  不同浓度二乙酰吗啡对心肌细胞形态的影响  荧光显微镜下可见，在培养至第3天时，部分心肌细胞开始出现自发性搏动，搏动频率相对较缓慢；当细胞培养至第7天时，95%以上心肌细胞恢复自发性搏动，部分心肌细胞呈伪足成簇状、片状或者团状相连，并以统一的收缩节律搏动，搏动频率为110-145次/min，见图1A。在对照组中，心肌细胞数量较多，形态完整、清晰且多样化，多呈三角形、长梭形和多边形，胞膜边缘透亮，核呈圆形或类圆形，细胞内结构大小基本相似，核膜结构清晰，见图1A。细胞相连成片，呈统一聚集。随着二乙酰吗啡药物浓度增加，成活的心肌细胞数量逐渐减少，胞质体积缩小，胞膜收缩，伪足减少，细胞核结构模糊，部分细胞出现碎片，自发性收缩频率减少，有部分细胞出现停搏现象，类似于窦性停搏、心动过缓及二联律等表观现象，见图1B-E。在二乙酰吗啡浓度为10^-4 mol/L时，心肌细胞形态改变数量和搏动频率明显增加，此时心肌细胞可作为后续实验。

      当加入10^-4 mol/L二乙酰吗啡与20 μmol/L维拉帕米联合干预心肌细胞，细胞形态结构基本完整，胞质结构清晰，分布均匀，细胞核椭圆形或类圆形，核膜光滑，心肌搏动频率100-130次/min，由此推测，在二乙酰吗啡作用下，维拉帕米对部分心肌细胞形态异常、节律快慢和自发性搏动频率有一定的调节作用，见图1F。随着二乙酰吗啡浓度的增加，导致心肌细胞形态结构异常数量增加，细胞萎缩数量亦逐渐增加，呈现明显的剂量依赖性，见图2。方差分析得出，不同浓度二乙酰吗啡导致的心肌细胞形态和搏动频率明显改变，心肌细胞形态异常数量差异有显著性意义(P < 0.05)。

      当加入10^-4 mol/L二乙酰吗啡与20 μmol/L维拉帕米联合干预心肌细胞，细胞形态结构基本完整，胞质结构清晰，分布均匀，细胞核椭圆形或类圆形，核膜光滑，心肌搏动频率100-130次/min，由此推测，在二乙酰吗啡作用下，维拉帕米对部分心肌细胞形态异常、节律快慢和自发性搏动频率有一定的调节作用，见图1F。随着二乙酰吗啡浓度的增加，导致心肌细胞形态结构异常数量增加，细胞萎缩数量亦逐渐增加，呈现明显的剂量依赖性，见图2。方差分析得出，不同浓度二乙酰吗啡导致的心肌细胞形态和搏动频率明显改变，心肌细胞形态异常数量差异有显著性意义(P < 0.05)。

    采用Dunnett-t 检验法分析结果得出，与对照组相比，二乙酰吗啡组中心肌细胞自发性搏动频率明显减少(P=0.00)。由此说明，二乙酰吗啡能够调节心肌细胞自发性搏动频率；与二乙酰吗啡组相比，在二乙酰吗啡+维拉帕米组中心肌细胞自发性搏动频率明显增加(P=0.02)，见表1。表明维拉帕米在二乙酰吗啡干预下，对心肌细胞搏动频率有相应的调节作用。

2.2  心肌细胞膜电位和动作电位的改变  培养第7天的心肌细胞在浓度为10^-4 mol/L二乙酰吗啡作用24 h和48 h后，动作电位发生明显改变。与对照组相比，二乙酰吗啡干预心肌细胞24 h后，动作电位幅度明显降低(P=0.00)，动作电位时程明显延长(P=0.03)，而静息膜电位则无明显变化(P=0.456)；当其作用心肌细胞48 h后，静息膜电位负值减小(P=0.022)，动作电位幅度明显降低(P=0.000)，动作电位时程明显延长(P=0.003)。二乙酰吗啡作用心肌24 h和 48 h时， 静息膜电位和动作电位幅度接近(P=0.058，P=0.681)，而动作电位时程差异有显著性意义(P=0.031)，见表2，图3。

