妊娠对大鼠脂肪干细胞增殖及成肝分化潜能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5287-5292.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.007

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妊娠对大鼠脂肪干细胞增殖及成肝分化潜能的影响

李俊男¹，陈嘉勇²，张毅²，陆晓涛¹

¹昆明医科大学第四附属医院骨与创伤外科，云南省昆明市 650000；²昆明医科大学第二附属医院急诊医学部，云南省昆明市 650000

修回日期:2017-08-25 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 陈嘉勇，博士，教授，博士生导师，昆明医科大学第二附属医院急诊医学部，云南省昆明市 650000
作者简介:李俊男，男，1984年生，云南省昆明市人，汉族，2017年昆明医科大学毕业，博士，医师，主要从事间充质干细胞研究。

Pregnancy influences the proliferation and hepatic differentiation of rat adipose-derived stem cells

Li Jun-nan¹, Chen Jia-yong², Zhang Yi², Lu Xiao-tao¹

¹Department of Orthopedics and Traumatology, Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China; ²Department of Emergency, Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China

Revised:2017-08-25 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Chen Jia-yong, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Emergency, Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China
About author:Li Jun-nan, M.D., Physician, Department of Orthopedics and Traumatology, Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650000, Yunnan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪干细胞的优势：近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究报道脂肪干细胞在体外培养条件下具有多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞以及横纹肌细胞。脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时取材无创方便，少量组织即可获取大量干细胞。脂肪干细胞对体外培养条件需求较低，能够快速传代生长，并能够保持稳定的倍增率直到13-15代，适宜大规模培养。这些优势使其成为最具临床应用前景的干细胞。
成肝细胞诱导分化：即体外使用不同培养基，加入不同的生长因子或特殊血清定向诱导间充质干细胞可转化为肝前体细胞或肝细胞。已发表的文献表明，间充质干细胞转分化为肝细胞主要受以下关键因素的影响：①细胞因子和生长因子；②来自细胞外基质的组成；③间充质干细胞培养的物理参数。通过对这些因素的研究，科研人员将不断开发改良诱导间充质干细胞成肝分化的研究策略。

摘要
背景：研究发现妊娠与干细胞的活性有明显关联。然而，尚未见到有关妊娠对脂肪干细胞影响的相关报道。
目的：评估妊娠状态对大鼠脂肪干细胞增殖能力和诱导分化为类肝细胞潜能的影响。
方法：分别获取正常大鼠和妊娠大鼠2种来源的脂肪干细胞进行原代分离、培养和鉴定。利用CCK8法检测脂肪干细胞的增殖能力。采用相同肝诱导培养基，诱导脂肪干细胞分化为类肝细胞。荧光定量PCR检测诱导第0，7，14，21天时肝细胞标志物的表达；ELISA方法检测白蛋白分泌和尿素合成水平。
结果与结论：①成功分离培养出正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞，经流式细胞术鉴定符合干细胞一般特性(CD44⁺/CD45^-/CD90⁺)；②与正常大鼠来源脂肪干细胞相比较，妊娠大鼠来源脂肪干细胞增殖更快，诱导分化为成骨、成脂和成肝细胞时间更短，肝细胞标志物变化更加迅速，白蛋白分泌和尿素合成能力更高；③妊娠对脂肪干细胞的增殖和分化具有促进作用，推测可能与雌激素水平相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4354-349X(李俊男)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 妊娠, 细胞增殖, 成肝分化

Abstract:

BACKGROUND: Pregnancy exhibits a significant association with stem cell activity. However, there is yet no report on the effects of pregnancy on adipose-derived stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of pregnancy on the proliferation and differentiation of rat adipose-derived stem cells into hepatocyte-like cells.
METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated and cultured from normal and pregnant Sprague-Dawley rats, and identified. The cell proliferation was detected by cell counting kit-8. All harvested adipose-derived stem cells were cultured in hepatocyte-induced medium and induced to differentiate into hepatocyte-like cells. Then the expressions of hepatocyte markers were detected at 0, 7, 14, 21 days of induction by fluorescent quantitative PCR; albumin secretion and urea synthesis were detected by using ELISA method.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells were successfully isolated from normal and pregnant rats, and CD45 negative staining and CD44/CD90 positive staining were observed, which was consistent with the characteristics of stem cells. Compared to the normal cells, adipose-derived stem cells from pregnant rats showed faster proliferation as well as osteogenic, adipogenic and hepatocyte-like differentiation, with the better liver function of hepatocyte-like cells. To conclude, pregnancy can promote the proliferation and differentiation of adipose-derived stem cells, which may be related to the estrogen level.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Pregnancy, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Hepatocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李俊男，陈嘉勇，张毅，陆晓涛. 妊娠对大鼠脂肪干细胞增殖及成肝分化潜能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5287-5292.

Li Jun-nan, Chen Jia-yong, Zhang Yi, Lu Xiao-tao. Pregnancy influences the proliferation and hepatic differentiation of rat adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5287-5292.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪干细胞分离、培养与鉴定 原代大鼠脂肪干细胞最开始呈圆形，0.5-1.0 h内开始贴壁，在2-4 h后基本完成贴壁。传代后培养24 h可见脂肪干细胞贴壁生长，细胞形态伸展为三角形、多角形，最终逐渐变为典型的短梭形(图1)。

取第3代脂肪干细胞进行鉴定，结果表明，妊娠大鼠来源脂肪干细胞符合干细胞表面分子标志物特性(CD44⁺、CD45^-、CD90⁺)(图2)。成骨诱导21 d后茜素红染色和成脂诱导7 d后油红O染色结果表明分离培养的脂肪干细胞具有多向分化潜力(图3)。

2.2 正常大鼠来源和妊娠大鼠来源脂肪干细胞增殖情况 通过CCK8法对正常大鼠脂肪干细胞和妊娠大鼠脂肪干细胞的生长趋势进行了对比分析(图4)。通过生长曲线及统计结果可以看出，大鼠脂肪干细胞在第1次传代培养后的前2 d，处于细胞生长潜伏期，生长比较缓慢；随后开始进入对数生长期，表现为生长曲线一直呈现上升趋势，在第5天时达到最多数量。妊娠大鼠脂肪干细胞从第1次传代开始，同样经历了一个24 h的缓慢生长期，随后第3，4，5天，妊娠大鼠脂肪干细胞的增殖速度高于正常大鼠脂肪干细胞，差异均有显著性意义。

2.3 正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞的成肝分化能力 在诱导液的作用下，正常大鼠脂肪干细胞的增殖速度明显放缓。诱导3 d后，脂肪干细胞开始收缩，并逐步转化为不规则的多边形态。随着成肝诱导时间的延长，这种不规则多边形细胞数量也不断增加(图5A-B)。诱导14 d后，部分脂肪干细胞转化为正常贴壁的不规则多边形态或具有上皮形态的细胞，其与实验室常用的大鼠肝细胞相似(图5C)。

与正常大鼠脂肪干细胞相比较，妊娠大鼠脂肪干细胞的增殖速度并未受到成肝诱导液影响。诱导3 d后，妊娠大鼠脂肪干细胞的细胞学形态同样开始出现变化。诱导7 d和14 d时，大部分细胞开始逐渐变化为类肝细胞形态(图5E-F)。

2.4 正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞成肝分化后肝细胞标志因子的表达 见图6。正常大鼠来源脂肪干细胞在诱导第7天检测到AFP和CK18的表达，但未检测到ALB的表达；诱导第14天开始检测到ALB的表达，诱导第21天时检测到TAT和G-6-P的表达；AFP的表达在第21天时明显降低。