2.2  心肌细胞膜电位和动作电位的改变  培养第7天的心肌细胞在浓度为10^-4 mol/L二乙酰吗啡作用24 h和48 h后，动作电位发生明显改变。与对照组相比，二乙酰吗啡干预心肌细胞24 h后，动作电位幅度明显降低(P=0.00)，动作电位时程明显延长(P=0.03)，而静息膜电位则无明显变化(P=0.456)；当其作用心肌细胞48 h后，静息膜电位负值减小(P=0.022)，动作电位幅度明显降低(P=0.000)，动作电位时程明显延长(P=0.003)。二乙酰吗啡作用心肌24 h和 48 h时， 静息膜电位和动作电位幅度接近(P=0.058，P=0.681)，而动作电位时程差异有显著性意义(P=0.031)，见表2，图3。

2.3  心肌细胞膜电位情况  在激光共聚焦显微镜观察下，在对照组中，DiBAC4(3)荧光较弱，细胞荧光强度一般；在二乙酰吗啡组中，DiBAC4(3)荧光强度最强，心肌细胞异常数量较多；在二乙酰吗啡+维拉帕米组中，DiBAC4(3)平均荧光强度较强，心肌细胞异常数量一般，且与二乙酰吗啡组相比，细胞荧光强度较低(P > 0.05)；与对照组相比，二乙酰吗啡组和二乙酰吗啡+维拉帕米组细胞平均荧光强度较强(P=0.022，P=0.047)，图4。

随着人们生活水平提高，药物滥用已成为当今社会亟需解决的主要问题之一。二乙酰吗啡，即海洛因，属于阿片类药物，是一种较为常见的毒品，其滥用程度、成瘾危害已成为世界性难题。二乙酰吗啡可造成人类身心较为严重的依赖，同时其具有成瘾快、依赖性强、戒断反应明显等特点^[1]。大量临床研究显示，二乙酰吗啡会造成多种脏器损伤，且对心脑血管的损伤尤为突出^[2]。长期吸食二乙酰吗啡可导致心功能异常，同时也会诱发机体多种类型的心律失常^[3-4]。

钙离子(Ca²⁺)是细胞内一种重要的第二信使，主要负责维持细胞膜正常电生理功能，以及确保机体多种生物信号转导途径正常进行，研究发现其在阿片受体介导的信号途径中发挥着重要的作用。心肌细胞膜表面存在钾离子、钠离子、钙离子等多种离子通道。钙离子通道正常运行是保证心肌细胞正常收缩和舒张的重要前提，且钙离子通道受到CaM、激活的CaMKⅡ和钙调神经磷酸酶等多种钙依赖调节蛋白调控。然而阿片类药物可作用于心肌细胞中的钙离子或者钙调蛋白，进而导致心肌节律发生改变，从而诱发不同类型的心律失常^[5]。在吗啡等阿片类药物的影响下，心肌细胞膜电位和Ca²⁺电流可发生变化，同时心肌节律出现异常。那么这些特征改变是否是二乙酰吗啡致心律失常的主要因素呢？目前尚无结论。

维拉帕米，是一种罂粟碱的衍生物，为钙通道阻滞剂，可阻断细胞膜L型钙离子大量内流。维拉帕米可以抑制钙内流，降低心脏舒张期自动去极化速率，而使窦房结的发放冲动减慢，也可减慢传导，因而可以消除房室结折返。

      因此，实验为避免机体应激性反应和神经性调节干预心肌细胞节律，拟采用离体SD大鼠心肌细胞进行培养，通过二乙酰吗啡进行心肌细胞干预，探索二乙酰吗啡损伤心肌细胞形态、调控细胞膜电位和钙离子通道的机制，以期获得二乙酰吗啡致心律失常的证据。其结果将为吸毒成瘾而导致心律失常的患者提供诊疗和防治方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年10月至2019年10月在新疆医科大学第一附属医院临床研究院实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级SD乳鼠10只，鼠龄两三天，雌雄不限，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SYXK(新)2018-0003。所有动物使用和管理均于2018-05-21经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准，批准号IACUC201805-K1。动物处理均在新疆医科大学第一附属医院临床研究中心完成。

1.3.2  实验用主要试剂  新疆维吾尔自治区缉毒总队提供二乙酰吗啡(纯度95%以上)。DMEM培养基、澳洲胎牛血清、5-溴脱氧尿苷、青霉素/链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶均购自Gibco公司；维拉帕米购自于上海麦克林生化科技有限公司；5-溴脱氧尿苷、葡萄糖、多聚赖氨酸均购自Sigma公司；羊抗鼠二抗(Alexa Flour^® 488)试剂盒购自Abcam公司；无Ca²⁺ D-Hank’s液(pH 7.2)、中性甲醛均购自北京索莱宝公司；膜电位荧光探针DiBAC4(3)购自AAT Bioquest公司；细胞计数板购自于大连凯美化工工程配套有限公司；倒置荧光显微镜购自日本OLYMPUS公司；膜片钳放大器(EPC10)购自德国HEKA公司；微操纵器(MP225)、电极拉制仪(P97)、毛细玻璃管(BF150-86-10)均购自美国Sutter Instruments公司；激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP8) 购自德国Leica公司。