与正常大鼠来源的脂肪干细胞相比，妊娠大鼠来源的脂肪干细胞在诱导第7天检测到AFP、CK18和ALB的表达，但ALB的表达水平较低；诱导第14天开始AFP、ALB和CK18的表达水平均显著升高，且均高于正常大鼠来源脂肪干细胞的表达水平，差异有显著性意义。诱导第21天时检测到TAT和G-6-P的表达，且均高于正常大鼠来源脂肪干细胞的表达水平，差异有显著性意义。诱导第21天时妊娠大鼠来源脂肪干细胞中AFP的表达水平与第14天时基本一致，未见到明显降低，差异无显著性意义。

2.5 正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞成肝分化后类肝细胞的功能 为进一步检测脂肪干细胞分化成的类肝样细胞是否具有成熟肝细胞的常规功能，对诱导后的分化细胞进行了白蛋白和尿素分泌能力检测。结果发现，与未诱导前二者的分泌水平相比，正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞诱导分化成的类肝样细胞均能够正常分泌白蛋白，也能够利用培养液中的HN₄Cl合成尿素。其中正常大鼠来源脂肪干细胞在诱导21 d后，白蛋白分泌较第0，7，14天时显著升高，差异有显著性意义；而妊娠大鼠来源脂肪干细胞在第14天时的白蛋白分泌水平显著升高，在第21天时持续升高，差异均有显著性意义(P均< 0.05)，见图7A。

正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞在诱导后第7天时均开始展示尿素合成能力，随后尿素水平不断升高，并在第21天时达到顶峰，正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞诱导后的尿素合成能力差异无显著性意义(P均> 0.05)，见图7B。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年1月至6月在中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，18周龄，体质量为220-300 g，购自北京维通利华生物公司。

1.3.2 主要试剂 脂肪干细胞培养液和脂肪干细胞成骨诱导液(Cyagen公司)；茜素红染液(美国Sigma公司)；表皮生长因子、人肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺(美国GIBCO公司)；Cell-Counting Kit-8(CCK8)试剂盒(日本同仁化工研究所)；Trizol(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(日本东洋纺生物公司)；荧光定量试剂盒(美国KAPA biosystem公司)；微量白蛋白ELISA试剂盒(上海生工)；尿素检测试剂盒(美国RANDOX公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 妊娠大鼠的建立 18周龄SD雌鼠6只，雄鼠3只，按照雌雄2︰1比例进行合笼过夜，第2天若见雌鼠阴道栓即选为实验用妊娠大鼠第1天。在孕7 d后，进行取材分离大鼠脂肪干细胞。正常大鼠按照标准进行饲喂，到实验时间点进行取材分离大鼠脂肪干细胞。

1.4.2 大鼠脂肪干细胞分离、培养与鉴定 颈椎脱臼法处死正常和妊娠SD大鼠，无菌条件下解剖开腹腔，取出约5 mL大网膜脂肪组织。将取出的组织置于90 cm培养皿中，用PBS反复冲洗，去除肉眼可见的非脂肪组织。组织剪碎后，置于Ⅰ型胶原酶37 ℃消化1 h。随后，200目滤网滤弃未消化的组织。将离心收集的滤液，加入含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液进行细胞重悬，进行原代细胞培养。24 h后，更换培养基，去除未贴壁细胞，待细胞达到80%-90%汇合后，进行消化传代。在光学显微镜下，观察脂肪干细胞的贴壁和死亡情况。取第3代细胞利用流式细胞术进行干细胞表面标志物的鉴定。

1.4.3 大鼠脂肪干细胞分化潜能检测 取第3代大鼠脂肪干细胞，以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板中，正常培养基过夜培养；待细胞贴壁达到80%-90%汇合后，更换为成骨、成脂诱导培养基，每隔3 d换液1次。成骨诱导21d后使用茜素红染色，成脂诱导7 d后使用油红O染色，光学显微镜下进行拍照，观察诱导效果。脂肪干细胞完全培养基：DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、双抗。成骨分化诱导液：地塞米松10 μmol/L，维生素C 50 μmol/L，β-甘油磷酸钠10 mmol/L定容至100 mL高糖DMEM。成脂分化诱导液：地塞米松1 μmol/L，胰岛素10 mg/L，消炎痛200 μmol/L，体积分数为10%胎牛血清，定容至100 mL高糖DMEM。

1.4.4 CCK8检测细胞增殖情况 正常大鼠脂肪间充质干细胞和妊娠大鼠脂肪间充质干细胞分别以细胞浓度1×10⁸ L^-1接种于6孔板，每孔100 μL。CCK8检测细胞增殖情况，按说明书进行操作，用酶标仪在450 nm处测定每个时间点的吸光度，连续监测5 d，每个时间点重复3次。

1.4.5 大鼠脂肪干细胞的成肝诱导 按照文献[8]报道的方法诱导大鼠脂肪干细胞分化为类肝细胞，具体为：细胞在含有20 μg/L表皮生长因子，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清DMEM中培养2 d，随后更换为20 μg/L人肝细胞生长因子，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和4.9 mmol/L(0.61 g/L)烟酰胺继续培养21 d，收集细胞进行分化水平检测。每两三天在相差显微镜下观察脂肪干细胞形态变化，并拍照记录。

1.4.6 实时荧光定量检测肝细胞标志因子的变化 大鼠脂肪干细胞向类肝样细胞诱导分化0，7，14，21 d，应用Trizol法抽提总RNA，反转录合成cDNA后，通过qPCR检测AFP、CK18、TAT、ALB、G-6-P等肝系细胞相关基因的表达。

1.4.7 类肝细胞分化功能检测 大鼠脂肪干细胞向类肝样细胞诱导分化0，7，14，21 d，收集培养细胞上清。采用ELISA方法检测白蛋白分泌水平。采用酶动力法检测尿素含量。所有操作方法均依据试剂盒说明书进行。

1.5 主要观察指标 ①正常大鼠和妊娠大鼠脂肪干细胞的形态、表型、成骨、成脂、成肝分化潜能；②成肝诱导后肝细胞标志因子的mRNA表达；③成肝诱导后肝细胞相关的白蛋白分泌水平和尿素含量。

1.6 统计学分析 实验数据采用 GraphPad Prism 6.0软件进行分析处理。计量资料数据以x(_)±s表示，两组间均数比较采用成组t 检验，多组间均数比较采用方差分析，如有统计学差异，采用LDS检验进行两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

组织工程所需的种子细胞要求特异性较高，分化能力较强。但一般分化能力高的细胞其增殖能力较弱，而增殖能力强的细胞分化能力弱。脂肪干细胞同样面临上述作为种子细胞的缺点。因此，获得更具增殖能力和分化潜力的脂肪干细胞成为目标。越来越多的实验证明妊娠与干细胞活性明显关联。特别是雌激素水平对于间充质干细胞的临床应用可能起到关键作用^[9]。实验成功分离了妊娠大鼠来源的脂肪干细胞，并评估了正常大鼠和妊娠大鼠来源脂肪干细胞的细胞特性以及体外诱导成类肝细胞的分化情况。