1.4  方法

1.4.1  乳鼠心肌细胞培养  取乳鼠，于左肋缘和左锁骨中线做斜行和纵行切口，分离心脏，置于D-Hank’s液(4 ℃)中，剪取心脏心尖部分，D-Hank’s液洗去残留血液(3次)。全程操作均在冰面上进行。剪碎心肌组织，胰蛋白酶消化12 h，加入DMEM液终止，加入0.6 g/L Ⅱ型胶原酶，消化，收集上清液，重复以上操作3次，DMEM液终止，离心弃上清液。将细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除心肌中成纤维细胞,重复以上操作2次。计数板计数心肌细胞，以5×10⁸ L^-1细胞量接种培养皿中，孵育前3 d加入5-溴脱氧尿苷抑制心肌成纤维细胞的增殖，于第5天观察心肌细胞活动状态。当细胞连成片状，且多数心肌细胞以相同频率搏动时，即可用于后续药物功能实验^[6]。

1.4.2  心肌细胞损伤和形态学改变  以0，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5 mol/L浓度二乙酰吗啡分别干预心肌细胞24 h。选择最适合浓度二乙酰吗啡用于后续实验。

后续实验中细胞分为3组：对照组、二乙酰吗啡组以及二乙酰吗啡+维拉帕米组。后2组分别以二乙酰吗啡、二乙酰吗啡+维拉帕米(浓度20 μmol/L)联合干预心肌细胞；对照组加入等量PBS。3组体外培养24 h后，在荧光倒置显微镜下计数心肌细胞形态学改变的数量、自发性搏动频率及节律的情况。

1.4.3  膜片钳技术检测膜电位和动作电位变化  将   10^-4 mol/L二乙酰吗啡分别作用心肌细胞24 h和48 h后，检测动作电位和Ca²⁺离子通道电流，整个实验中封接电阻>200 MΩ。当全细胞记录模式建立后，详细记录心肌膜电位和动作电位变化。在数模转换器下完成离子通道——钙刺激信号，采集和分析数据。动作电位配液参照文献^[7]。

1.4.4  激光共聚焦检测心肌膜电位  将细胞浓度5×10⁸ L^-1细胞悬液接种于经多聚赖氨酸预处理过的培养皿，在不同干预条件(对照组、二乙酰吗啡组以及二乙酰吗啡+维拉帕米组)作用心肌细胞24 h后，弃去培养基，PBS漂洗，在培养皿中加入膜电位荧光探针DiBAC4(3)，暗室孵育15 min。在激光共聚焦显微镜下观察并拍照，激发波长为488 nm。用Image J软件计数细胞数量，分析平均荧光强度。以平均荧光强度表示膜电位电流情况。

1.5  主要观察指标  ①不同浓度二乙酰吗啡对心肌细胞形态的影响和心肌萎缩数量改变；②心肌细胞膜电位和动作电位的改变 。

1.6  统计学分析  所有数据均为SPSS 17.0软件(美国SPSS公司)进行统计分析，结果以x(_)±s表示，采用配对双侧t 检验，多组间采用单因素方差和Dunnett-t 检验法分析，计数资料采用χ²检验，检验水准为α=0.05

      二乙酰吗啡属于半合成阿片受体激动剂，与阿片受体结构相似，具有成瘾快、戒断难度大、危害重等特点。在人体多个脏器中存在内源性阿片肽和阿片受体，若长期使用二乙酰吗啡会造成人体的免疫功能严重破坏，重要脏器受到损害，尤其是心脑器官损伤较为严重^[8]。阿片类物质主要对循环系统调控较为显著，其临床表现有心悸、胸闷、心前区压榨感、心肌供血不足、窦性心律不齐、束支传导阻滞，心电图还可出现ST-T段改变、心肌酶谱升高等体征^[9-10]。