首先通过CCK8法发现了妊娠大鼠来源脂肪干细胞的增殖活力更强，这一方面可能是因为妊娠期一些雌激素水平增高所致。已有的研究证明一些雌激素能够促进脂肪干细胞的增殖和/或黏附。例如Taskiran等^[10]也独立发现了其对脂肪干细胞增殖及成骨分化的促进作用；Hong等^[11]和罗新等^[12]的研究也分别发现17β-雌二醇能显著促进骨髓间充质干细胞的增殖；任立文等^[13]发现了雌激素能够促进骨髓间充质干细胞的增殖；此外，Jafarzadeh等^[14]发现催产素能够促进脂肪干细胞的增殖和类神经元分化，从侧面证实妊娠状态能够促进脂肪干细胞的增殖。尽管如此，这一观点也存在不一致的研究。吴振勇等^[15]研究证实孕酮不影响骨髓间充质干细胞的增殖。此外Veronesi等^[6]发现雌激素缺乏并不影响脂肪干细胞的增殖和成骨分化潜力。本研究结果显示妊娠大鼠来源脂肪干细胞增殖能力较正常大鼠来源脂肪干细胞更高，细胞生长更为迅速。除了上述方面，另一方面可能是因为妊娠大鼠来源脂肪干细胞能够提高抗凋亡作用。越来越多的研究展示了孕期与干细胞活性密切相关，例如，Strehlow等^[16]发现孕期过程中雌激素受体能够有效防止骨髓来源内皮祖细胞的凋亡。程姝丽等^[9]发现雌激素对小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的抑制作用。作者推测，这两个方面可能是妊娠大鼠来源脂肪干细胞较正常大鼠来源脂肪干细胞具有更佳的增殖和贴壁能力的原因。

随后，利用已发表文献中的成肝诱导培养基，成功诱导正常大鼠来源和妊娠大鼠来源脂肪干细胞分化为类肝细胞。进一步的研究显示，妊娠大鼠来源的脂肪干细胞诱导成类肝细胞的时间更短。在肝细胞标志因子ALB、CK-18、AFP和TAT的表达方面，妊娠大鼠来源脂肪干细胞诱导成的类肝细胞优于正常大鼠来源脂肪干细胞诱导成的类肝细胞。此外，妊娠大鼠来源脂肪干细胞诱导分化的类肝细胞具有更高的白蛋白分泌和尿素合成能力。

尽管目前妊娠状态对脂肪干细胞分化相关研究尚未报道，但是通过其他报道可以进行探索。Hong等^[17]和Luo等^[18]分别发现了雌激素17β-雌二醇能够促进脂肪干细胞的成脂分化。Cho等^[19]发现雌激素能够促进脂肪干细胞的成骨分化；此外，雌激素还能够促进脂肪干细胞的类神经分化^[20]。已有研究发现这些雌激素水平在妊娠状态下均会显著升高，因此，作者推测妊娠状态来源的脂肪干细胞能够更快分化成类肝细胞，与一些雌激素水平升高有一定的关联性，但具体机制还有待于进一步的研究。

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延伸阅读

脂肪干细胞具有多向分化潜力，但是对于内胚层分化，尤其是向肝细胞系的分化，仍然相对比较困难。Seo等第一次使用肝细胞生长因子、抑瘤素和二甲基亚砜采用一步法成功诱导脂肪干细胞分化为功能性类肝细胞。分化来的类肝细胞展示了低密度脂蛋白吞吐和尿素合成能力。随后，越来越多的研究工作成功利用化学物质或者细胞因子将脂肪干细胞定向诱导分化为功能性类肝细胞，并且在动物模型中证实移植脂肪干细胞对于肝损伤具有一定的改善作用。尽管一些经典的诱导方法虽然均能够成功诱导脂肪干细胞分化为类肝细胞，并展现了其肝细胞的功能特性，但是这些体外诱导方法几乎都要消耗近1个月的时间才能完成分化，这对于未来的临床应用具有巨大的局限性。Xu等最新的研究中在使用常规的诱导因子肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的基础上，通过引入CHIR99021、IDE1、FGF4因子成功地在第2-4天内将脂肪干细胞初步诱导分化成为功能性类肝细胞，并在第5-9天完善类肝细胞的成熟功能。这一工作为脂肪干细胞向类肝细胞的分化带来了新的希望。目前，很少研究关注自体状态改变对脂肪干细胞的影响。本研究结果暗示了妊娠期母体来源的干细胞可能处于动员状态，该时期的干细胞生物学活性高于非妊娠期的状态，未来的研究工作将开展与妊娠密切相关的荷尔蒙(雌激素、孕酮、雌二醇等)对脂肪干细胞成肝诱导分化的影响。

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