SZTAJZEL等^[11]曾报告了相关案例，一名年轻妇女在滥用二乙酰吗啡后发生了心电图ST明显抬高，冠状动脉造影示左前降支冠状动脉闭塞，临床诊断为急性前壁心肌梗死，认为二乙酰吗啡可能通过直接作用血管受体，导致局部冠状动脉痉挛或者刺激炎症因子大量增多，引起冠状动脉闭塞从而导致心肌供养不足、心前区疼痛、急性心梗等临床表现。PAVLIDIS团队^[12]研究了113例长期静脉注射海洛因的吸毒人员并探讨海洛因诱发急性心肌梗死的相关性，数据结果显示，113例海洛因成瘾者的心脏组织学检查中仅1例心脏出现急性心肌梗死，这说明海洛因诱发心律失常和造成心肌毒性是独立的影响因素，两者可能并无相关性^[13]。在一些动物实验中，二乙酰吗啡可以对心脏直接发挥毒性作用，还可以导致微循环障碍，引起急性循环系统休克症状^[14]。截止到目前，二乙酰吗啡致人体心肌梗死的发生机制尚未阐述清楚。二乙酰吗啡引起心肌损伤的研究假说主要集中为横纹肌萎缩症、心肌缺氧、体循环酸中毒、肌肉坏死溶解释放的血管收缩物质，或者诱发机体产生过敏反应^[15]。

吗啡可引起心肌细胞游离Ca²⁺浓度明显升高，瞬时出现钙超载，并能迅速下降到正常水平，从而导致心肌过度收缩，出现一过性的正性肌力，当肌浆网内的Ca²⁺释放而被耗竭后，心肌细胞才出现明显的负性肌力作用，此时心肌收缩节律出现明显异常^[14，16]。吗啡类物质可使大鼠心肌细胞内Ca²⁺瞬时升高。在海洛因引起的心肌细胞钙超载过程中，维拉帕米可发挥一定的逆转效果，对心肌细胞起到相应的保护作用，减少心肌细胞的损伤或者降低死亡^[17]。这与此次实验中维拉帕米对心肌保护的钙电流变化结果基本一致。二乙酰吗啡与阿片受体结构较为相似，属于外源性受体，但其脂溶性、作用部位、效果、起效速度、戒断症状、持续时间等问题，在机体代谢速度均不同于合成吗啡类药物和阿片受体纯激动剂的效果^[18-21]。那么，阿片类药物对机体的影响是否能完全说明二乙酰吗啡对人体心脏的毒理作用呢？是否能完全阐述其致心律失常的具体机制呢？这有待于更多的研究数据结果来说明。

G蛋白偶联受体是以糖蛋白结构为主，阿片受体是其重要成员。阿片受体具有κ，δ，μ三种亚型，当外源性配体与胞外结构域特异性结合，通过蛋白链将信号传递至胞内，参与胞质内信号转导分子生物学效应^[22-23]。阿片受体系统分布在机体不同部位，其中心肌细胞膜和血管壁存在着多种阿片受体亚型，不同类型受体发挥着不同生物学效应，而Ca²⁺信号通路却发挥重要的作用^[24-26]。在大鼠心肌缺血再灌注研究中，阿片类药物激动阿片受体，激活细胞内低氧诱导因子1a信号途径，心肌细胞发挥自我保护作用^[27-28]。心肌和血管膜上主要为κ受体系统，刺激心脏合成内源性阿片肽，对心肌产生负性变力变时效应，发挥心脏自我分泌调节^[29]。在大鼠离体灌流时，内啡肽可导致心肌明显收缩，而纳洛酮可显著减少这一过程的发生，这提示内源性阿片肽和心律失常的发生机制有着相关性。在放射受体分析和离体动脉收缩实验中，PRZEWŁOCKI等^[30]研究团队证实了兔肠系膜血管和耳动脉上存在少量的κ型阿片受体，MINAMI等^[31]认为心肌细胞胞膜主要存在κ1和κ2两种亚型的阿片受体；然而，YAMAZAKI等^[32]却认为心肌细胞膜主要以δ亚型为主，κ型阿片受体主要存在血管壁上，在心肌缺血再灌注损伤中δ受体激动剂对心肌起到相应的保护作用。在成熟小鼠心肌中主要为κ和δ型受体，新生小鼠心肌则主要为κ和μ型受体，这一观点被ZIMLICHMAN等^[33]所提出。然而，何种类型的阿片受体(κ，δ，μ受体)参与了二乙酰吗啡诱发大鼠心肌节律异常的过程鲜见报道。

作者此次将二乙酰吗啡直接作用于乳鼠心肌细胞，随着二乙酰吗啡药物浓度的增加，心肌细胞存活数量减少，胞质体积缩小，胞膜收缩，伪足减少，细胞核结构模糊，心肌细胞出现碎片，自发性收缩频率降低，部分细胞出现停搏、心动过缓、二联律等表观现象。当心肌细胞功能发生异常后，通过膜片钳技术检测细胞电生理，结果发现在二乙酰吗啡作用下，心肌细胞膜静息膜电位负值明显降低，动作电位幅度明显降低，动作电位动作电位时程显著增加，动作电位时程延长。由此推测，二乙酰吗啡可能直接作用心肌细胞膜，导致心肌结构异常，干扰心肌细胞自发性节律，影响心肌收缩功能，这可能主要是二乙酰吗啡作用心肌膜上的阿片受体，激活Ca²⁺信号通路促使细胞膜上静息时[Ca²⁺]i的瞬时释放增加，心肌呈一过性负性肌力，从而影响心肌收缩节律。

细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光指示剂DiBAC4(3)是一种带有长波长激发和发射光灵敏的膜电位探针，自身无荧光强度，可与胞浆内的特异性蛋白结合，在激发光的激活下，探针才会发出荧光，荧光强度随结合蛋白数量增多而增加，即膜电位增加(细胞去极化的强度)；相反，细胞内荧光强度降低即膜电位降低(细胞超极化)。维拉帕米(又名异搏定、戊脉安)属于罂粟碱的衍生物，可抑制细胞膜钙内流，降低心脏舒张去极化速率，减慢心肌窦房结的发放冲动和传导力，从而可以消除临床上房室结折返。其次，维拉帕米还可使机体外周血管扩张，血压降低，机体反射性的加快心率。更多研究结果显示，维拉帕米对心脏血管发挥舒张作用，尤其是冠状动脉，增加冠脉血流量，提高心肌供氧能力。当二乙酰吗啡干预心肌细胞后，DiBAC4(3)荧光强度明显增高，提示二乙酰吗啡作用于心肌细胞膜，刺激胞膜钙电流，导致细胞外钙内流减少，复极时间延长，细胞膜电位显著降低，动作电位时程增加。这可能是二乙酰吗啡耗竭心肌细胞内Ca²⁺的储存，减少细胞钙内流，心肌细胞收缩能力降低，这与动物实验中二乙酰吗啡使大鼠心电图异常，心率下降、波幅降低的结果基本一致^[34]。在维拉帕米的影响下，心肌细胞DiBAC4(3)荧光强度有所下降，表明维拉帕米在二乙酰吗啡致心肌节律异常中起到一定程度的保护作用，减少了部分心肌电流的异常改变，这可能是维拉帕米阻断L型钙通道电流，减少[Ca²⁺]i的瞬时释放，调整心肌收缩节律。

      综上所述，此次实验进一步明确二乙酰吗啡可直接作用SD乳鼠心肌细胞，与膜上的钙离子通道有相关作用，从而导致心肌收缩能力下降，节律发生异常。那么何种类型的阿片受体参与了二乙酰吗啡诱发大鼠心肌节律异常的过程尚不明确，这有待于未来进一步探索二乙酰吗啡如何作用心血管系统，寻找其作用心肌细胞的证据，为吸食二乙酰吗啡导致的心律失常患者的临床诊断和治疗提供诊疗方向，为司法检案中长期注射二乙酰吗啡而导致心源性猝死病案发生机制奠定理论基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

二乙酰吗啡：半合成的阿片受体纯激动剂，由吗啡和醋酸酐为原料经化学反应制成，其镇痛作用强于吗啡，镇痛效果为吗啡的4-8倍，其成瘾速度快，戒断难度大。长期使用后不仅会对人体的免疫功能造成严重破坏，还可导致心、肝、肾等重要脏器的功能损害。

钙离子：作为细胞内第二信使，主要负责维持细胞膜正常电生理功能，以及确保机体多种生物信号转导途径正常进行。在心肌缺血缺氧过程中，当缺血引起心肌异常的L型钙电流逐渐恢复正常，钾通道活性程度降低，导致动作电位时程相对延长，L型钙电流在激活和失活的重叠区形成“窗流”，导致心肌细胞膜电位不稳而形成电震荡；当细胞内Ca2+大量积聚，增加 Ca2+-CaM复合物生成，心肌细胞易造成早期和晚期后除极，导致室性心律失常概率增加。

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心律失常是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，即心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病，亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势、是否导致严重血流动力障碍有关，可突然发作而致猝死，亦可持续累及心脏而致其衰竭。

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